PCR lý thuyết docx

BS Đỗ Thị Thanh ThủyPCR POLYMERASE CHAIN REACTION NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG...  Kary Mullis mô tả 1983 Cetus Corporation 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”  Đạt Nobel Prize hóa học

TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy

PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU BÀI GIẢNG

1 Trình bày được nguyên tắc PCR

2 Trình bày được cách chống ngoại nhiễm

trong PCR

3 Trình bày được ứng dụng của PCR

 Kary Mullis mô tả 1983 ( Cetus Corporation)

 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”

 Đạt Nobel Prize hóa học 1993

 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng

khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao

PCRPOLYMERASE CHAIN REACTION

POLYMERASE CHAIN REACTION

PCRNGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG

35-40 chu kì nhiệt

Amplicon

Số copies = 2 n y

n: Số cycle y: số copies ban đầu

Số copies = 2 n y

n: Số cycle y: số copies ban đầu

Biến tính 92-96 o C

Bắt cặp 45-55 o C

POLYMERASE CHAIN REACTION

ĐỘNG HỌC CỦA PCR

NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

1 DNA đích (đoạn DNA quan tâm)

Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…,

µg (0,1-1 µg)g (0,1-1 µg (0,1-1 µg)g)

Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb)

2 Mồi (primers)

đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung

Mồi xuôi, mồi ngược (F, R)

5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC - TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’

3 DNA polymerase:

enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, k ỹ thuật đơn giản, đặc hiệu [C]: 1-2.5 units

Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích

- Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:

Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus

thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)…

- T ổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp

như Ampli Taq, Vent (exo)

- Tổng hợp men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai

(proofreading) khi tổng hợp chuỗi

nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)

như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu.

NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

4 dNTP (deoxy ribonucleotid):

dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µg (0,1-1 µg)M

5 Ion Mg ++ - cofactor c ủa enzyme

(II) Dựa theo hiệu ứng

Peltier ngược.

Hai thanh kim loại nối với

hai cực của nguồn điện và

được điều chỉnh tự động

để chiều dòng điện đi qua

có thể thay đổi: bên này

nóng, bên kia lạnh Khi

thay đổi chiều dòng điện thì

nhiệt độ của hai thanh

cũng thay đổi ngược lại:

bên này lạnh, bên kia nóng

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

MÁY LUÂN NHIỆT

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR

1 Khuếch đại DNA đích

2 Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon)

PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR

Điện di trên gel agarose

( submarine agarose gel electrophoresis)

phân loại DNA dựa vào kích thước

1 Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về

cực dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn.

2 Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu

trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV

Chu n b gel agarose ẩn bị gel agarose ị gel agarose

Chuẩn bị mẫu điện di :

– Ống DNA cần điện di (chứa 1 hoặc nhiều đoạn DNA

có kích thước khác nhau)

– Ống chứa thước đo (ladder, marker)

– Ống chứa dd đệm có màu (loading buffer)

– Chất phát quang (EtBr, SYBR G,…)

PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR

Chụp hình gel (đèn UV)

PCR

 Nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu

 Mẫu [-] thành [+]

 Mẫu [-] thành [+]

vì nhiễm amplicon (sản phẩm PCR)

 Hiểm họa

NGOẠI NHIỄM TRONG PCR

UDG

(Uracyl DNAse Glycosylase)

dUTP

PCR MIX PCR mix chứa hệ thống

PCR luôn khởi đầu 40 o C x 10min

DNA đích

chứa T

U bị UDG cắt bỏ

DNA đích chứa T

Avian myeloblastosis virus (AMV)

Moloney murine leukemia virus (M-MLV)

RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU

RNA

RT (37 o C - 40 o C/1h)

Reverse transcriptase

dNTP Buffer and MnCl2

PCR (30 - 40 thermal cycles)

cDNA

RT (37 o C - 40 o C/1h)

Reverse transcriptase

dNTP Buffer and MnCl2

PCR (30 - 40 cycles)

cDNA

RT SỬ DỤNG RANDOM PRIMER

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG PCR

1 Nhiệt độ biến tính và thời gian

2 Nhiệt độ bắt cặp và thiết kế đoạn mồi

3 Độ dài của đoạn mồi

4 Nhiệt độ giai đoạn kéo dài và thời gian

5 Số chu kỳ thực hiện

CHÚ Ý TRONG PCR

Khi thực hiện PCR

1 Chứng âm (Negative control)

Không cho DNA (thay bằng nước cất) Mục đích: Phân biệt có ngoại nhiễm hay không

2 Chứng dương (Positive control)

Có một lượng DNA đã biết trong phản ứngMục đích: Đảm bảo phản ứng tốt

ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

1 Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

2 Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền

3 Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư

4 Pháp y, quan hệ huyết thống…

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

1 Sản xuất thuốc

2 Sản xuất vaccin …

PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN VSV GÂY BỆNH

Bệnh phẩmChuẩn bị mẫu

Ly trích acid nucleic acid

PCRPhát hiện sản phẩm PCR

- Tác nhân không thể nuôi

cấy thường qui

- Tác nhân virus (HBV, HCV, SXH…)

- Tác nhân vi khuẩn

(Chlamydia, Legionella,…)

- Tác nhân VK nuôi cấy chậm

(M tuberculosis)

- Tác nhân VK nuôi cấy thất

bại (số lượng ít, hay đã bị điều trị KS trước đó)

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

Sản xuất Insulin

Yếu tố di truyền ngoài chromosomal

One cell with the

recombinant plasmid

A fermentor used to grow recombinant bacteria.

ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁP Y,

QUAN HỆ HUYẾT THỐNG

Short Tandem Repeats (STR)

Các trình tự lập lại ngắn từ 2-5 bp,

dùng để phân biệt DNA profile của

từng người Sự đa hình trong STR thể

hiện số copy của các đoạn lặp lại khác

nhau trong quần thể.

Ex: locus TH01 có 6 trình tự lập lại “TCAT”

CCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT AAA

- Có hơn 20 alleles chứa TH01 được biết

- Mỗi người được hưởng 1 allele từ cha hay mẹ

7 repeats

8 repeats

TCAT