TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HUỲNH QUANG VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang LỜI MỞ ĐẦU Trong thời đại ngày nay, hóa học phân tích đóng vai trị quan trọng phát triển ngành công nghệ kỹ thuật Bất ngành khoa học kỹ thuật cơng nghệ cần đến hóa học phân tích Tuy nhiên để phân tích đối tượng ta dùng nhiều phương pháp khác để đạt độ xác cao Một phương pháp phân tích sử dụng rộng rãi để xác định vết tạp chất khác hợp chất vô hữu phương pháp quang phổ huỳnh quang Đây phương pháp biết đến từ lâu việc xây dựng lý thuyết ứng dụng vào thực tế thực gần Chính thế, hướng dẫn thầy Lê Nhất Tâm với kiến thức học ghế nhà trường, chúng em định tìm hiểu sâu phương pháp quang phổ huỳnh quang ứng dụng thực phẩm Trong trình tìm hiểu khơng thể tránh khỏi thiếu sót, nhóm chúng em mong nhận ý kiến quý báo từ thầy bạn GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG Một chất hấp thụ lượng hệ electron phân tử bị kích thích, ta nói phân tử trạng thái kích thích Trạng thái kích thích trạng thái khơng bền, tồn khoảng 10-8 giây; có xu hướng trở trạng thái ban đầu; trở trạng thái ban đầu lại phải tỏa phần lượng hấp thụ Năng lượng giải tỏa dạng ánh sáng nên gọi tượng huỳnh quang Hiện tượng huỳnh quang biết từ lâu Song việc xây dựng lý thuyết tượng ứng dụng vào thực tiễn phát tính chất lượng tử ánh sáng Sự phát quang xảy dung dịch chất khí phát quang trung tâm rời rạc, phát quang xảy chất rắn (tinh thể) phát quang toàn chất tham gia vào biến đổi lượng hấp thụ thành ánh sáng Phương pháp huỳnh quang có nét đặc trưng quan trọng sau: Một phần lượng hấp thụ (gọi lượng kích thích) tất yếu phải chuyển thành dạng nhiệt, phần lượng lại giải tỏa dạng ánh sáng (Epq) phải nhỏ lượng hấp thụ (Eht) Như phát quang thường có hệ thức: Eht > Epq Hνht > hνpq c h λ ht > h c λpq với c tốc độ ánh sáng Suy λht < λpq Vậy phổ phát quang chuyển dịch phía bước sóng dài so với phổ hấp thụ chất GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang Để đo cường độ dòng ánh sáng huỳnh quang (I pq) ta đo phương tạo với tia tới (tia kích thích) góc 45 o hay 90o 135o … Để tránh ảnh hưởng tia truyền qua Cường độ dòng sáng phát quang bị ảnh hưởng yếu tố sau: Ảnh hưởng bước sóng ánh sáng kích thích Bức xạ huỳnh quang phát chất hấp thụ lượng (hν) đủ lớn (thường tia sáng vùng tử ngoại) để chuyển hệ electron phân tử lên trạng thái kích thích Nếu dùng ánh sáng kích thích có lượng lớn (λ ngắn) chuyển hệ electron phân tử lên trạng thái kích thích, lượng biến thành xạ huỳnh quang không đổi, lượng dư biến thành nhiệt Nếu tăng λ ánh sáng kích thích lên mà cường độ dịng huỳnh quang khơng đổi tức hiệu suất huỳnh quang (B = Epq / Eht) tăng lên Song tăng λht đến giới hạn vừa đủ để chuyển hệ electron phân tử lên trạng thái kích thích mà tăng lên lượng ánh sáng hấp thụ khơng đủ để kích thích phân tử nên phát quang tắt Hiện tượng Vavilop nghiên cứu phát biểu thành định luật sau: Khi tăng bước sóng ánh sáng kích thích hiệu suất huỳnh quang tăng lên, tăng đến giới hạn giảm xuống nhanh