Đánh giá chất lượng ký thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm hema toxylin eosin ở một số cơ sở giải phẫu bệnh trên địa bàn hà nội

ĐẶT VẤN ĐỀ Cho tới chẩn đốn mơ bệnh học coi tiêu chuẩn vàng việc xác định bệnh Trong khoảng hai thập niên trở lại đây, với phát triển nhanh khoa học công nghệ lĩnh vực thăm dị chẩn đốn nội soi, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, nuôi cấy tế bào, bảo quản ghép mơ…đã tạo điều kiện cho sinh thiết chẩn đốn mơ bệnh học phát triển số lượng lẫn quy mơ Trong đó, ba chẩn đốn gồm siêu âm – nội soi – sinh thiết trở thành mũi nhọn quan trọng Sự phát triển ngày khẳng định vị lĩnh vực chẩn đốn mơ bệnh học, góp phần chẩn đốn sớm nhiều tổn thương hữu ích cho chẩn đốn điều trị phịng bệnh Một xét nghiệm mơ bệnh học thường tiến hành theo chuỗi kỹ thuật liên hoàn bao gồm: 1).Lấy bệnh phẩm, cắt lọc; 2).Cố định bệnh phẩm; 3).Gửi xét nghiệm; 4).Vùi bệnh phẩm; 5).Cắt mảnh dán; 6).Nhuộm; 7).Đọc kết Mỗi khâu có yêu cầu riêng liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến kết chẩn đốn mơ bệnh học Trong khâu kể khâu đầu cuối thực bác sĩ chuyên khoa, khâu lại thực kỹ thuật viên giải phẫu bệnh làm việc labo Tùy theo mục đích yêu cầu xét nghiệm mà việc xử lý kỹ thuật khâu có điểm khác có quy trình riêng Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) kỹ thuật phổ biến kỹ thuật mơ học mơ bệnh học, hầu hết chẩn đốn mơ bệnh học cần (hoặc) phải dựa vào kỹ thuật Vì gọi kỹ thuật thường quy cho loại xét nghiệm mô bệnh học labo giải phẫu bệnh Hiện nay, xét nghiệm mô bệnh học sở y tế trung ương trung bình có tới gần 50% trường hợp sai sót loại khâu kỹ thuật làm giảm chất lượng chẩn đốn, khoảng 10% xét nghiệm âm tính chẩn đốn sai lý kỹ thuật (3) Xuất phát từ tính thực tiễn kỹ thuật nhuộm HE nhằm đảm bảo chất lượng chẩn đốn mơ bệnh học, sinh viên tốt nghiệp, Cử nhân Kỹ thuật Y học tương lai nên qua khóa luận em mong muốn rằng: Thực thành thạo chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ bệnh phẩm tiêu nhuộm H - E Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu nhuộm H - E Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: Là phận quan trọng khoa học tổn thương, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể có mục đích phát nghiên cứu tính chất, đặc điểm tổn thương thuộc phạm vi tổ chức tế bào Ở chừng mực định, cho phép tìm hiểu nguyên nhân gây tổn thương ấy, góp phần giải thích chế sinh bệnh quy luật phát sinh phát triển tổn thương Trong bệnh học, loại xét nghiệm có tính xác cao độ tin cậy lớn kỹ thuật tiến hành quy tắc người đọc có kinh nghiệm định Đã từ lâu, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể trở thành người trợ thủ đắc lực cho nhà lâm sàng học thiếu nhà nghiên cứu y học Trên thực tế, đối tượng xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể phong phú, phạm vi áp dụng ngày mở rộng, nước Việt Nam, đặc biệt lĩnh vực phát bệnh Ngày nay, chuyên khoa lâm sàng phần lớn chuyên khoa cận lâm sàng có sử dụng kết xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể vào công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học