LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến với thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy và các thầy cô trong phòng hợp chất thiên nhiên Những người thầy, người cô đầy tâm huyết, đ[.]
LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến với thầy Bùi Xuân Hào thầy Dương Thúc Huy thầy cô phòng hợp chất thiên nhiên Những người thầy, người cô đầy tâm huyết, thổi vào tâm hồn em niềm đam mê nghiên cứu khoa học truyền dạy lại cho em kinh nghiệm quý báu Những bước đầu cịn gặp nhiều khó khăn, kiến thức cịn chưa vững dẫn tận tình thầy cơ, em hồn thành tốt cơng việc Bên cạnh đó, phải kể đến giúp đỡ nhiệt tình bạn sinh viên nghiên cứu K38 K39 suốt thời gian qua Và cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ tinh thần giúp em hồn thành tốt khóa luận i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC v LỜI MỞ ĐẦU vi CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC - ASTERACEAE 1.2 CÁC CHI TRONG HỌ CÚC – ASTERACEAE 1.3 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE 1.3.1 Mô tả thực vật cỏ the .3 1.3.2 Công dụng cỏ the .3 1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ .9 2.1.1 Hóa chất 2.1.2 Thiết bị 2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 10 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 10 2.2.2 Điều chế loại cao 10 2.2.3 Cô lập chất cao Ethyl acetate 12 2.2.4 Khảo sát phân đoạn A1 .13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A 14 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1B 16 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO .19 PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tiếng Anh Tiếng Việt Proton (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance proton (1) Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance carbon (13) Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Coherence nhiều liên kết s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi dd Double of doublet Mũi đôi đôi ddd Double of doublet of doublet Mũi đôi đôi đôi δ Chemical shift Độ chuyển dịch hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin ppm Par per million Một phần triệu UV Ultra Violet Tia cực tím AcOH Acetic acid Axit axetic EA Ethyl Acetate Etyl acetat C Chloroform Cloroform H n-Hexane Hexan Me Methanol Metanol Bu Buthanol Butanol W Water Nước chữ viết tắt H-NMR 13 C-NMR HMBC SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây cỏ the .3 Hình 1.2 Hoa cỏ the Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A 15 Hình 3.2 Tương quan HMBC hợp chất 1A 15 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất 1B 17 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế loại cao 10 Sơ đồ 2.2 Quy trình sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate 12 Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel cao phân đoạn A1 .13 BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Khối lượng loại cao hiệu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu Bảng 2.2 Kết sắc ký cột cao ethyl acetate (36,5 g) cỏ the .11 Bảng 3.1 So sánh phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 1A 3methoxyquercetin 15 Bảng 3.2 So sánh phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 1B quercetin 17 iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất 1A………… Phổ 13C-NMR hợp chất 1A Phổ HMBC hợp chất 1A Khối phổ phân giải cao hợp chất 1B Phổ 1H-NMR hợp chất 1B Phổ 13C-NMR hợp chất 1B …………… v LỜI MỞ ĐẦU Thiên nhiên ln huyền bí diệu kì, khơng nơi sinh sống người mà nguồn thực phẩm, kho tàng thuốc vơ q giá Vì vậy, từ ngàn xưa, người biết dùng cỏ để làm thuốc chữa bệnh, ban đầu loại thuốc đơn giản chữa trị da, mẫn ngứa, hay dùng