TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC MÃ SỐ 52720401 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CHIẾT PHÂN ĐOẠN RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CHIẾT PHÂN ĐOẠN RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán hướng dẫn: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN ThS ĐỖ VĂN MÃI Cần Thơ, năm 2017 Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ KIM TUYỀN MSSV: 12D720401259 LỚP: ĐH DƯỢC 7C i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu để hồn thành khố luận mơn dược liệu trường Đại học Tây Đô, em nhận nhiều quan tâm, hướng dẫn thầy cô, bạn bè gia đình Với lịng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Trần Công Luận, ThS Đỗ Văn Mãi người thầy tận tuỵ, nhiệt tình dìu dắt, giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô môn dược liệu trường Đại học Tây Đô tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em tồn thời gian thực khố luận Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy giáo trường Đại học Tây Đơ tận tình dạy bảo em suốt năm học vừa qua Cuối cùng, em xin tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc tới Cha mẹ, gia đình, bạn bè, người thân bên cạnh, động viên, ủng hộ em suốt thời gian học tập hoàn thành khoá luận Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Sinh viên TRẦN THỊ KIM TUYỀN ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên TRẦN THỊ KIM TUYỀN iii TĨM TẮT Khóa luận tốt nghiệp đại học - Khóa học: 2012 – 2017 Chuyên ngành Dược học - Mã số: 52720401 Phân tích sơ thành phần hóa học chiết phân đoạn rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng An Giang Sinh viên: Trần Thị Kim Tuyền Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Công Luận ThS Đỗ Văn Mãi Mở đầu Trong y học cổ truyền, Đinh lăng từ lâu sử dụng vị thuốc thông huyết mạch Những nghiên cứu trước Đinh lăng có tác dụng dược lý tương tự Nhân sâm giá thành lại rẻ dễ trồng Nhân sâm nên chúng quan tâm nghiên cứu Ở Việt Nam, nguồn dược liệu Đinh lăng dồi dào, hứa hẹn nguồn khai thác thành phần hóa học chúng đầy tiềm Đề tài hướng tới việc khảo sát thành phần hóa học Đinh lăng để cung cấp nguồn tài liệu tham khảo cho nghiên cứu Đối tượng phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Đinh lăng, thu hái Tri Tôn – An Giang Sau qua trình sơ chế ban đầu đối tượng khảo sát đặc điểm vi học, thử độ tinh khiết, nghiên cứu thành phần hóa học rễ Đinh lăng với phương pháp chiết lỏng – lỏng Sau phơi khô 9,3 kg rễ Đinh lăng, ngấm kiệt với cồn 96 % Tiến hành cô thu hồi cồn, thu 1,75 kg cao rễ tiến hành lắc phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần Cơ thu hồi dung môi, thu cao tương ứng Kết bàn luận Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng, kỹ thuật ngấm kiệt với cồn 96 %, sau lắc phân bố với diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol, thu 300 g cao Et2O, 30 g cao EtOAc, 405 g cao n-BuOH 800 g cao nước cuối Song song đó, thu kết đặc điểm vi học, thử độ tinh khiết khảo sát sơ thành phần hóa học Đinh lăng Kết luận: Bằng kỹ thuật đơn giản khảo sát đặc điểm vi học, độ tinh khiết Với phương pháp ngấm kiệt lắc phân bố thu cao phân đoạn Để làm tài liệu cho nghiên cứu sau iv MỤC LỤC Trang DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT X CHƯƠNG MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.TỔNG QUAN VỀ ĐINH LĂNG 2.1.1.Vị trí, phân loại Đinh lăng 2.1.2.Tên Việt Nam, tên khoa học, tên gọi khác 2.1.2.1.Tên Việt Nam 2.1.2.2.Tên khoa học 2.1.2.3.Tên gọi khác 2.1.3.Một số loài Đinh lăng khác 2.1.3.1.Đinh lăng tròn 2.1.3.2.Đinh lăng ráng 2.1.3.3.Polyscias sambucifolia (Sieber) Harms 2.1.3.4.Đinh lăng trổ 2.1.3.5.Đinh lăng 2.1.3.6.Polyscias grandifolia Volkens 2.1.3.7.Đinh lăng đĩa 2.1.4.Đặc điểm thực vật Đinh lăng 2.1.4.1.Mô tả 2.1.4.2.Sinh thái 2.1.5.Thu hái chế biến 2.1.6.Phân bố thu hái 2.1.7.Trồng trọt 2.1.8.Thành phần hóa học 2.1.9.Tác dụng dược lý 20 v 2.1.10.Công dụng liều dùng 23 2.1.10.1.Công dụng 23 2.1.10.2.Liều dùng 23 2.1.11.Sản phẩm Đinh lăng có mặt thị trường 25 2.2.TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 27 2.3.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 30 2.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 31 2.3.