phục vụ bệnh nhân 1.2 Tổng Quan Hematoxylin – Eosin Hematoxylin: phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất ete từ lõi Haematoxylon campechianum mọc vùng nhiệt đới Campeche Mexico Bản thân Hematoxylin khơng có đặc tính nhuộm, mà phải trải qua q trình oxy hóa để biến thành Hematein nhuộm được: tượng “Hematoxylin chín” Sự oxy hóa xảy để dung dịch nhuộm từ ngày đến tuần để mở ánh sáng mặt trời tác nhân gây oxy hóa như: iodat sodium, permanganat, potassium, oxytmereua Trong q trình chín Hematoxylin (C16H14O6) nguyên tử H để trở thành Hematein (C16H12O6) có xếp kiểu quinoit vịng đây: Hình 1.Công thức Hình 2.Công thức Hematoxylin Hematin Sự oxy hóa liên tục Hematein có hình thành hợp chất khơng màu, mà số người cho q trình oxy hóa chậm cách tự nhiên tốt oxy hóa chất hóa học Phản ứng chất hóa học gây nên oxy hóa Hematein tức khắc q trình oxy hóa tiếp tục nên hình thành hợp chất không màu, làm cho dung dịch nhuộm khơng lâu bền Hematein thân ưa tổ chức, nên phải dùng chất gắn màu thường aluminium thể alun (alun ammoniac, potassium hay sắt): chất sơn hình thành có tích điện dương mạnh giống phẩm nhuộm bazơ mạnh nên cố định acid nucleic, đặc biệt acid nucleic nhân Các khác đặc tính nhuộm phụ thuộc vào cách pha chế dung dịch Hematoxylin thành phần gắn màu Bảng nêu lên tính Hematoxylin tùy theo chất gắn màu: Thành phần Chất gắn màu (Kim loại)  Nhân  Aluminium, sắt, tungsten         Vỏ myelin Sợi chun Dây keo Sợi thần kinh đệm, sợi biểu mô Trục thần kinh Mucin Tơ huyết Mitochondri         Chromium, đồng, sắt Sắt, Iốt Molybden Tungsten Chì Aluminium Tungsten Sắt Eosin: Thuốc nhuộm hay dùng để nhuộm bào tương Eosin Nó có đặc tính dễ tan nước có màu huỳnh quang vàng - xanh nhạt [2], [3] Hình Cơng thức Eosin Với nguồn gốc đặc tính đặc biệt nên kỹ thuật nhuộm Hematoxylin tiến hành sau: 1.3 Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt dán mảnh, nhuộm tiêu H&E: 1.3.1 Kỹ thuật cố định Cố định làm bất động cấu trúc tổ chức tế bào tồn tới mức tối đa hình thái chúng Nói khác đi, cố định tổ chức giết chết thành phần tổ chức bảo quản chúng tình trạng gần với lúc sống Trừ số trường hợp cần nhuộm tươi hay cần nghiên cứu men, nuôi cấy tế bào nói chung, bệnh phẩm cần cố định sau lấy khỏi thể Nếu ta cố định bệnh phẩm khơng tốt làm giảm chất lượng xét nghiệm cố định hỏng khơng thể sửa chữa Bệnh phẩm sau lấy khỏi thể gây thoái hóa, hoại tử giả tạo nhận định, tế bào bị tiêu hủy men nội bào, hình thái chúng trở nên méo mó sinh hình ảnh giả tạo gây nhầm lẫn chuẩn đoán Mặt khác, việc cố định chậm gây tiêu hủy bào quan, khơng có lợi cho nghiên cứu men học đồng thời không đảm bảo cho việc gắn màu tốt nhuộm Một bệnh phẩm cố định tốt phải đảm bảo nguyên tắc sau: Mọi bệnh phẩm phải cố định sau lấy Không làm dập nát bệnh phẩm Bệnh phẩm không cắt dày Đủ lượng dung dịch cố định cần thiết Thời gian cố định dung dịch thích hợp Khơng để bệnh phẩm dính vào thành lọ Chú ý trường hợp cố định đặc biệt: - Glycogen: cố định dung dịch Grendre - Mỡ: cố định dung dịch formol 10%, cắt lạnh nhuộm Soudan