để băng bó vết thương phát triển lên thành phương thuốc quý giá chữa bệnh nan y Cùng với phát triển khoa học, người chiết suất nhiều hợp chất hóa học dùng để chữa trị nhiều bệnh hiểm nghèo, hợp chất taxol cô lập từ thông đỏ, hợp chất vinblastin từ dừa cạn, dùng điều trị ung thư vú phụ nữ Từ ngành hóa học hợp chất thiên nhiên đời phát triển mạnh mẽ, kết hợp với y dược sinh học ngày cho đời nhiều hợp chất có giá trị cao, nâng cao giá trị thực vật sống người Trong y học cổ truyền Việt Nam, có nhiều loại cỏ sử dụng làm thuốc như: chùm ruột, cỏ sữa, cành giao, me rừng…trong có cỏ the hay cịn gọi cóc mẳn sử dụng rộng rãi với nhiều công dụng như: điều trị viêm mũi dị ứng, viêm xoang, viêm họng, ung thư biểu mô Những năm gần giới có nhiều nghiên cứu sinh học y dược cỏ the lập số hợp chất có khung sườn sesquiterpen lacton có khả kháng khuẩn, kháng ung thư…Dựa tiền đề nghiên cứu có, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao Ethyl acetat cỏ the với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu hợp chất tự nhiên, tìm hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị dược thảo Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC – ASTERACEAE [2] Họ Cúc (Asteraceae) gọi họ Hướng dương hay họ Cúc tây, họ thực vật có hai mầm Họ Cúc họ lớn ngành thực vật có hoa, với khoảng 25.000 loài, gồm phân họ: - Phân họ hoa ống (Tubuliforae hay Asteroideae): cụm hoa có hoa hình ống, hoa hình ống giữa, hoa hình lưỡi nhỏ xung quanh đầu - Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguiiflorae hay Cichorioideae): tất hoa cụm hoa đầu hoa lưỡi nhỏ, khơng có hoa ống Cây có nhựa mủ Họ Cúc phân bố rộng khắp giới, phổ biến khu vực ôn đới miền núi nhiệt đới Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, 350 loài, chủ yếu cỏ dại, số trồng làm cảnh (các loại hoa cúc), rau ăn (ngải cứu, cải cúc, rau diếp), gia vị (cúc tần)… Họ Cúc họ có số lồi dùng làm thuốc lớn giới thực vật Có khoảng 51 lồi họ Cúc dùng làm thuốc, có 18 lồi dùng cơng nghiệp dược lồi: atisơ, bạch truật, cỏ nhọ nồi, cỏ ngọt, cúc hoa, cúc tần, hồng hoa, hy thiêm, ké đầu ngựa, khoản đông hoa, mần tưới, mộc hương, ngải cứu, ngưu bàng, sài đất, thương truật, hao hoa vàng, tử uyển • Một số đặc điểm thực vật họ Cúc: Thân cỏ hay bụi, sống năm hay nhiều năm, dây leo hay gỗ Rễ phù lên thành củ, chất dự trữ tinh bột mà inulin (ví dụ thược dược) Lá có hình dạng biến thiên, khơng có kèm, thường mọc đối tụ thành hình hoa gốc, có loại có gai Thơng thường phiến ngun, xẻ sâu, hình dạng kép hình lơng chim Cụm hoa: đầu, mang nhiều hoa hay hoa Đầu đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, thông thường tụ thành ngù Hoa: lưỡng tính, mẫu năm, bầu dưới, khơng có bắc Các hoa đầu giống nhau, có cách cấu tạo, chức Bao hoa: đài thường giảm nhiệm vụ bảo vệ đảm nhiệm bắc tổng bao Đài biến mất, đơi cịn gờ nhỏ, ngun hay có thùy, gờ mang vẩy vịng lơng tơ Sau thụ tinh, đài phát triển thành mào lơng, láng hay có gai, có nhiệm vụ phát tán Bộ nhị: năm nhị nhau, đính ống tràng xen kẽ với cánh hoa Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính thành ống bao quanh vịi Bộ nhụy: hai nỗn vị trí trước sau, tạo thành bầu ơ, đựng nỗn, đính đáy Đĩa mật bầu Ở hoa lưỡng tính hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật chia thành hai nhánh đầu nhụy Các nhánh đầu nhụy mang mặt lông để quét hạt phấn vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bao phấn Sự thụ phấn nhờ côn trùng Quả bế, thường mang mào lơng đài biến đổi, có mào lông mang cuống dài hay ngắn Đơi trần có móc hay có gai Hạt khơng có nội nhũ, mầm to, nhiều chứa đầy dầu 1.2 CÁC CHI TRONG HỌ CÚC Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, có số chi tiêu biểu, thường gặp chi Gerbera, chi Helianthus L, chi Cynara Cây cỏ the loài thuộc chi Centipeda 1.3 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE[3] Cây cỏ the thuộc họ Cúc, chi Centipeda Tên khoa học: Centipeda minima (L) Tên thông thường: nga bất thực thảo, địa hồ tiêu, cầu tử thảo, cóc mẳn, cúc mẩn, thạch hồ tuy.