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng 33 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38 3.1.1.Nguyên liệu 38 3.1.2.Hóa chất dung mơi 38 3.1.3.Trang thiết bị 38 3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.2.1.Thu hái xử lý bảo quản Đinh lăng 39 3.2.1.1.Thu hái 39 3.2.1.2.Xử lý bảo quản 39 3.2.2.Nghiên cứu đặc điểm vi học 39 3.2.2.1.Khảo sát hình thái 39 3.2.2.2.Khảo sát vi phẫu 39 3.2.2.3.Khảo sát bột dược liệu 40 3.2.3.Thử tinh khiết 40 3.2.3.1.Xác định độ ẩm 40 3.2.3.2.Xác định tro toàn phần 41 3.2.3.3.Xác định chất chiết dược liệu 41 3.2.4.Nghiên cứu hóa học 41 3.2.4.1.Định tính 41 3.2.4.2.Định tính sơ nhóm thân rễ Đinh lăng 43 3.2.4.3.Chiết xuất tách phân đoạn 49 3.2.4.4.Thăm dò hệ sắc ký cao phân đoạn 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 4.1.THỰC VẬT HỌC 53 vi 4.1.1.Đặc điểm hình thái 53 4.1.2.Đặc điểm vi phẫu 59 4.1.3.Đặc điểm bột dược liệu 65 4.2.THỬ TINH KHIẾT 70 4.2.1.Độ ẩm 70 4.2.2.Xác định độ tro 71 4.2.3 Chất chiết dược liệu 70 4.3.NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 71 4.3.1.Định tính 71 4.3.2.Định tính sơ nhóm chất thân rễ Đinh lăng 76 4.3.3.Chiết xuất 78 4.3.4.Tách phân đoạn kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 79 4.4.THĂM DỊ HỆ DUNG MƠI 80 4.4.1.Sắc ký lớp mỏng cao diethyl ether 80 4.4.2.Sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat 82 4.4.3.Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol 84 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 87 5.1 KẾT LUẬN 87 5.1.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học 87 5.1.2 Thử tinh khiết 87 5.1.3 Nghiên cứu hóa học 87 5.2 ĐỀ XUẤT 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ vị trí phân loại lồi Polyscias fruticosa (L.) Harms Hình 2.2 Tồn Đinh lăng Hình 2.3 Tồn hoa Đinh lăng Hình 2.4 Một số acid amin có Đinh lăng Hình 2.5 Một số vitamin có Đinh lăng Hình 2.6 Một số hợp chất có tinh dầu 16 Hình 2.7 Một số flavonoid từ Đinh lăng 16 Hình 2.8 Cơng thức falcarindiol Đinh lăng 18 Hình 2.9 Cơng thức chung saponin triterpenoid Đinh lăng 18 Hình 2.10 Sản phẩm Đinh lăng 27 Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị dịch chiết 43 Hình 3.2 Sơ đồ tách chất dịch chiết ether 44 Hình 3.3 Sơ đồ phân tích nhóm hợp chất dịch chiết cồn 45 Hình 3.4 Sơ đồ phân tích nhóm hợp chất dịch chiết cồn thủy phân 46 Hình 3.5 Sơ đồ phân tích nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước 47 Hình 3.6 Sơ đồ phân tích nhóm hợp chất dịch chiết nước thủy phân 48 Hình 3.7 Sơ đồ tách chiết phân đoạn 50 Hình 4.1 Tồn Đinh lăng 52 Hình 4.2 Hình thái bên ngồi Đinh lăng 53 Hình 4.3 Cụm hoa Đinh lăng 54 Hình 4.4 Hình thái bên hoa Đinh lăng 55 Hình 4.5 Hình tồn thân Đinh lăng 56 Hình 4.6 Hình đường kính thân Đinh lăng 56 Hình 4.7 Hình hình thái bên ngồi rễ Đinh lăng 57 Hình 4.8 Hình thái bên ngồi rễ rễ Đinh lăng 58 Hình 4.9 Vi phẫu Đinh lăng vật kính 10X 59 viii Hình 4.10 Vi phẫu Đinh lăng vật kính 40X 59 Hình 4.11 Vi phẫu cuống Đinh lăng vật kính 10X 60 Hình 4.12 Vi phẫu cuống Đinh lăng vật kính 40X 61 Hình 4.13 Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X 62 Hình 4.14 Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X 63 Hình 4.15 Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X 64 Hình 4.16 Bột Đinh lăng soi vi phẫu 65 Hình 4.17 Soi bột Đinh lăng vật kính 40X 66 Hình 4.18 Bột thân Đinh lăng soi bột 66 Hình 4.19 Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X 67 Hình 4.20 Bột rễ Đinh lăng 67 Hình 4.21 Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X 68 Hình 4.22 Định tính cao rễ hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) 72 Hình 4.23 Định tính cao rễ hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3) 73 Hình 4.24 Định tính saponin sắc kí lớp mỏng 74 Hình 4.25 Định tính saponin thân Đinh lăng SKLM 75 Hình 4.26.Sơ đồ chiết xuất rễ Đinh lăng 77 Hình 4.27 Sơ đồ tách phân đoạn 79 Hình 4.28 Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S1 80 Hình 4.29 Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S2 80 Hình 4.30 Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S3 81 Hình 4.31 Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S1 82 Hình 