Một số dung dịch cố định thông dụng:  Dung dịch formol đệm trung tính 10%: Formaldehyde 37% - 40% 100ml Nước cất .900ml Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) .4g Sodium phosphate dibasic anhydrous (NaH2PO4 khan) .6.5g  Dung dịch formol 10%: Formandehyde 37% - 40% 100ml Nước cất hai lần 900ml  Dung dịch cố định Bouin: Dung dịch nước bão hòa acid picic 75ml Formaldehyde 37% - 40% 20ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml  Dung dịch Grende: Cồn 95% bão hòa acid picric .80ml Formandehyde 37% - 40% 15ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml 1.3.2 Pha Không làm giập nát bệnh phẩm: pha khơng dùng kẹp có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng dài, cắt chiều không ray ray lại vị trí bệnh phẩm bệnh phẩm pha phải đặt miếng lie, gỗ plastic Các mẫu bệnh phẩm dùng kỹ thuật mô học thường cắt dày từ - mm Với bệnh phẩm mềm (não,…) cố định vài cho cứng sau pha lại Trong trường hợp chuyển đúc máy, bệnh phẩm không cắt dày chiều cao lịng khn nhựa 1.3.3 Vùi bệnh phẩm Cấu trúc tế bào mơ nhìn thấy kính hiển vi chúng cắt thành lát mỏng cỡ micromet ánh sáng qua Khi ta quan sát chi tiết tế bào, hình dạng hay cách xếp chúng Cố định giết chết tế bào giữ cho thành phần chúng bất động trạng thái tĩnh Nếu đem cắt thành lát cắt mỏng, mối liên quan tế bào cấu trúc mô bị biến đổi, chí bị đảo lộn tác động học Muốn người ta phải tạo khuôn cho bệnh phẩm, nghĩa phải làm cho chất ngấm sâu vào tế bào mô mà cắt không làm biến dạng cấu trúc chúng Có nhiều chất dùng cho phương pháp chất hay dùng parafin Hiện có nhiều loại parafin với điểm nóng chảy khác loại thích hợp dùng kỹ thuật mơ học parafin có nhiệt độ nóng chảy từ 56 - 58oC Nếu dùng nhiệt độ nóng chảy parafin cao bắt buộc người ta phải chỉnh nhiệt độ tủ parafin lên nữa, hậu làm cho bệnh phẩm chín, khó cắt bắt mầu tồi Ngồi ra, parafin cịn pha thêm số chất phụ gia để làm tăng chất lượng như: histoplas, paraplas… Song parafin khơng tan nước (bệnh phẩm lại có nhiều nước) cồn nên bệnh phẩm phải khử nước cồn có nồng độ thấp (80 o) đến cao (cồn tuyệt đối) khử cồn xylen Tuy nhiên, với máy chuyển bệnh phẩm vừa lắc, vừa ly tâm việc loại hết nước, cồn xylen bệnh phẩm thường đạt kết tốt bệnh phẩm chuyển qua từ - lần parafin Việc tẩm parafin cho bệnh phẩm cịn đặt bình hút chân khơng (có máy chuyển) làm cho parafin ngấm vào bệnh phẩm nhanh tốt Do sở giải phẫu bệnh chưa có đủ máy chuyển nên chúng tơi giới thiệu hai quy trình vùi bệnh phẩm tay máy chuyển: 1.3.4 Quy trình chuyển tay:  Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày mm Cồn 90o - 15 phút Cồn 95o - 15 phút Cồn 100o I - 15 phút Cồn 100o II - 15 phút Cồn 100o III - 15 phút Xylen I - 15 phút Xylen II - 30 phút Xylen III - 30 phút Parafin I - 30 phút Parafin II - Parafin III -  Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày từ mm đến mm Cồn 80o - Cồn 90o - Cồn 95o - Cồn 100o I - Cồn 100o II - Cồn 100o III - Xylen I - Xylen II - Xylen III - 10 Parafin I - Parafin II - Parafin III - 10 1.3.5 Quy trình chuyển máy:  Áp dụng cho mảnh sinh thiết mảnh mô nhỏ Thời gian cố định tối thiểu 1) Rửa nhẹ nước chảy 2) Cồn 80o - 10 phút 3) Cồn 95o x lần x 15 - 20 phút 4) Cồn 100o x lần x 15 phút/ lần 5) Cồn 100o/ xylen tỉ lệ 1:1 - 15 phút 6) Xylen x lần x 15 phút/ lần 7) Parafin x lần x 15 lần/ phút 8) Parafin hút chân không từ 15 - 20 phút Nếu khơng có hút chân khơng (7) tăng thêm lần phút 9) Đúc bloc  Áp dụng cho mô thông thường 1) Cồn 80o - 2) Cồn 95o x lần x giờ/ lần 3) Cồn 100o x lần x giờ/ lần 4) Xylen x lần x giờ/ lần 5) Parafin x lần x giờ/ lần 6) Parafin hút chân không 7) Đúc bloc 1.3.6 Đúc bloc Bệnh phẩm sau qua q trình đúc bloc đạt u cầu giữ vô thời hạn Muốn đúc bloc phải làm cho parafin xung quanh bên bệnh phẩm đặc lại cách Để đạt điều này, người ta dùng khuôn kim loại để trao đổi nhiệt diễn nhanh chóng nước lạnh có đá Đúc bệnh phẩm phải thao tác cho nhiệt độ parafin 10 Hình 3.2.15.Tiêu nhuộm H – E X 40; tiêu bị bong, gấp Hình 3.2.16.Tiêu nhuộm H – E X 40; tiêu bị xước, rách, gấp, bong 27 Ch¬ng Bµn luËn 1.1 Sự liên quan mật thiết chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc đến cắt mảnh nhuộm HE để tiêu mô bệnh học 1.1.1 Lấy bệnh phẩm Các bệnh phẩm làm xét nghiệm mô bệnh học bao gồm nhiều loại, từ bệnh phẩm lớn bệnh phẩm sau mổ, bệnh phẩm tử thiết, bệnh phẩm sinh thiết phẫu thuật hay tiểu phẫu đến bệnh phẩm nhỏ sinh thiết kim sinh thiết, sinh thiết bấm qua nội soi…Các bệnh phẩm lớn thường pha bác sĩ giải phẫu bệnh học, số lại lấy bác sĩ thuộc nhiều chuyên khoa tiêu hóa (sinh thiết dày, đại trực tràng, sinh thiết gan…); hô hấp (sinh thiết phổi chọc kim xuyên thành ngực); sản – phụ (chất nạo tử cung)… Hai yêu cầu việc lấy bệnh phẩm lấy trúng lấy đủ thật không đơn giản + Lấy trúng lấy trúng vùng tổn thương Điều có nghĩa trước tiên phải xác định rõ vùng tổn thương vùng có biến đổi khác thường so với vùng lành + Lấy đủ lấy bệnh phẩm cho đủ sở (hay tiêu chuẩn) để chẩn đốn mơ bệnh học So với việc lấy trúng yêu cầu địi hỏi người lấy bệnh phẩm phải có hiểu biết rõ mô bệnh học Cùng loại bệnh vùng mô, giai đoạn bệnh có hình ảnh khác mơ bệnh học Hơn nữa, u ác tính có biểu rõ lâm sàng lại sinh thiết vào hoại tử mơ bệnh học kết luận 28 + Từ hai yêu cầu việc lấy bệnh phẩm lấy trúng lấy đủ, người ta quy định rõ cho loại bệnh phẩm phải lấy vùng nào, tối thiểu mảnh Nếu lấy bệnh phẩm khơng đạt u cầu khâu cịn lại xét nghiệm mơ bệnh học trở nên vơ ích, lãng phí sai sót khâu lấy bệnh phẩm đơi sai sót khơng thể sửa chữa 1.1.2 Cố định bênh phẩm: Formol 10% dung dịch cố định sử dụng rộng rãi phổ biến nhất, dùng cho lại xét nghiệm mô bệnh học thơng thường chúng có đặc điểm sau: + Là chất khử oxy + Không kết tủa Protein, cố định hoàn toàn gel gelatin cách làm cho chúng khơng hịa tan + Cố định lipid phức tạp, có ty lạp thể Golgi + Không tác dụng trực tiếp lên Glucid bảo quản chúng không làm tan thành phần cấu tạo có Protid tế bào + Là chất cố định có vận tốc xun thấm nhanh + Khơng làm co (nhưng làm co mạnh chuẩn bị vùi nến) làm cứng mạnh + Cấu trúc tế bào bảo quản tốt + Làm tăng kiềm tính cấu trúc nhuộm qua mảnh cắt vùi nến 1.1.3 Chuyển đúc bệnh phẩm: + Máy chuyển