qua cột DEAE – Sephadex A-25 Các bước tinh Loại mẫu mg/l % Đv/ml % Đv/mgprotein Độ sạch NH42SO4 60% bão hòa - Điện di trên gel polyacrylamide Để kiểm tra độ tinh sạch và ban đầu tìm
Trang 1111
ĐIỀU TRA, TINH SẠCH VÀ TÌM HIỂU TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA
LECTIN MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU CÔ VE (PHASEOLUS VULGARIS L.)
Cao Đăng Nguyên 1 , Nguyễn Thị Cẩm Hạnh 2
1
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
2
Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng
Tóm tắt Đã điều tra lectin của 6 giống đậu cô ve thấy rằng cả 6 giống đều có hoạt tính
lectin trong đó giống đậu cove hạt trắng dạng bụi (white bean core bush type white seeds)
có hoạt tính lectin mạnh nhất, đặc biệt đối với hồng cầu trâu, bò, lợn Lectin của 6 giống này đều không có biểu hiện đặc hiệu nhóm máu
Lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 300C – 400C, pH 6,8 – 7,6 Các đường α-D-glucose, α-D-galactose, D-mannose, D-fructose, D-saccharide, D-lactose, D-arabinose và D-manitose ở nồng độ 0,05 – 0,1 M có tác dụng kìm hãm hoạt tính của lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi Lectin này cũng bị kìm hãm bởi protein của một số huyết thanh người và động vật (trâu, bò, lợn)
Đã tinh sạch lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi có độ tinh sạch gấp khoảng 52 lần so với dịch thô ban đầu Trên gel polyacrylamide thấy xuất hiện 5 band có khối lượng phân tử trong khoảng 30 – 97 kDa
1 Mở đầu
Lectin là protein hay glucoprotein, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu
và một số loại tế bào khác một cách chọn lọc, ngoài ra lectin còn có khả năng kích thích
sự tăng sinh của tế bào limphocyte [3, 4, 5, 9] Lectin có mặt trong các giới động vật, thực vật và vi sinh vật đã và đang được nhiều người quan tâm nghiên cứu Hiện nay, trên thế giới đã có hàng trăm chế phẩm được bán ra trên thị trường để ứng dụng vào các mục đích khác nhau, đặc biệt trong y học Ở nước ta cũng đã có hàng loạt công trình nghiên cứu lectin trong những năm gần đây và theo hướng điều tra, nghiên cứu cấu trúc chức năng, ứng dụng Trên cơ sở đó chúng tôi tến hành đề tài này trên một số hạt cây họ đậu – loài được trồng phổ biến trên địa bàn Thừa Thiên Huế, nhằm góp phần khai thác nguồn tài nguyên và nghiên cứu đa dạng sinh vật ở Việt Nam
2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1 Đối tượng
- Đối tượng nghiên cứu là hạt một số giống đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có
Trang 2xuất xứ từ công ty TNHH sản xuất thương mại xanh thành phố Hồ Chí Minh
- Hồng cầu và huyết thanh các nhóm máu A, B, O và AB do trung tâm huyết học
và truyền máu miền Trung cung cấp
2.2 Phương pháp
- Hồng cầu trước khi sử dụng rửa sạch bằng nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) và pha loãng ở nồng độ 3% - 5% bằng nước muối sinh lý
- Xử lý mẫu: mẫu hạt giống được bảo quản ở nhiệt độ thường Hạt trước khi sử dụng đem rửa sạch và chiết rút bằng đệm PBS ở pH 7,4 với tỉ lệ 1:5 Hỗn hợp chiết rút đem ly tâm 10.000 vòng/phút thu dịch trong giữ ở -200C để nghiên cứu lectin
- Nghiên cứu các tính chất bằng cách ngưng kết hồng cầu theo phương pháp của Gebauer [5]
- Xác định protein hòa tan theo phương pháp Lowry [6]
- Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion qua DEAE - Sephadex A-25 theo những điều mô tả của Nguyễn Quốc Khang [8]
- Điện di trên SDS-polyacrylamide theo nguyên tắc của Laemmli [7]
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Điều tra lectin một số giống đậu cô ve
Bảng 3.1 Hàm lượng protein và hoạt tính lectin trong dịch chiết ở một số giống đậu cove
(Phaseolus Vulgaris L.)
STT Tên đậu
thường gọi
Tên đậu trên bao bì
Protein (mg/ml)
Hoạt tính
Nhóm máu
HĐC (Đv/ml)
HĐR (Đv/mg protein)
1 Đậu cove hạt
trắng dạng bụi
White Bean Cora Bush type White Seeds
2,28
2
Đậu cove
A - Delta dạng
leo
Bean Pole
A - Delta 31,8
Trang 33 Đậu cove hạt
trắng dạng leo
Bean Cora White Seeds Pole type
57,5
4
Đậu cove green
lake hạt trắng
dạng leo
Bean Pole Green lake White Seeds
1,06
5 Đậu cove hạt đen
dạng leo
Bean Cora Geen Lake White Seeds
49,6
6
Đậu cove
A - Hiland dạng
leo
Bean Pole
A - Hiland 27,6
Ghi chú Đv: Đơn vị hoạt độ gây ngưng kết; HĐC: Hoạt độ chung; HĐR: Hoạt độ riêng
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, cả 6 giống đậu cove đều có khả năng gây ngưng kết mạnh với tất cả các nhóm máu của người Trong đó giống đậu cove hạt trắng dạng bụi (White Bean Cora Bush types White seeds) có khả năng ngưng kết mạnh nhất Tuy nhiên, cả 6 giống đã được điều tra không có giống nào đặc hiệu với một trong các nhóm máu của người
Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng giống cove hạt trắng dạng bụi để làm đối tượng nghiên cứu một số tính chất khác
3.2 Tinh chế lectin đậu cô ve
- Tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion
Sau khi chiết rút lectin dịch thô được kết tủa (NH4)2SO4 60% bão hòa, kết tủa được hòa tan trở lại trong đệm rồi thẩm tích qua đêm Tiếp theo dịch được thẩm tích được cho lên cột sắc ký trao đổi ion qua DEAE-Sephadex A-25 đã chuẩn bị từ trước
Kết quả sau khi qua cột sắc ký DEAE – Sephadex A-25 được trình bày ở hình 3.1 và các bước tinh sạch được trình bày tóm tắt trên bảng 3.2
Trang 4Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho ta thấy: protein được rút ra từ phân đoạn
1 – 62, trong đó tập trung chủ yếu từ đoạn 4 – 13 Hoạt tính của lectin nằm ở các phân đoạn từ 2 – 13, trong đó tập trung từ đoạn 6 – 9 Đặc biệt ở phân đoạn 8 lectin có hoạt tính cao nhất (10240 Đv/ml), có độ sạch gấp 52 lần so với dịch thô ban đầu Tuy nhiên hiệu suất thu hồi protein chỉ khoảng 2%
Hình 3.1 Đường biểu diễn kết quả tính sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion trên sephadex A-25 Bảng 3.2 Tóm tắt các bước tinh sạch lectin đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) qua cột DEAE –
Sephadex A-25
Các bước tinh
Loại mẫu mg/l % Đv/ml % Đv/mgprotein Độ sạch
(NH4)2SO4 60%
bão hòa
- Điện di trên gel polyacrylamide
Để kiểm tra độ tinh sạch và ban đầu tìm hiểu khối lượng phân tử lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi, chúng tôi tiến hành điện di protein ở phân đoạn 8 trên gel polyacrylamide 12% trong điều kiện có SDS thu được kết quả trên hình 3.2
0
1
2
3
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 0
1 2 3 4 5 6 7
8 Protein
HĐR
HĐR x 10 3
Protein (mg/ml)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62
Phân đoạn
Trang 5Hình 3.2 Ảnh kết quả điện di trên gel polyacrylamide -SDS
Mẫu sau khi qua cột, trên hình ảnh điện di cho thấy các băng có khối lượng phân
tử nằm trong khoảng 30 – 97 kDa Đặc biệt trong đó có một băng đậm khoảng 35 kDa Rất có thể đây là lecin đậu mà chúng tôi đang nghiên cứu
3.3 Một số tính chất lý - hóa của lectin đậu cô ve
- Đặc hiệu nhóm máu
Tính chất đặc hiệu nhóm máu của lectin có ý nghĩa quan trọng, có thể sử dụng tính chất này để xác định và phân loại nhóm máu trong huyết học mà không cần có kháng nguyên gốc