khơng bước sóng ánh sáng kích thích tiếp tục tăng Ảnh hưởng nồng độ Cường độ xạ huỳnh quang tỷ lệ với lượng chất huỳnh quang cường độ dịng sáng kích thích Ipq = K Io Cb Trong Ipq – cường độ dịng xạ huỳnh quang Io – cường độ dịng sáng kích thích K – hệ số, phụ thuộc vào chất phát quang độ dài sóng kích thích C – nồng độ chất phát quang dung dịch (mol/l) b – bề dày lớp dung dịch GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang Biểu thức cho thấy Ipq tăng tỉ lệ thuận với nồng độ chất phát quang (C) Song tỷ lệ tuân theo giới hạn nồng độ nhỏ (10-7 – 10-4 mol/l) Nếu nồng độ C tăng vượt giới hạn đó, cường độ phát quang tăng tắt hẳn, tắt xạ huỳnh quang tăng nồng độ gọi tắt huỳnh quang nồng độ Điều nồng độ lớn có hình thành tập hợp phần tử trung tâm không hấp thụ ánh sáng kích thích nên khơng phát quang Cũng nồng độ lớn khoảng cách trung tâm phát quang dung dịch giảm dẫn tới phần tử hấp thụ ánh sáng kích thích truyền phần lượng hấp thụ cho phần tử khác có dung dịch khơng chuyển lên trạng thái kích thích nên khơng phát quang Như phương pháp phân tích huỳnh quang dùng để phân tích hàm lượng nhỏ Ảnh hưởng nồng độ ion H+ dung môi Dung môi pH dung dịch có ảnh hưởng lớn tới khả phát huỳnh quang chất huỳnh quang, đặc biệt hợp chất nội phức tạo nên từ ion kim loại với phối tử hữu thay đổi dung mơi dẫn tới thay đổi độ bền liên kết phức tạo thành hợp chất phức sonvat Thay đổi pH dung dịch dẫn tới phá hủy phức hay tạo thành phức có thành phần khác khơng phát quang Vì phân tích phương pháp huỳnh quang cần phải nghiên cứu để chọn dung mơi giá trị pH tối ưu cho q trình xác định Ảnh hưởng nhiệt độ Thông thường nhiệt độ tăng khả phát huỳnh quang chất phát quang giảm Khi tăng nhiệt độ độ nhớt dung dịch giảm dẫn tới làm tăng độ dao động nội phân tử làm yếu liên kết phân tử, làm biến dạng phân tử hay phân li phân tử Những biến chuyển làm thay đổi tính chất huỳnh quang phân tử Ngược lại nhiệt độ thấp dao động phân tử giảm thực tế chuyển hóa dao động nhiệt, GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang hiệu suất cường độ huỳnh quang chất tăng lên, đặc biệt chất hữu phức kim loại với phối tử hữu phát quang tăng lên nhiều giảm nhiệt độ Có nhiều chất nhiệt độ thường không phát huỳnh quang, nhiệt độ thấp lại phát huỳnh quang mạnh Ảnh hưởng ion lạ Các chất lạ có mặt dung dịch gây ảnh hưởng lớn đến việc phân tích huỳnh quang Nhiều chất lạ làm tắt huỳnh quang; chẳng hạn Na 2SO3, Na2S2O3, KMnO4…, làm tắt huỳnh quang rezorafin Song lại có chất lạ làm tăng khả huỳnh quang, chẳng hạn ion SO 42- làm tăng tình huỳnh quang quinine… Các chất lạ gây ảnh hưởng hóa học hay vật lý khác chất huỳnh quang Do nghiên cứu tượng huỳnh quang, nghiên cứu phân tích định lượng cần phải nghiên cứu chặt chẽ ảnh hưởng ion lạ có dung dịch phân tích, ion lạ có tác dụng làm tăng khả phát quang cần tìm điều kiện lợi dụng tính chất để tăng độ nhạy phép phân tích Cịn với ion lạ có tác dụng làm giảm khả phát huỳnh quang chất phát quang cần tìm cách loại trừ chúng GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Cơng Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang CHƯƠNG PHỔ HUỲNH QUANG VÀ SỰ PHÁT QUANG HÓA HỌC Nhiều hợp chất vô hữu trạng thái lỏng trạng thái rắn, dạng phân tử hay dạng ion, dạng nguyên chất hay dung dịch phát ánh sáng chúng bị kích thích photon nằm vùng khả kiến vùng tử ngoại gần Ứng dụng phân tích cho tượng phát huỳnh quang Đây phương pháp có chọn lọc độ nhạy cao cho nhiều đại lượng đo Cường độ huỳnh quang tỉ lệ với nồng độ chất cần phân tích Thiết bị đo huỳnh quang quang phổ kế hay huỳnh quang kế Cường độ ánh sáng suy giảm nhanh dừng kích thích lên đối tượng phân tích ngược lại tượng tượng lân quang giảm từ từ theo thời gian Huỳnh quang sử dùng với detector ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng Mặt dù khác nguồn gốc, phát quang hóa học, bao gồm phát xạ ánh sáng phản ứng hóa học, củng có nhiều ứng dụng hóa học phân tích 2.1 Huỳnh quang tượng lân quang Nhiều hợp chất kích thích nguồn ánh sáng vùng khả kiến vùng tử ngoại gần hấp thu lượng không phát theo hình thức tia xạ Căn vào định luật Stokes, dãy phát xạ phổ lớn đặt chổ có chiều dài bước sống dài chiều dài bước sống ánh sáng kích thích ban đầu Hình 2.1 2.2 hợp chất huỳnh quang Sau kích thích, cường độ ánh sáng phân rã nhanh theo theo định luật hàm mũ: It =I0 exp[-kt] Trong : (2.1) It : Cường độ huỳnh quang GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang e Fluorescence t : Thời gian trơi qua tính từ lúc kích thích Absorbance Fluorescence Wavelength(nm) 235 diễn chiều dài bước 285 sống phổ thu335 Hình 2.1 Biểu xạ phổ huỳnh quang hợp chất ethylen Phát xạ phân loại thành huỳnh quang có cường độ giảm nhanh lân quang có phân rã xạ chậm nhiều Sự khác biệt đặc trưng số k Hằng số k huỳnh quang lớn nhiều so với số k lân quang Thời gian phát huỳnh quang t0 xác định thông qua biểu thức: t0 =1/k Tại thời điểm t0 , cường độ I1 tăng lên dựa vào biểu thức (2.1) tăng 36,8% so với cường độ ban đầu I0 Từ hợp chất huỳnh quang tương ứng nhỏ phải nhìn kính hiển vi đến tổng thể loại khác có 63,2% suy yếu đến trạng thái không phát xạ sau thời gian ngắn Thời gian sống huỳnh quang t0 khoảng vài nano giây Để đo huỳnh quang dễ dàng người ta dùng dụng cụ đo cường độ có tác dụng việc đo chế độ dừng Nếu nguồn kích thích trì GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang độ sáng mặt dù có phân biệt ánh sáng nguồn phát ánh sáng huỳnh quang Hình 2.1 minh họa cho ví dụ, biểu hấp thu xạ qua gương phổ huỳnh quang nhiều hợp chất 2.2 Nguồn gốc huỳnh quang Đối tượng để kích thích ánh sáng, phân tử (phân tử ,ban đầu trạng thái S0 ), nhảy lên trạng thái kích thích điện tử S1 (hình 2.2).Những điện tử phân tử chất hòa tan lân cận bị cân nhanh, nhiên chổ nhân nguyên tử vẩn đồng để giữ chúng trạng thái (Điều tuân theo nguyên tắc Franck-Condon) Hệ thống khung cấu tạo dung môi cân nhận hình thể ổn định liên quan đến trạng thái kích thích điện tử S1 Sau phương pháp biến đổi bên phân tử nối lại (10-12s) mà không cần phát photon để chuyển từ trạng thái V lên trạng thái S1 Nếu trạng