4.32 Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S2 83 Hình 4.33 Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S3 83 Hình 4.34 Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S1 84 Hình 4.35 Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S2 84 Hình 4.36 Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S3 85 ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tóm tắt saponin triterpen Đinh lăng 19 Bảng 4.1 Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng 69 Bảng 4.2 Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng 69 Bảng 4.3 Tiêu chuẩn độ tro dược liệu 70 Bảng 4.4 Chất chiết dược liệu 70 Bảng 4.5 Định tính sơ nhóm chất thân rễ Đinh lăng 76 Bảng 4.6 Khối lượng độ ẩm cao phân đoạn cao rễ 78 Rễ Đinh lăng, Sài hồ, vị 20 g; Rau má 16 g; Tre, Cam thảo nam, vị 12 g; Bán hạ vàng g, Gừng g Sắc uống Chữa phong tê thấp, đau xương khớp, đau lưng Đinh lăng 100 g, thái khúc, vàng, sắc uống ngày thay nước Phòng tác dụng thuốc điều trị lao Lá Đinh lăng vàng 20 g - 25 g, hãm uống nước dùng ngày Phòng co giật trẻ em Lấy Đinh lăng phơi khơ lót vào gối hay trải xuống giường cho trẻ em nằm (Đỗ Huy Bích, 2006; Quách Tuấn Vinh, 2005; chuthapdo.org.vn; ydvn.net) 2.1.11 Sản phẩm Đinh lăng có mặt thị trường Rượu Đinh lăng ❖ Thành phần - Rễ Đinh lăng khô khoảng 100 g - 150 g - lít rượu ngon có độ cồn khoảng 35 - 40o ❖ Cơng dụng - Khí huyết lưu thông, ăn ngon, ngủ yên, tăng cường sinh lực - Trị đau xương khớp Đinh lăng trà TRC ❖ Thành phần - Đinh lăng 1,5 g - Lá Vằng 0,2 g - Lá Sen 0,2 g - Cỏ 0,1 g ❖ Cơng dụng - Tăng tuần hồn não, giảm hội chứng tiền đình, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, ù tai - Tăng khả tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, trí nhớ, run chân tay ❖ Cách dùng - Nhúng túi trà vào nước sôi, chờ - phút - Ngày dùng từ - túi (lasen.com.vn) Trà Đinh lăng 25 ❖ Thành phần - Đinh lăng - Cỏ ❖ Cơng dụng - Tăng tuần hồn não, giảm hội chứng tiền đình: Đau đầu, chóng mặt, ù tai, ngủ, thăng - Tăng khả tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, trí nhớ, run chân tay ❖ Cách dùng - Dùng cho lứa tuổi - Những túi trà vào ấm nước sôi 150 ml - 200 ml, chờ - phút Có thể thêm đá theo ý thích (quagac.com) Hoạt huyết dưỡng não HBN ❖ Thành phần - Cao mềm Đinh lăng 150 mg - Cao Bạch 10 mg - Tá dược vừa đủ viên ❖ Công dụng - Phịng điều trị chứng suy giảm trí nhớ, thiếu tuần hồn não - Thích hợp cho người làm việc trí óc căng thẳng bị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mệt mỏi ❖ Cách dùng - Người lớn: - viên/lần, ngày uống - lần - Trẻ em tuổi: viên/lần, ngày uống lần Gối Đinh lăng ❖ Thành phần - Lá Đinh lăng - Vỏ gối ❖ Công dụng Gối Đinh lăng làm quy cách tiêu chuẩn cho bé giấc ngủ ngon, chống mồ hôi trộm, hết tật giật mình, tránh muỗi trùng ❖ Cách dùng Đối với trẻ từ - 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 26 cm x 40 cm Trẻ 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 30 cm x 46 cm (goianhviet.com) 26 Gỏi cá Rượu Đinh lăng Đinh lăng trà - TRC Trà Đinh lăng Hoạt huyết dưỡng não HBN Gối Đinh lăng - Anh Việt Hình 2.10 Sản phẩm Đinh lăng 2.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT Để khảo sát thành phần hóa thực vật lồi nhà nghiên cứu đưa định làm việc loài mà tùy vào mục đích lựa chọn trước Việc lựa chọn phụ thuộc nhiều tài liệu tham khảo phương tiện sẵn có liên kết phịng thí nghiệm Các tài liệu tham khảo liệu tin học NAPRALERT cho biết thông tin hóa - thực vật, đặc điểm thực vật, hoạt tính sinh học hợp chất cụ thể, tất thông tin vùng địa phương, quốc gia (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 27 Trong nghiên cứu sản xuất dược liệu chế phẩm từ Dược liệu, để chiết xuất tinh chế cao chiết Dược liệu; kiểm soát đảm bảo chất lượng dược liệu chế phẩm từ dược liệu hay phân lập chất tinh khiết người ta cần phải biết thành phần (ở mức độ cao cấu trúc hóa học) chất dược liệu Trong sử dụng Dược liệu, có nhiều trường hợp dược liệu sử dụng nhiều có hiệu điều trị thành phần hóa học chúng lại khơng biết đầy đủ hay đơi hồn tồn chưa nghiên cứu sâu Ngày việc hiểu biết thành phần hóa thực vật dược liệu trở nên quan trọng mà tiêu chuẩn hóa Dược liệu, kiểm sốt chất lượng dược liệu dạng chế phẩm từ dược liệu có xu hướng yêu cầu bắt buộc để đảm bảo tính an toàn, hiệu chất lượng sản phẩm cho người sử dụng Thành phần hóa học dược liệu phức tạp thường biết tường tận Vì thế, thơng thường mức độ đơn giản nhất, việc nghiên cứu thành phần hóa học dược liệu thường bắt đầu việc xác định nhóm hợp chất thường gặp thực vật phản ứng hóa học Việc xác định gọi “Phân tích thành phần hóa thực vật” Trong phân tích thành phần hóa thực vật, người ta thường sử dụng phản ứng hóa học đặc trưng cho nhóm hợp chất để xác định có mặt nhóm hợp chất nguyên liệu thực vật Việc phân tích tiến hành theo bước: Phân tích sơ bộ: Các chất nguyên liệu thực vật phân thành vài phân đoạn đơn giản cách sử dụng quy trình chiết đơn giản, điều kiện định (dung môi, pH mơi trường v.v…) Định tính nhanh hợp chất phân đoạn số thuốc thử chung Định tính xác định: Dùng quy trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng đặc hiệu để xác nhận có mặt nhóm hợp chất Khơng phải tất nhóm hợp chất dược liệu định tính Phân tích thành phần hóa thực vật xác định số nhóm hợp chất phổ biến thực vật Ở mức độ cao hơn, việc định tính nhóm hợp chất phương pháp khác như: Các phương pháp sắc ký kết hợp với định tính hóa học, kết hợp với phân tích quang phổ sử dụng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014) Quy trình dùng để xác định nhanh số nhóm hợp chất thường gặp nguyên liệu thực vật phản ứng hóa học (thường gọi phân tích sơ thành phần hóa thực vật) dựa nguyên tắc: 28 Phân tách hỗn hợp chất nguyên liệu thành phân đoạn đơn giản Dùng phản ứng hóa học đặc trưng (thường phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát nhóm hợp chất có dịch chiết Kết phản ứng đặc trưng, đặc biệt phản ứng màu, phụ thuộc nhiều vào mức độ “tinh khiết” nhóm chất môi trường phản ứng Phản ứng hợp chất hay nhóm hợp chất “tinh khiết” khác biệt nhiều hay ít, đơi khác biệt hồn tồn với phản ứng hỗn hợp Trong hỗn hợp, nhóm hợp chất ảnh hưởng đến kết phản ứng nhóm hợp chất khác thường xem “tạp chất” Các “tạp chất” ảnh hưởng đến kết định tính theo hai hướng: - Cản trở phản ứng, làm cho phản ứng khó xảy hay khơng thể xảy - Cản trở việc nhận định kết phản ứng thân chúng che lắp kết phản ứng hay chúng phản ứng với thuốc thử tạo sản phẩm che lắp kết Vì thế, việc tách chất có nguyên liệu thực vật thành phân đoạn có thành phần đơn giản trước tiến hành định tính cần thiết để thu kết tốt Trong phân tích sơ thành phần hóa thực vât, tách phân đoạn đơn giản chủ yếu dựa vào tính tan nhóm hợp chất mơi trường (dung mơi, pH) khác Các chất nguyên liệu thực vật phân thành nhóm theo độ phân cực chúng Thơng thường chúng phân thành nhóm: - Nhóm chất khơng phân cực - Nhóm chất có độ phân cực trung bình - Nhóm chất có độ phân cực mạnh Trong số trường hợp, thay đổi mức độ ion hóa phân tử (dẫn tới thay đổi tính tan) nhóm chất môi trường acid hay base dùng để tách phân nhóm Yêu cầu chung phản ứng hay thuốc thử sử dụng định tính hợp chất chúng phải đặc hiệu, nhạy dễ phát Chúng phải khơng hay bị ảnh hưởng có mặt nhóm hợp chất khác có mơi trường phản ứng Có số quy trình khác để định tính nhóm hợp chất thường gặp thực vật Các quy trình khác chủ yếu việc sử dụng dung môi để chiết tách hỗn hợp số lượng nhóm hợp chất định tính Một số quy trình phân tích sử dụng sàng lọc chất vô hữu sử dụng từ lâu phịng thí nghiệm quy trình phân tích Stas - Otto 29 Quy trình sử dụng chủ yếu cho hỗn hợp chất tổng hợp Các quy trình phân tích sử dụng phân tích thành phần hóa học thực vật kể quy trình phân tích Puri (Hungari), Schreiber (Đức) quy trình phân tích I Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) v.v… Trong quy trình trên, quy trình phân tích I Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) thường dùng ưu điểm so với quy trình khác Nó xác định nhiều nhóm hợp chất nguyên liệu thực vật, cách thực khơng q phức tạp tiến hành khoảng thời gian ngắn, với lượng nguyên liệu nhỏ (khoảng - 25 g) Kết cho khái niệm thành phần hóa thực vật dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014) 2.3 Một số phương pháp chiết tách Mục đích việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên Khảo sát thành phần hóa học mới, trước chưa nghiên cứu xem chất có hoạt tính sinh học Muốn biết điều cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết > 95 % khảo sát cấu trúc hóa học phương pháp quang phổ đại Cần có thêm lượng mẫu hợp chất biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm hoạt tính sinh học chất Nếu việc thử nghiệm cho kết hấp dẫn xem xét tổng hợp hóa học hợp chất để có số lượng nhiều Tìm hiểu hợp chất biết xem chất sản sinh từ phận sinh vật Tìm hiểu khác biệt chất biến dưỡng thứ cấp sản sinh từ nguồn tự nhiên không điều kiện sinh thái: Thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật họ (family), chi (genus), loài (species) mọc hai nơi có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác có chứa hợp chất tự nhiên chất có hàm lượng hay khơng Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu cao Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp khơng biết khảo sát có chứa hợp chất với cấu trúc hóa học Biết cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại khơng phân cực đến loại phân cực, muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp cao thô ban đầu khó đạt kết mong muốn Vì vậy, người ta thường chuẩn bị loạt cao chiết có tính phân cực tăng dần, loại cao chiết chứa tương đối 30 hợp chất, giúp cho q trình lập hợp chất tinh chất dễ dàng Muốn có loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng dung mơi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa nguyên tắc chung “các chất giống hòa tan nhau”: Dung mơi khơng phân cực hịa tan tốt hợp chất khơng phân cực, dung mơi có tính phân cực trung bình hịa tan hợp chất có tính phân cực trung bình dung mơi phân cực mạnh hòa tan tốt hợp chất phân cực (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Chiết phương pháp sử dụng dung môi để tách chất tan khỏi hỗn hợp chất Tùy theo chế đặc điểm trình chiết mà người ta phân ra: - Chiết lỏng - lỏng (phân bố lỏng - lỏng) với chế q trình phân bố chất tan hai chất lỏng không đồng tan với theo định luật phân bố - Chiết rắn - lỏng với chế hịa tan chất tan vào dung môi Trong chiết rắn - lỏng, chất tan vào dịch chiết hịa tan đơn giản, chịu tác động nhiều trình khác chiết chất tan từ Dược liệu Trong trình chiết thông thường, tiểu phân chất rắn chịu tác động dung môi điều kiện Các chất tan hịa tan dung mơi thành dung dịch tạo nên dịch chiết, hịa tan bị ảnh hưởng chất không tan Trong trình chiết chất từ tổ chức sống (các mô tế bào động, thực vật vi sinh vật), chất nằm bên tế bào, cách biệt với bên ngồi vách tế bào, chất tan sau hòa tan thành dung dịch phải vượt qua vách tế bào khỏi mô để vào dịch chiết Quá trình chiết chất tan từ tổ chức sinh học thường gọi trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng Kỹ thuật gọi chiết dung mơi Cao alcol thơ ban đầu (thí dụ bột tận trích với metanol 80 %, đuổi dung mơi thu alcol thô ban đầu) dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) chứa hầu hết hợp chất hữu từ phân cực đến khơng phân cực khó lập riêng hợp chất tinh khiết để thực khảo sát Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu dung dịch ban đầu thành phân đoạn có tính phân cực khác Ngun tắc chiết dung mơi khơng phân cực (thí dụ eter dầu hỏa…) hịa tan tốt hợp chất có tính khơng phân cực (thí dụ alcol béo, ester béo…), dung mơi phân cực trung bình (thí dụ dietyleter, chloroform…) hịa tan tốt hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter - O -, aldehyd - CH = 31 O, ceton - CO -,…) dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol…) hịa tan hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức - OH, - COOH …) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Nguyên tắc chiết lỏng - lỏng phân bố chất tan vào hai pha lỏng hai pha lỏng khơng hịa tan vào Hằng số phân bố chất tan cho biết khả hòa tan chất hai pha lỏng thời điểm cân bằng, biểu diễn số phân bố K 𝐶𝑎 K=𝐶 𝑏 Ca= Nồng độ chất tan pha (a) giai đoạn cân Cb= Nồng độ chất tan pha (b) giai đoạn cân Mục đích chiết dung mơi để sơ bộ, tinh chế hóa hợp chất Nếu chất tan X chất tương đồng với chất X có số phân bố tương đối lớn chất tạp bẩn chất khác có cấu trúc hóa học khơng tương đồng với X lại có số phân bố nhỏ áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X chất tương đồng với Hằng số chất tan tương đối thay đổi theo nhiệt độ nồng độ chất tan có dung dịch ban đầu, nhiên số thay đổi nhiều tùy thuộc vào dung mơi (độ phân cực, đặc tính nước dung môi) dung dịch nước Riêng với dung dịch nước, pH dung dịch có ảnh hưởng quan trọng, pH acid yếu pH base yếu Việc chiết lỏng - lỏng thực bình lóng, cao alcol thơ ban đầu hòa tan vào pha nước Sử dụng dung mơi hữu cơ, loại khơng hịa tan với nước loại hỗn hợp với nước, để chiết khỏi pha nước hợp chất có tính phân cực khác Và cịn tùy vào tỉ trọng so sánh dung môi nước mà pha hữu nằm lớp hay lớp so với pha nước Việc chiết thực từ dung môi hữu phân cực đến dung mơi hữu phân cực thí dụ như: Ether dầu hỏa hexan, ether etyl, chloroform, ethyl acetat, n-butanol… Với loại dung môi hữu cơ, việc chiết thực nhiều lần, lần lượng nhỏ thể tích dung mơi; chiết đến khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi chuyển sang chiết với dung mơi có độ phân cực cao Dung dịch lần chiết gom chung lại, làm khan với nước như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, loại dung môi (bằng cách cô thu hồi dung môi) cuối thu cao chiết Muốn kiểm tra xem hợp chất chiết vào pha hữu hợp chất cịn lại pha nước….thì ta sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM); 32 mỏng cần so sánh đồng thời vết pha nước pha hữu Sự chiết dung mơi cụ thể gọi hoàn tất lần chiết thứ n, mỏng khơng cịn nhìn thấy vết chất pha nước pha hữu Song song đó, kiểm tra cách nhỏ giọt dung dịch chiết lần thứ n lên kiếng sạch, sau đuổi bay hết dung môi, giọt dung dịch lần thứ n khơng cịn để lại vết kiếng Cần lưu ý chiết lỏng - lỏng thực nhiệt độ phòng, gia tăng nhiệt độ cho dung mơi khả hịa tan dung mơi tăng lên nguyên tắc nêu có nhiều thay đổi Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng có nhược điểm phải lắc bình lóng nhiều lần, nên lần chiết sau, dung mơi bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn việc tách pha thành hai lớp Để khắc phục nhược điểm này, sử dụng cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thống dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm hòa tan vào acetonitril nước, lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl cho vào lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) làm dung dịch tách thành lớp; độ hòa tan vài hợp chất thay đổi đáng kể có diện nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 2.3.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng Một số phương pháp chiết rắn - lỏng: - Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Kỹ thuật chiết ngâm dầm Kỹ thuật chiết máy chiết Soxhlet Kỹ thuật chiết máy chiết Kumagawa Kỹ thuật chiết lôi theo nước Chiết nguyên liệu tươi Chiết chất lỏng siêu tới hạn Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Ngấm kiệt phương pháp chiết liên tục dung môi qua dược liệu theo hướng định, với tốc độ định Quá trình hịa tan xảy phương pháp ngấm kiệt khơng giống toàn khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao 33 Do trình chiết xảy theo gradient nồng độ nên trình chiết xảy triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng phương pháp ngâm dược liệu chiết kiệt Các yếu tố phụ trợ nhiệt độ, chất diện hoạt v.v… sử dụng để gia tăng trình chiết Quá trình ngấm kiệt thực bình chiết gọi bình ngấm kiệt Hình dạng, cấu tạo kích thước bình ngấm kiệt thay đổi tùy theo mục đích sử dụng thơng thường phần thân bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt kín có van điều chỉnh lưu lượng đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh hai đầu Q trình ngấm kiệt tiến hành nhiệt độ thường hay nhiệt độ cao nhiệt độ phịng nhiệt độ sơi dung mơi Bình thiết kế với phận gia nhiệt bảo ơn, dung mơi đưa vào bình nhiệt độ cao Chú ý: Khi ngấm kiệt nhiệt độ cao làm tăng tốc độ chiết dẫn đến phân hủy chất dễ chuyển hóa nhiệt Có thể thực ngấm kiệt rút kiệt dịch chiết bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với (ngấm kiệt ngược dòng) Trong ngấm kiệt ngược dịng, hệ thống bố trí cho dịch chiết lỗng bình chiết trước dung mơi đầu cho bình chiết sau bình lấy lượng dịch chiết đậm đặc định Với ngấm kiệt ngược dòng, lượng dịch chiết thu từ bình ln nhỏ nhiều có nồng độ cao so với ngấm kiệt bình riêng lẻ mà đảm bảo chiết kiệt Dược liệu Có phương pháp ngấm kiệt: - Ngấm kiệt thường - Ngấm kiệt kèm sấy phun - Ngấm kiệt ngược dòng Ngấm kiệt thường phương pháp sử dụng phổ biến khơng địi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp - Dụng cụ: Gồm bình ngấm kiệt thủy tinh, inox, hình trụ đứng, đáy bình van khóa để điều chỉnh vận tốc dung dịch chảy ra; bình chứa đặt bên để hứng dung dịch chiết - Tiến hành: 34 Dược liệu xay thô, lọt qua lỗ rây mm Mẫu không nên to chiết khơng kiệt, mẫu xay q mịn mẫu có tính nhầy nhựa trương nở… cản trở dịng chảy Bột dược liệu làm ẩm với lượng dung môi chiết với lượng vừa đủ để khoảng Đáy bình ngấm kiệt lót bơng thủy tinh tờ Đậy bề mặt lớp bột làm ẩm tờ giấy lọc chặn lên viên bi thủy tinh dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung mơi chiết vào bình dung mơi phủ xấp xấp lớp mặt Có thể sử dụng dung mơi nóng nguội Để n sau thời gian, thường 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy giọt nhanh chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt với vận tốc dung dịch chiết chảy khỏi bình Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột sắc ký lớp mỏng nhỏ giọt dung dịch chiết lên kiếng sạch, để bốc xem có cịn để lại vết mặt kiếng hay khơng, khơng cịn vết chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Kỹ thuật chiết ngâm dầm Ngâm phương pháp chiết gián đoạn tồn lượng dung mơi tiếp xúc đồng thời với toàn lượng dược liệu dụng cụ thích hợp Q trình chiết xuất xảy thời điểm thiết bị chiết dịch chiết rút khỏi thiết bị lúc Quá trình ngâm lặp lại thêm hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất Dược liệu Sự khuấy trộn, yếu tố phụ trợ nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v… sử dụng để gia tăng trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) ❖ Phương pháp ngâm lạnh Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu ngâm với dung môi nhiệt độ phịng Thời gian ngâm bình thường khơng 12 với dược liệu mỏng manh hay dược liệu xay nhỏ để đảm bảo trình chiết hoàn tất Trong thời gian này, cân nồng độ hoạt chất bên bên thành tế bào thiết lập trình thẩm thấu kết thúc Thời gian ngâm kéo dài hơn, từ đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) ❖ Phương pháp ngâm nóng 35 Phương pháp ngâm nóng phương pháp ngâm thực nhiệt độ cao nhiệt độ phịng nhiệt độ sơi dung mơi Do có gia nhiệt nên q trình chiết xảy nhanh hơn, dịch chiết thu có nồng độ cao tốn dung mơi Q trình hãm y học cổ truyền sống ngày (hãm thuốc, hãm trà) trình ngâm nóng với dung mơi nước Chưng coi biến thể phương pháp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Chiết Soxhlet Kumagawa Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với lượng nhỏ dung môi Kumagawa cho phép chiết nhiệt độ gần với nhiệt độ sơi dung mơi cịn Soxhlet thực gần với phương pháp ngâm lạnh Túi đựng bột dược liệu kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt Chiết hồi lưu với quy mô nhỏ Dụng cụ gồm phần - Bình cầu đun có điều nhiệt - Thân Soxhlet - Bộ sinh hàn Dịch chiết thu bình cầu đun Thời gian chiết 12 – 24 – 36 Ưu điểm: Lượng dung mơi sử dụng nhỏ mà chiết kiệt hoạt chất Nhược điểm: Khó thực cho lượng lớn Dược liệu Thông thường, dùng để chiết phịng thí nghiệm quy mơ pilot Khơng khấy trộn q trình chiết xuất Kỹ thuật chiết lôi theo nước Kỹ thuật đặc trưng để chiết khỏi cỏ loại hợp chất có tính bay được, ví dụ tinh dầu Chiết nguyên liệu tươi 36 Với mô sống động vật hay dược liệu mỏng manh lá, hoa người ta chiết nhanh chất tế bào với dung môi nước thân nước cách xay nhỏ mô động thực vật dung môi Nguyên liệu cắt nhỏ, ngâm ngập dung môi xay nhỏ cánh khuấy quay với tốc độ cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) thời gian ngắn khoảng - 10 phút Với tốc dộ này, mô phân tán nhỏ, tế bào bị vỡ chất tan thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu q trình hịa tan Sự thẩm thấu, có đóng vai trị thứ yếu Với cách chiết này, toàn chất tế bào gồm chất chuyển hóa bậc II lẫn chất đại phân tử có mặt dịch chiết Cách chiết có lợi nghiên cứu protein, chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ phân tử Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động enzym làm thay đổi cấu trúc chất hạn chế tạp chất protein, polysaccharid, dung mơi sử dụng cồn hay aceton Quá trình chiết thực máy khuấy có tốc độ cao nên gọi turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Các phương pháp chiết khác Tải FULL (102 trang): https://bit.ly/3muFCbw Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Ngồi kỹ thuật chiết cổ điển trên, thực tế người ta dùng kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh q trình hịa tan chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết áp suất hay sử dụng dung môi đặc biệt để chiết chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 37 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nguyên liệu - Mẫu tươi lá, thân, rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) - Thân rễ Đinh lăng dùng để nghiên cứu thành phần hóa học chiết phân đoạn 3.1.2 Hóa chất dung mơi Ngồi số dung mơi hóa chất dùng phịng thí nghiệm, phần thực nghiệm có sử dụng: - Hóa chất khảo sát vi học: Dung dịch javel 50 %, dung dịch acid acetic %, dung dịch iod 0,1 % (son phèn), dung dịch carmin %, nước cất - Dung môi chiết xuất: EtOH 96 %, MeOH - Dung môi dùng lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat, Tải FULL (102 trang): https://bit.ly/3muFCbw n-butanol Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net - Dung môi sắc ký lớp mỏng: Chloroform, methanol, n-hexan, n-butanol, diethyl ether, ethyl acetat, petroleum ether, benzen - SKLM dùng silica gel F254 Merck tráng sẵn nhôm - Chất chuẩn: Acid oleanoid chuẩn - Phát vết chất: Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm 365 nm, thuốc thử vanillin sulfuric (VS), thuốc thử acid sulfuric 10 %/EtOH 3.1.3 Trang thiết bị - Bếp cách thủy - Bình sắc ký Tây Ban Nha - Cân phân tích OHAUS PAJ 2102 - Cân phân tích số - Đèn UV 254 365 nm - Điện thoại di động SAMSUNG J7 Prime - Kính hiển vi OLYMPUS CX22 - Máy cô quay Shendi RE-52CS-1 - Máy khuấy EMCLAB OS20-Pro - Tủ lạnh SANYO 38 - Tủ sấy DRYING OVEN - Các dụng cụ thông dụng khác phịng thí nghiệm 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thu hái xử lý bảo quản Đinh lăng 3.2.1.1 Thu hái Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thu hái ngày 11/11/2016 Tri Tôn - An Giang, dược liệu thu hái PGS.TS Trần Công Luận định danh so sánh với tài liệu tham khảo xác định loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) (Đỗ Tất Lợi, 2004; Võ Văn Chi, 2012) 3.2.1.2 Xử lý bảo quản Để khảo sát khơ rễ tươi thân tươi sau thu hái làm phơi khô nhiệt độ phòng sấy tủ sấy 60 - 80 oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời gay gắt tia tử ngoại (UV) có ánh sáng mặt trời kích thích phản ứng hóa học, tạo nên hợp chất giả tạo Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014) Để khảo sát tươi (khảo sát đặc điểm vi học), Đinh lăng sau thu hái, làm đem khảo sát ngay, tránh để thời gian lâu làm tế bào hay tế bào không cịn ngun vẹn, chọn mẫu phải xác, có tính đại diện, không già không non (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014) Lưu trữ mẫu: Mẫu lưu trữ Bộ môn dược liệu, Trường Đại Học Tây Đô 3.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 3.2.2.1 Khảo sát hình thái Quan sát đặc điểm hình thái tồn Đinh lăng tươi mơ tả phận dùng bên ngồi dược liệu màu sắc, kích thước, hình dáng,…(ĐH Y Dược TPHCM, 2014, Phạm Hoàng Hộ, 2003) 3.2.2.2 Khảo sát vi phẫu Chọn mẫu có tính đại diện, khơng q già không non Để quan sát cấu tạo bên quan thực vật thực phương pháp cắt lát mỏng tay nhuộm hai màu với quan cắt thành khoanh (vi phẫu) trước quan sát Nếu mẫu cắt thường lấy đoạn 1/3 gân kể từ nơi tiếp giáp với cuống phần cuống hai bên Nếu thân thường cắt lóng Nếu rễ cắt phần rễ non (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014) 39 8066190 ... - Khóa học: 2012 – 2017 Chuyên ngành Dược học - Mã số: 52720401 Phân tích sơ thành phần hóa học chiết phân đoạn rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng An Giang Sinh viên: Trần Thị... phần khảo sát sơ thành phần hóa học rễ phân đoạn chiết tách rễ Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), so sánh thành phần hóa học thân rễ Đinh lăng, cung cấp... thực vật thành phân đoạn có thành phần đơn giản trước tiến hành định tính cần thiết để thu kết tốt Trong phân tích sơ thành phần hóa thực vât, tách phân đoạn đơn giản chủ yếu dựa vào tính tan nhóm