bệnh phẩm tự động cài đặt chạy theo chương trình, từ cố định, tẩy nước cồn tẩy cồn xylen cuối thay xylen parafin Ở trạm, máy tự động đảo chỗ trước chuyển sang trạm sau ly tâm để loại bớt hóa chất Do tránh tượng bệnh phẩm bị “sống” 29 + Máy đúc nến hoạt động theo nguyên tắc giữ nhiệt độ khuôn đúc, bệnh phẩm parafin nóng chảy suốt q trình đúc bệnh phẩm (500C – 600C) Khi chuyển khuôn đúc sang modun làm lạnh việc đúc nến hoàn tất Sử dụng máy tránh sai sót hay gặp cách đúc nến thông thường liên kết đồng bệnh phẩm parafin đồng thời thuận lợi cho việc đặt bệnh phẩm khuôn đúc, đặc biệt bệnh phẩm nhỏ Mặt khác, việc sử dụng caseette thay cho khuôn đúc kim loại dễ thao tác, bảo quản mà giúp cho việc cắt mảnh thuận lợi, đặc biệt việc cắt “phá” tạo mặt cắt mảnh – mộ 1.1.4 Cắt mảnh dán bệnh phẩm: Trong trình để làm tiêu mơ bệnh học khâu quan trọng khó, địi hỏi người kỹ thuật viên khơng phải nắm vững, làm quy trình thao tác máy, hiểu rõ nguyên lý hoạt động máy mà phải rèn cho tính cẩn thận, kiên trì nhẫn nại có mảnh cắt đẹp, yêu cầu kỹ thuật Trong nhiều trường hợp, thao tác làm theo quy trình u cầu kỹ thuật khơng có mảnh cắt đạt yêu cầu làm giai đoạn Loại trừ sai sót kỹ thuật khâu khác cố định, chuyển đúc…thì lý thao tác vận hành máy Các máy cắt mảnh sử dụng vô lăng tạo đà để đưa khối nến chuyển động theo chiều thẳng đứng từ xuống chu kỳ quay lại tịnh tiến “bước” tương đương với mức dày – mỏng đặt trước thay đổi Theo thiết kế, hầu hết máy cắt có độ xác cao, chống rung phần cải tiến chủ yếu tăng độ linh động cho hệ điều chỉnh dao cắt, bệ gá dao, hệ thống điều chỉnh ba chiều cho độ nghiêng dao, mâm cố định khối nến…Như đặt mức cắt mỏng cần vận hành tay quay thiếu đồng (nhanh chậm thiếu dứt khoát) 30 tạo mảnh cắt dầy không Mặt khác, độ nghiêng lưỡi dao ảnh hưởng nhiều đến kết cắt mảnh độ nghiêng lại không định mà thay đổi tùy theo loại mô cắt “mềm hay cứng” Do vậy, việc vận hành máy cắt đòi hỏi tính kinh nghiệm cao Qua lần cắt phải rút kinh nghiệm tìm cách khắc phục Sự tiến giai đoạn (từ giai đoạn đến giai đoạn 3) nghiên cứu chúng tơi phần minh chứng cho điều Dán mảnh cắt lên tiêu bản, đơn giản khâu quan trọng Dung dịch dán tiêu thường dùng dung dịch Albumin Nếu để tiêu bàn hơ lâu, nóng, thiếu đồng tãi mảnh cắt chất lượng dung dịch dán không tốt (không lọc kỹ bảo quản không tốt)… ảnh hưởng nhiều đến chất lượng tiêu Dán mảnh không đạt yêu cầu kỹ thuật dẫn tới bong mảnh cắt tạo tổn thương giả, làm bẩn tiêu vv 1.1.5 Nhuộm tiêu Trong ba giai đoạn cắt mảnh tiến hành mức cắt giống độ dày mỏng mảnh cắt khác Với quy trình nhuộm nhau, tiêu dày thường đậm Hematoxylin (ở nhân) Eosin (bào tương) Có lẽ mảnh cắt dày yếu tố gắn màu gắn vào mô mảnh cắt nhiều “chồng chéo” lên chúng có màu đậm khơng thể có tương phản nhân bào tương Mặt khác, bắt màu khác mô khác tổn thương khác Mô ung thư thường cho màu nhân đậm mơ khác 4.2 Một số yếu tố Kỹ thuật vi thể liên quan ảnh hưởng đến tiêu nhuộm Hematoxylin Eosin - Cố định bệnh phẩm không tốt làm giảm hẳn chất lượng xét nghiệm cố định hỏng sửa chữa 31 - Lỗi cố định bệnh phẩm hay xảy trường hợp Labo xét nghiệm giải phẫu bệnh không trực tiếp thực Chủ yếu phát hóa chất cho khoa/phịng - Đúc bloc: lỗi xảy như: nhiệt độ parafin khơng đảm bảo (Thay bếp điện đun parafin thay trường hợp khơng có máy đúc) làm parafin cứng gây ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc mơ khó khăn lớn trình cắt dán mảnh gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng tiêu - Q trình đúc gây lỗi bệnh phẩm không mặt phẳng, nằm sâu bloc…sẽ gây cắt thiếu mơ, mơ - Một số tiêu có mảnh cắt dày, phẩm nhuộm bắt màu đậm khơng có tương phản rõ nhân bào tương Kết lại lần khẳng định kỹ thuật cắt mảnh ảnh hưởng nhiều đến trình nhuộm - Mảnh cắt hay bị xước gây ảnh hưởng nhiều, điều hay xảy vấn đề dao cắt kỹ thuật cắt - Dán mảnh: số tiêu số sở tỷ lệ pha albumin cao, nhiều tẩy không hết, gây bắt màu làm xấu tiêu nhuộm Dung dịch dán mảnh thao tác dán mảnh nguyên nhân gây bong mảnh cắt tạo tổn thương giả - Một số yếu tố làm bẩn tiêu như: vi khuẩn, nấm (do dung dịch dán mảnh bảo quản không tốt, khơng ngâm lam kính) - Hơ q lâu bàn hơ số sở bàn hơ nóng gây giãn cấu trúc mơ - Sự gấp nếp mảnh cắt (mảnh cắt bị nhăn nhúm) bị rách thao tác tãi mảnh cắt bàn hơ không đạt yêu cầu (Viện Quân đội trung ương 108 tãi thiết bị chuyên dụng đựng dung dịch dán: nhanh & hiệu so với tãi trực tiếp lam kính) 32 - Q trình nhuộm tiêu bước có vai trị định lớn đến chất lượng tiêu bản, việc cắt bớt số khâu quy trình nhuộm gây ảnh hưởng nhiều Một số sở bỏ qua bước tẩy nước cuối dùng máy sấy để sấy khô làm cho tiêu bị ám Tóm lại: Để có tiêu mô bệnh học chuỗi khâu kỹ thuật liên hồn mà khâu có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng tới chất lượng tiêu Trong khâu đó, bên cạnh việc tiến hành theo quy trình kỹ thuật yếu tố người đóng vai trị quan trọng định đến việc tạo tiêu đẹp, hạn chế tối đa sai sót chủ quan chẩn đốn mơ bệnh học 33 KÕt luËn Đối với em- sinh viên chuyên ngành Kỹ thuật Y học trường nắm vững lý thuyết quy trình kỹ thuật - để thực thành thạo chuỗi kỹ thuật chuyển, cắt, nhuộm từ bệnh phẩm tiêu nhuộm H – E em nhận thấy kỹ thuật khó cắt mảnh Và để thực kỹ thuật vi thể nhuộm H – E đạt yêu cầu kỹ thuật thời gian tối thiểu phải làm việc liên tục labo ba tháng, hướng dẫn anh chị kỹ thuật viên có kinh nghiệm Một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật làm tiêu nhuộm H – E: - Sự thành thạo thao tác, đặc biệt máy cắt mảnh để làm việc này, yếu tố “con người” quan trọng - Cố định bệnh phẩm không tốt làm giảm hẳn chất lượng xét nghiệm cố định hỏng sửa chữa - Lỗi cố định bệnh phẩm hay xảy với Labo xét nghiệm phát hóa chất cho khoa/phịng, khoa/phịng khơng ý coi nhẹ vai trò việc cố định dùng thay nước muối sinh lý, nước cất gây hoại tử bệnh phẩm - Đúc bloc: lỗi xảy như: nhiệt độ parafin không đảm bảo (Thay bếp điện đun parafin thay trường hợp khơng có máy đúc) làm parafin cứng gây ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc mơ khó khăn lớn trình cắt dán mảnh gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng tiêu - Q trình đúc gây lỗi bệnh phẩm khơng mặt phẳng, nằm sâu bloc…sẽ gây cắt thiếu mơ, mơ 34 - Một số tiêu có mảnh cắt dày, phẩm nhuộm bắt màu đậm khơng có tương phản rõ nhân bào tương Kết lại lần khẳng định kỹ thuật cắt mảnh ảnh hưởng nhiều đến trình nhuộm - Mảnh cắt hay bị xước gây ảnh hưởng nhiều, điều hay xảy vấn đề dao cắt kỹ thuật cắt - Dán mảnh: số tiêu số sở tỷ lệ pha Albumin cao, nhiều tẩy không hết, gây bắt màu làm xấu tiêu nhuộm Dung dịch dán mảnh thao tác dán mảnh nguyên nhân gây bong mảnh cắt tạo tổn thương giả - Dán mảnh cắt không đạt yêu cầu kỹ thuật dẫn đến bong mảnh cắt, làm mảnh cắt nhăn nhúm, rách tạo tổn thương giả, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng tiêu - Một số yếu tố làm bẩn tiêu như: vi khuẩn, nấm (do dung dịch dán mảnh bảo quản không tốt, khơng ngâm lam kính) - Hơ q lâu bàn hơ số sở bàn hơ nóng gây giãn cấu trúc mơ - Sự gấp nếp mảnh cắt (mảnh cắt bị nhăn nhúm) bị rách thao tác tãi mảnh cắt bàn hơ không đạt yêu cầu (Viện Quân đội trung ương 108 tãi thiết bị chuyên dụng đựng dung dịch dán: nhanh & hiệu so với tãi trực tiếp lam kính) - Q trình nhuộm tiêu bước có vai trị định lớn đến chất lượng tiêu bản, việc cắt bớt số khâu quy trình nhuộm gây ảnh hưởng nhiều Một số sở bỏ qua bước tẩy nước cuối dùng máy sấy để sấy khô làm cho tiêu bị ám nước 35 KIẾN NGHỊ Khi tiến hành thc hin k thut vi th cần phải thường xuyên ý kiểm tra chất lượng hóa chất sinh phẩm, trang thiết bị tốt, thao tác kỹ thuật ỳng để chất lợng chẩn đoán Giải phẫu bệnh ngày nâng cao Đề nghị cần nghiên cứu thêm ảnh hởng khác v nghiờn cu sõu hn v cỏc yu t nh hng đến kết chẩn đoán mô bệnh học Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu Các số liệu, kết đề tài trung thực cha đợc công bố công trình nghiên cứu Nếu có sai sót xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng 06 năm 2011 Tác giả khóa luận Nguyễn Văn Minh Tài liệu tham khảo Tiếng việt Trờng Đại học Y khoa, Bộ môn Giải phẫu bệnh(1976): Kỹ thuật hiển vi thông thờng Nhà xuất Y học Hà Nội, Trờng Đại học Y Hà Nôi , Bộ môn Giải phẫu bệnh (2004): Tài liệu tập huấn dành cho cán gi¶i phÉu bƯnh, Lê Hồng Anh (2009): Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng dung dịch cố định tới chất lượng nhuộm H – E PAS Nguyễn Đức Thái (2008): Kỹ thuật chuyển đúc cắt nhuộm yếu tố ảnh hởng, V Th Thu Hảo (2005): Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin chẩn đốn Mơ bệnh học Nguyễn Thị Hải (2007): Kỹ thuật số yếu tố ảnh hưởng tới kết nhuộm ba màu Masson mảnh cắt English Enda B.Prophet, Bob Mills, Jacquelyn B.Arrington, Leslie H.Sobin, Histotechnology M.D: Laboratory Methods in LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiê ̣u, Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nô ̣i Bô ̣ môn Giải phẫu bê ̣nh - Trường Đại học Y Hà Nô ̣i đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiê ̣n để em được học tâ ̣p, rèn luyê ̣n và tu dưỡng tại trường Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tâ ̣n tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốt khóa luâ ̣n này Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị Bô ̣ môn Giải phẫu bê ̣nh - Trường Đại học Y Hà Nô ̣i đã nhiê ̣t tình giúp đỡ em suốt quá trình học tâ ̣p và nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị Labo xét nghiệm Giải Phẫu Bệnh Các bệnh viện: Viện K2; Viện Lao Phổi Trung Ương; Viện Quân Đội Trung Ương 108 đã nhiê ̣t tình giúp đỡ em śt quá trình tìm hiểu nghiên cứu để thực khóa luận Ći cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân gia đình đã tạo mọi điều kiê ̣n về tinh thần và vâ ̣t chất cho Cảm ơn những người bạn đã ủng hô ̣ và đô ̣ng viên quá trình học tâ ̣p và thực hiê ̣n khóa luận Hà Nô ̣i, ngày tháng 06 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Văn Minh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đại cương xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: 1.2 Vai trò kỹ thuật chẩn đoán tế bào học 1.3 Tổng Quan Hematoxylin – Eosin 1.4 Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt dán mảnh, nhuộm tiêu H&E: 1.4.1 Kỹ thuật cố định 1.4.2 Pha 1.4.3 Vùi bệnh phẩm 1.4.4 Quy trình chuyển tay: 10 1.4.5 Quy trình chuyển máy: 11 1.5 Đúc bloc 12 1.6 Kỹ thuật cắt dán mảnh .12 1.7 Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) 13 1.7.1 Thuốc nhuộm: .13 1.7.2 Nguyên tắc: 14 1.7.3 Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant).14 1.7.4 Kết quả: 15 Chơng 2: đối tợng phơng pháp nghiên cứu 16 2.1 i tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Mẫu xét nghiệm: tiêu nhuộm H - E .16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1.Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang có phân tích kết hợp hồi cứu 16 2.2.2 Nơi thực đề tài 16 2.2.3 Phương tiện nghiên cứu: 17 2.2.4 Quy trình nghiên cứu 17 2.2.5 Nhận định kết 17 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Bảng kết 18 3.2 Đánh giá kết quảvà số hình ảnh minh họa .19 3.2.1 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương: 19 3.2.2 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2 .21 3.2.3 Labo Giải phẫu bệnh Trường Đại Học Y Hà Nội: .23 3.2.4 Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108: 25 Ch¬ng 4: Bµn luËn 28 4.1 Sự liên quan mật thiết chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc đến cắt mảnh nhuộm HE để tiêu mô bệnh học .28 4.1.1 Lấy bệnh phẩm .28 4.1.2 Cố định bênh phẩm: .29 4.1.3 Chuyển đúc bệnh phẩm: 29 4.1.4 Cắt mảnh dán bệnh phẩm: .30 4.1.5 Nhuộm tiêu 31 4.2 Một số yếu tố Kỹ thuật vi thể liên quan ảnh hưởng đến tiêu nhuộm Hematoxylin Eosin .31 KÕt luËn 34 ... nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh vi? ??n Lao phổi Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh vi? ??n K2 Tỷ lệ % Labo Giải phẫu bệnh Bộ môn Giải phẫu bệnh Tỷ lệ % Labo Xét nghiệm Giải phẫu 212 Trung Ương Tỷ lệ % Bệnh. .. liên hoàn từ bệnh phẩm tiêu nhuộm H - E Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu nhuộm H - E Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: Là phận... Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội 15  Labo Giải phẫu bệnh Bệnh vi? ??n K2, Làng Tựu, xã Tam Hiệp, Thanh trì, Hà Nội  Labo Giải phẫu bệnh Bệnh vi? ??n 108, Số Trần Hưng Đạo, Hai Bà Trưng, Hà Nội 1.2.3 Phương