[3] 1.3.1 Mơ tả thực vật cỏ the Cỏ the loại cỏ mềm, mọc bò lan mặt đất ẩm, thân nhiều cành, có lơng mịn trắng, tồn thân trơng nhẵn bóng Lá đơn, mọc so le, hình ba cạnh, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép có một, hai ba cưa Lá dài khoảng 10-18 mm, rộng khoảng 6-10 mm, gân mặt lá, gân phụ không rõ, cuống Cụm hoa hình đầu mọc nách lá, hoa gồm nhiều lớp, cánh hoa hình ống màu trắng, có cưa Tràng hoa hình chng, có bốn răng, hình trứng rộng, màu tím Quả bế bốn cạnh, cạnh có lơng mịn nhỏ Mùa hoa khoảng tháng - 5, mùa khoảng tháng - Để dùng làm thuốc, thường hái toàn cây, gồm rễ, dùng tươi hay phơi sấy khô Cây mọc hoang khắp nơi vùng đồng ruộng ẩm thấp, ruộng bỏ hoang, bờ rãnh, ven đường… Hình 1.1 Cây cỏ the Hình 1.2 Hoa cỏ the 1.3.2 Cơng dụng cỏ the Cây cỏ the có vị cay, mùi hắc, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng, tiêu viêm, tiêu sưng, giải độc Cỏ the dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, mắt đau đỏ sưng, chảy nước dãi, đau màng mộng mắt, viêm mũi dị ứng, hay dùng để chữa bệnh mẫn ngứa (eczema), trị rắn cắn, đắp bó gãy xương.[2] Phần thân, hoa cỏ the sử dụng phổ biến thuốc dân gian Ví dụ thuốc dân gian Trung Quốc, cỏ the dùng để chữa bệnh đau đầu, cảm lạnh, viêm kết mạc bệnh sốt rét Ở Đài Loan, cỏ the nấu lấy nước để tắm cho trẻ em bị bệnh ghẻ lở, hay uống để trị bệnh hệ tiêu hóa.[9] • Một số thuốc dân gian sử dụng cỏ the: Chữa mẩn ngứa (eczema): cỏ the hai phần, đậu xanh phần, muối vài hạt Cả ba thứ giã nhỏ đắp lên nơi bị mẩn ngứa rửa Chữa ho: cỏ the khô 20 g tươi 30 g, nước 500 ml sắc 100 ml chia ba lần uống ngày Chữa viêm mũi, nghẹt mũi: dùng cỏ the, hoa mộc lan (mỗi vị g), ké đầu ngựa (10 g), sắc lấy nước uống Nếu dùng ngoài, nghiền cỏ the, tế tân bạch đặt lần vào mũi 1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE Năm 1989, Dipti Gupta J Singh công bố bốn triterpenoid saponin từ cỏ the acid lα,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (1), acid lβ,2α,3β,19α,23-pentahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (2), 3α,2lα,22α,28-tetrahydroxyolean-l2-en-28-O-β-d-xylopyranosid (3), 3α,l6α,2lα,22α,28-pentahydroxyolean-l2-en-3-O-β-d-xylopyranosyl-28-O-β-dxylopyranosid (4).[4] Năm 1990, Dipti Gupta Singh J nghiên cứu tìm số chất cỏ the, gồm: tetratriacontanyl nonadecanoat (5), sitosterol (6), 3,3′,5,5′tetramethoxy stilben (7), 2-isopropyl-5-methylhydroquinon-4-O-β-d-xylopyranosid (8), acid 2α,3β,23,19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (9), 3α,21β,22α,28-tetrahydroxyolean-12-en-28-O-β-d-xylopyranosid (10), 3β,16α,2lβ,22α,28-pentahydroxyolean-12-en-28-O-β-d-xylopyranosid (11).[5] Năm 1998, Taylor Towers lập ba sesquiterpen lacton có hoạt tính kháng khuẩn 6-O-methylacrylylplenolin (12), 6-O-isobutyroylplenolin (13), 6-O-angeloylplenolin (14).[6] Năm 2007, Liang cộng cô lập được sesquiterpen lacton 4,5 β-dihydroxy-2β-(isobutyryloxy)-10β H-guai-11(13)-en-12,8β-olid (15), 4- hydroxy-1βH-guaia-9,11(13)-dien-12,8α-olid (16), 2β-(isobutyryloxy)florilenalin (17), pulchellin-2α-O-tiglat (18), florilenalin-2α-O-tiglat (19).