Để tìm hiểu tính chất này đối với lectin đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành trên các nhóm máu A, B, O, AB, trâu, bò lợn và thu được kết quả ở bảng 3 3
Bảng 3.3 Đặc hiệu nhóm máu của lectin đậu cô ve hạt trắng dạng bụi
Nhóm máu
HĐC (Đv/ml)
HĐR (Đv/mg protein)
1
2
3
4
5
6
1 Protein chuẩn 2, 3 Mẫu dịch thô
4 Mẫu sau kết tủa 5 Mẫu sau thẩm tích
6 Sau sắc ký qua cột DEAE- Sephadex A-25
97 kDa Phosphorylase
66 kDa Albumin
45 kDa Ovalbumin
30 kDa Cacbonic anhydrase 20,1kDa chất ức chế tripsin 14,4 kDa α-lactalbumin
Trang 6Trâu 163840 72017,6
Từ dẫn liệu ở bảng 3.3, thấy rằng lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi phản ứng với hồng cầu người là nhóm B, O, AB mạnh hơn nhóm A
Lectin phản ứng rất mạnh với hồng cầu của trâu, lợn Đặc biệt hồng cầu máu trâu phản ứng rất mạnh gấp 256 lần nhóm máu B, O, AB, gấp 512 lần nhóm máu A Kết quả này phù hợp với nhiều kết quả đã được công bố rằng lectin có khả năng gây ngưng kết với cả tế bào động vật [2, 4]
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lectin
Giống như các chất có hoạt tính sinh học khác, hoạt tính lectin cũng bị ảnh hưởng bởi nhân tố của môi trường trong đó có nhiệt độ Để nghiên cứu tính chất này chúng tôi tiến hành phản ứng ngưng kết lectin ở những nhiệt độ khác nhau và thu được kết quả ở hình 3.3
Kết quả hình 3.3 cho thấy rằng lectin của giống cove đang nghiên cứu có khả năng hoạt động trong phạm vi nhiệt độ rất rộng 50C - 700C Trong đó khoảng 300C –
400C là nhiệt độ hoạt động tốt nhất của lectin Kết quả này phù hợp với công bố về điều kiện nhiệt độ lectin ngưng kết tốt của một số tài liệu [1, 2, 3, 4] Và kết quả này cũng gần giống với kết quả của tác giả Trương Văn Châu công bố về tính chất của một số cây
họ đậu [1]
- Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lectin
Lectin chủ yếu là các glucoprotein nên nó cũng là một chất điện ly lưỡng tính
Vì vậy trạng thái ion hóa phụ thuộc vào pH môi trường
Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính của lectin ở pH từ 4-10 và cho kết quả ở hình 3.4
0
100
200
300
400
500
600
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt
tính của lectin
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính
của lectin
Trang 7Từ hình 3.4 ta thấy, phạm vi hoạt động của lectin trong khoảng pH từ 4,5 – 10 Đặc biệt trong vùng 6,8 – 7,6 lectin có hoạt tính cao nhất Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trương Văn Châu về pH hoạt động của 5 loài đậu cove: Đậu cove vàng, nâu và thận pH thích hợp từ 6,0 – 8,0, cove leo từ 5,5 – 8,0 [1]
- Ảnh hưởng của muối trung tính
Lectin là chất có hoạt tính sinh học, nên nó cũng giống như enzyme Hoạt động của nó cũng bị ảnh hưởng của một số ion kim loại như Ca2+, Mg2+… Trong huyết thanh chuột Ca2+ đóng vai trò là phối tử đường trực tiếp Ở cây họ đậu Ca2+, Mg2+ có trong lectin đóng vai trò duy trì cấu trúc tiểu đơn vị và giúp định vị các gốc axit amin cho sự liên kết với đường [3, 8] Ion kim loại có khả năng làm ổn định hoặc biến đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của lectin
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính của lectin
Muối Nồng độ kìm hãm (M) Nồng độ kích thích (M)
Ghi chú: Nồng độ lectin sử dụng trong các thí nghiệm là 2,27 mg/ml
Vì vậy nó cũng có thể kích thích cũng có thể ức chế hoạt tính của lectin Trên cơ
sở đó chúng tôi dùng 6 loại ion kim loại dưới dạng muối trung tính để kiểm tra tính chất này của lectin kết quả thu được ở bảng 3.4
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 cho thấy Các muối kim loại hóa trị 2 như CuSO4, FeSO4, MnSO4,ZnSO4 kìm hãm hoạt tính của lectin ở nồng độ thấp Ngoài ra CaCl2, MgSO4 có khả năng kích thích làm tăng hoạt tính lectin Kết quả trên phù hợp với kết quả của tài liệu [3, 8]
- Sự tương tác với một số loại đường
Sự tương tác với một số loại đường là một trong những tính chất quan trọng của lectin Để xác định tính chất này của giống cove nghiên cứu chúng tôi tiến hành trên 8 loại đường khác nhau cho kết quả ở bảng 3.5
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, các loại đường ức chế hoạt tính của lectin hầu hết là đường đơn và nồng độ ức chế của các đường α-D-glucose, α-D-galactose, D-mannose, fructose và saccharide là như nhau và gấp đôi nồng độ các đường lactose,
Trang 8D-arabinose và D-manitose
Kết quả trên đúng với một số kết quả của các tác giả khác chứng minh rằng hoạt động ngưng kết của lectin bị ức chế chủ yếu bởi các đường đơn [3, 8]
Bảng 3.5 Tương tác với các loại đường
Tên các loại
đường
Nồng độ kìm hãm (M)
α-D-glucose 0,100
α-D-galactose 0,100
D-lactose 0,050
D-fructose 0,100
D-saccharide 0,100
D-arabinose 0,050
D-manitose 0,050
Bảng 3.6 Phản ứng trao đổi protein
Huyết thanh nhóm máu
Nồng độ ức chế (mg/ml)
Ghi chú: Nồng độ lectin sử dụng trong các thí nghiệm 2,27 mg/ml.
- Phản ứng trao đổi protein - protein
Lectin là một glucoprotein có khả năng trao đổi protein Để tìm hiểu tính chất này của lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi, chúng tôi tiến hành sử dụng một số dạng protein thô khác nhau để tìm hiểu và thu được kết quả ở bảng 3.6
Từ kết quả trên ta thấy rằng, lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi bị ức chế bởi các loại huyết thanh của nhóm máu A, B, O, AB của người và máu trâu, bò, lợn Huyết thanh của trâu ức chế mạnh nhất đối với loại lectin này; tiếp đến là huyết thanh nhóm máu AB, B người và máu bò; ức chế yếu nhất là huyết thanh của nhóm A, O của người
và máu lợn
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của lectin
Bằng cách ủ lectin ở một số nhiệt độ khác nhau và kiểm tra hoạt tính sau từng khoảng thời gian nhất định chúng tôi thu được kết quả trên hình 3.5
Từ dẫn liệu hình 3 5 ta thấy hoạt tính của lectin bền nhất ở nhiệt độ 100C Mặt khác ở nhiệt độ này hoạt tính lectin biến đổi phức tạp cụ thể là: hoạt tính lectin mạnh nhất ở ngày thứ 2 và thứ 5, ngày thứ 3, 4, 6 lại giảm xuống, đến ngày thứ 7 trở đi tăng lên và giữ hoạt tính ổn định đến ngày thứ 31, sau đó nhanh chóng giảm dần và mất hoạt tính ở ngày 45 Để giải thích hiện tượng này cần được nghiên cứu tiếp tục, bởi vì chúng tôi cho rằng có liên quan tới sự biến đổi của lectin từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động cũng như sự phân giải lectin bởi protease có mặt trong chế phẩm
Trang 91000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
60 độ C
10 độ C
20 độ C
40 độ C
Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền nhiệt của lectin
Ở các mức nhiệt độ cao hơn khác như 200C hoạt tính lectin tồn tại 27 ngày, 400C hoạt tính lectin tồn tại 14 ngày, 600C hoạt tính lectin tồn tại 19 ngày Như vậy ở những nhiệt độ khác nhau thì sự tồn tại của lectin có sự sai khác nhau rất lớn và cũng khá phức tạp, đây cũng là vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu
4 Kết luận
- Trong 6 giống đậu điều tra thì cả 6 giống đều có hoạt tính lectin trong đó giống đậu cove hạt trắng dạng bụi có hoạt tính lectin mạnh nhất, đặc biệt đối với hồng cầu trâu,
bò, lợn Lectin của 6 giống này đều không có biểu hiện đặc hiệu nhóm máu
- Lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 300C – 400C,
pH 6,8 – 7,6 và có thể tồn tại được từ 14 – 45 ngày ở nhiệt độ 100C – 600C sau khi đã tách khỏi hạt
- Các đường trong thí nghiệm ở nồng độ 0,05 – 0,1 M có tác dụng kìm hãm hoạt tính của lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi Lectin này cũng bị kìm hãm bởi protein của một số huyết thanh người và động vật (trâu, bò, lợn)
- Hoạt tính lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi được kích thích bởi CaCl2 và MgSO4 ở nồng độ 0,0625 – 0,125 M và bị kìm hãm bởi một số loại muối khác như FeSO4, MnSO4, ZnSO4, Cu SO4
- Có thể tinh sạch lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi theo quy trình đơn giản là chiết rút bằng đệm PBS pH 7,4, kết tủa bằng (NH4)2SO4 60% bão hòa, sắc ký trên gel DEAE Sephadex A-25 Lectin thu được có độ tinh sạch gấp khoảng 52 lần so với dịch thô ban đầu
Ngày
Trang 10TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Trương Văn Châu, Tinh chế, nghiên cứu một số tính chất của các lectin từ một số loài thuộc họ đậu (Fabaceae), họ dâu tằm (Moraceae) và khả năng ứng dụng trong y học,
Luận án PTS khoa Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, 1996
[2] Cao Phương Dung, Nguyễn Quốc Khang, Tinh chế và tính chất đặc trưng của lectin trai tai tượng (Tridacna squamosa), Tuyển tập nghiên cứu biển, Trung tâm khoa học tự
nhiên và cộng nghệ quốc gia viện Hải Dương Học, Tập 5, (1994), 153-162
[3] Đỗ Ngọc Liên, Đặc tính kích thích phân bào đối với lympho T của người, của các lectin ở hai loài mít hoang dại (Artocarpus asperulus, A masticata), Tạp chí khoa học
ĐHQG HN, Số 3, (1995), 33-38
[4] Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Bá Hai, Tinh sạch và tính chất đặc trưng của lectin một vài loài ốc sóng ở nước ngọt Thừa Thiên Huế, Tạp chí Công nghệ
sinh học, Tập 6, Số 4B, (2008), 131-136
[5] Fleish, M and Maider, L., A one step procedure proisolation and resolution of the Phaseolus vulgaris isolectin by affinity chromatography Biol Chem Hoppe – Seyler
Vol 266, (1985), 1029-1032
[6] Lowry, O.H.et al, Protein measurement with folinphenol reagent, J.Biol Chem 193,
(1951), 256 - 257
[7] Laemmli U.K., Preparative and newning of acrylamide slab gel, J Biol Chem 80,
(1997), 453-465
[8] Nguyen Quoc Khang et al., Purification and characterization of the lectin of Artocarpus tonkinensis - lectins: Sigma chimecal company USA Vol 6, (1988), 341-
348
[9] Sheng-Ce Tao, Yu Li, Jiangbing Zhou, Jiang Qian, Ronald L Schnaar, Ying Zhang,
Irwin J Gostein, Heng Zhu and Jonathan P Schneck, Lectin microarrays identify cell-specific and funtionally sigfinicant cell serface glycan marker, Oxford J Glycobiology
Vol 18(10), (2008), 761-769
INVESTIGATION, PURIFICATION AND CHARACTERISTICS OF LECTIN
FROM SOME KINDS OF PHASEOLUS VULGARIS L
Cao Dang Nguyen 1 , Nguyen Thi Cam Hanh 2
1
College of Sciences, Hue University
2
College of Polytechnic, Danang University
Abstract Investigation results from 6 kinds of Phaseolus vulgaris have showed that the
activity of lectin in the white bean core bush type white seeds was stronger than the others