thái thích hợp với trạng thái khung dung mơi yếu dần thông qua bậc huỳnh quang (10-11 đến 10-8s) Ngay sau phân tử trở lại trạng thái dao động trạng thái điện tử S0 với phát photon gọi huỳnh quang E S1 ( Vibrational relaxation) Non-radiative deactivation V4 V3 V2 V1 V0 V4 V3 V2 V1 V0 S0 Absorption Fluorescence T1 S0 Phosphorescence Hình : Biểu đồ so sánh mức lượng huỳnh quang GVHD: Lê2.2 Nhất Tâm Trang lân quang SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trường Đại Học Cơng Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang Những dãy huỳnh quang sau trở lại trạng thái ban đầu , phân tử giữ lại phần lượng hấp thu trạng thái lượng dao động Năng lượng dao động thừa bị tán xạ thông qua va đập cách thức khác mà không sinh xạ thiết bị làm giảm dao động Sự phát xạ photon có mức lượng thấp bị kéo dài trở huỳnh quang ban đầu vùng hồng ngoại Lân quang tương ứng với phương pháp làm giảm lượng khác Sau giai đoạn hấp thu, tương ứng với chuyển điện tử lên mức S (trạng thái đơn) ,một spin điện tử đảo ngược xảy giảm dao động đủ thấp dẫn đến trạng thái T Từ trạng thái này, chúng trở trạng thái điện tử chậm địi hịi spin đảo ngược cho điện tử này.Thời gian tồn xạ tăng lên khoảng thời gian vài phút Độ nhạy huỳnh quang thường cao 1000 lần so với phổ hấp thu vùng UV/Vis Tuy nhiên muốn sử dụng kĩ thuật địi hịi người sử dụng phải có kiến thức vững tượng để tránh sai số xảy Biphenyl(0.2) Fluorene (1) Naphthalene (0.55) COOH NH2 OH N OH Aniline (0.6) O O Fluorescein (0.92 in NaOH 0.1 M and 0.65 to pH=7) 8-Hydroxyquinoline Hình 2.3: Những hợp chất thơm chức huỳnh quang tiêu biểu GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang Trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm Tiểu luận PTTP PP Phân Tích Huỳnh Quang Huỳnh quang mạnh thêm diện nhóm dono điện tử chúng bị khử nhóm rút điên tử (hình 2.3) có lệ thuộc vào pH dung môi Ngược lại phân tử không bền dần lượng hấp thu chúng thông qua phân rã giảm dao động Tương tự, tượng so sánh với ảnh hưởng gây búa đập vào khối cao su chẳng hạn ngược lại mơt thứ cứng chẳng hạn đe Với cao su, lượng bị tán xạ thành khối nhiệt âm không phát Trên đe phần lượng học truyền bên ngồi sóng âm điều so sánh với tượng huỳnh quang phân tử bền không bền 2.3 Mối quan hệ huỳnh quang nồng độ Tại điểm dung môi cường độ huỳnh quang khác phần xạ kích thích hấp thụ trước tương tác với điểm xem xét phần ánh sáng xạ phát tìm thấy thân bị tắt trước khỏi tế bào Tổng thể huỳnh quang nhận detector tương ứng tới tổng huỳnh quang xuất từ toàn thể tích nhỏ riêng lẻ cấu thành khoảng trống giới hạn khe vào khe (hình 2.4) Đây tính tốn cường độ huỳnh quang tuyệt đối (sự phát xạ If) cho mẫu khó Hiện tượng xạ tắt dần gọi dập tắt bên che khuất phần phổ hấp thụ phổ phát xạ (sự dập tắt màu), làm tăng dịch chuyển lượng từ trạng thái kích thích đến phân tử khác thơng qua trao đổi lượng hình thành phức chất (sự dập tắt hóa chất) Đó lý có mặt oxi gây phát quang không mức GVHD: Lê Nhất Tâm SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT Trang 10