[4] 2.2.4 Khảo sát phân đoạn A1 Thực sắc ký cột phân đoạn A1 (8,60 g) silica gel pha thường, hệ dung môi giải ly chloroform-methanol, với độ phân cực tăng dần, dựa kết sắc ký mỏng, gộp năm phân đoạn kí hiệu: CT-I, CT-II, CT-III, CT-IV CT-V Phân đoạn CT-IV (1,38 g) chạy sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung mơi chloroform-methanol có độ phân cực tăng dần (sơ đồ 2.3) thu phân đoạn phụ Dựa kết sắc ký lớp mỏng, phân đoạn CT-IV chọn để tách chất Thực sắc ký cột nhiều lần phân đoạn CT-IV (1,38 g) với hệ dung mơi giải ly thích hợp, kết hợp với sắc ký lớp mỏng pha đảo điều chế (MeOH-H O 1:1), cô lập hai hợp chất, ký hiệu 1A; 1B Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A1 Phân đoạn A1 (8,60g) SKC silica gel, CHCl3:MeOH C-M (99:1) CT-I (2,56 g) C-M (98:2) CT-II (0,82 g) C-M (19:1) CT-III (1,79 g) 13 C-M (9:1) CT-IV (1,38 g) C-M (8:2) CT-V (1,49 g) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A Hợp chất 1A thu được từ phân đoạn A1 cao ethyl acetate với đặc điểm sau: Chất bột vơ định hình màu vàng nhạt Hiện hình vết màu vàng soi UV, vết màu vàng với dung dịch H SO 20%, sấy nóng Phổ 1H-NMR (DMSO- d ): Phụ lục Phổ 13C-NMR (DMSO-d ): Phụ lục Phổ HMBC (DMSO-d ): Phụ lục Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR hợp chất 1A cho thấy có diện năm proton nhân thơm khoảng 6-8 ppm, proton nhân thơm δ H 6,18 (1H; d; J 2,0; H6) ghép cặp meta với proton δ H 6,39 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có vịng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm δ H 7,44 (1H; dd; J 8,0; 2,5; H6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm δ H 6,90 (1H; d; J 8,5; H-5′) ghép cặp meta với proton nhân thơm δ H 7,54 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton vị trí 1,2,4 nhân thơm B Ngồi ra, phổ 1H-NMR cho thấy diện proton nhóm hydroxyl kiềm nối δ H 12,7 proton nhóm methoxyl δ H 3,77 Phổ 13C-NMR hợp chất 1A cho thấy có diện mười sáu carbon, carbon carbonyl cộng hưởng δ C 177,4 (C-4), năm carbon methine thơm cộng hưởng δ C 115,3 (C-2’); δ C 115,7 (C-5’); 120,5 (C-6’); 98,6 (C-6); 93,6 (C8) Ngoài ra, phổ 13 C-NMR cịn cho thấy diện tín hiệu Csp3 gắn oxygen cộng hưởng δ C 59,6 14 Các liệu phổ xác nhận hợp chất 1A có khung sườn flavonol Phổ HMBC cho thấy proton nhóm methoxyl (OCH ) tương quan với carbon δ C 137,6 xác nhận nhóm OCH gắn với carbon δ C 137,6 (C-3) Khi so sánh liệu phổ hợp chất 1A với 3-methoxyquercetin công bố nhận thấy có tương đồng, hợp chất 1A có cấu trúc hợp chất 3methoxyquercetin Hợp chất 1A lần tìm thấy cỏ the OH OH 3' OH 3' 4' 2' 1' O HO 2' 6' 5' HO 10 10 OH 6' OH O Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A 5' OCH3 OCH3 O Hình 3.2 Tương quan HMBC hợp chất 1A Bảng 3.1 So sánh phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 1A 3-methoxyquecetin[17] Hợp chất 1A 3-Methoxyquercetin 13 H - NMR (DMSO) δ H (ppm) J (Hz) 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ OCH OH B A 1' O 4' C - NMR (DMSO) δC 155,5 137,6 177,8 161,2 98,6 164, 93,6 156,3 104,0 120,7 115,3 145,2 148,7 115,7 120,5 6,18 (d; J 2,0) 6,39 (d; J 2,0) 7,54 (d; J 2,0) 6,90 (d; J 8,5) 7,44 (dd; J 8,0; 2,5) 3,77 (s) 15 13 C - NMR (C) δC 157,8 139,2 179,4 163,2 99,3 164,7 94,3 156,3 105,8 122,1 115,7 145,2 149,0 116,2 123,0 59,63 ... chất vinblastin từ dừa cạn, dùng điều trị ung thư vú phụ nữ Từ ngành hóa học hợp chất thiên nhiên đời phát triển mạnh mẽ, kết hợp với y dược sinh học ngày cho đời nhiều hợp chất có giá trị cao,... Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất 1A………… Phổ 13C-NMR hợp chất 1A Phổ HMBC hợp chất 1A Khối phổ phân giải cao hợp chất 1B Phổ 1H-NMR hợp chất 1B Phổ 13C-NMR hợp chất 1B …………… v LỜI MỞ ĐẦU Thiên nhiên... ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE 1.3.1 Mô tả thực vật cỏ the .3 1.3.2 Công dụng cỏ the .3 1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU