Luận án nghiên cứu đa hình đột biến gen cyp2c9, cyp2c19, cyp3a5 và cyp2d6 cytochrome p450 ở ngườ i kinh việt nam

1 MỞ ĐẦU Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc họ protein-heme lớn, enzyme có vai trị thiết yếu q trình chuyển hóa hợp chất nội sinh ngoại sinh Ở người, có 57 gen chức 58 gen giả báo cáo, CYP450 phân loại thành 18 họ 44 phân họ Hầu hết gen nhóm mang chức sinh học chuyển hóa chất nội sinh acid mật, eicosanoid steroid Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450 thuộc phân họ CYP1, CYP2 CYP3 tham gia chuyển hóa thuốc Phần lớn loại thuốc kê đơn lâm sàng chuyển hóa enzyme CYP450, ngồi có nhiều loại thuốc chuyển hóa CYP450 Có thể thấy, yếu tố nội sinh ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme CYP450 đóng vai trị quan trọng đến dược động học loại thuốc đưa vào thể Đối với số CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6, biến thể di truyền gen mã hóa cho protein có ảnh hưởng nhiều đến khác biệt hoạt tính enzyme, CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) tỉ lệ khơng đáng kể Các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính đa hình cao Sự đa dạng di truyền thể đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất với tần số (rare) phổ biến (common), ngồi cịn có biến thể số (Copy number variant-CNV) bao gồm mất/lặp đoạn Chức biến thể phân loại từ không chức đến tăng cường chức năng, từ mà kiểu hình chuyển hóa chia thành cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive Metabolizer-EM) chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid MetaolizerUM) Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A4/5 Năm gen CYP450 nói mã hóa cho enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% loại thuốc thường kê đơn Tính cấp thiết vấn đề nghiên cứu: Sự khác đáp ứng thuốc cá nhân điều khó tránh khỏi điều trị, có phản ứng có hại thuốc (Adverse drugs reaction/ADR) Các ADR nguyên nhân trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, số dẫn tới tử vong Ingelman-Sunberg cộng ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, nguyên nhân dẫn tới 100.000 ca tử vong năm Mỹ Khoảng 7% ca nhập viện Anh Thụy Điển có nguyên nhân từ ADR Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation ConsortiumCPIC) cung cấp thông tin việc xét nghiệm di truyền sử dụng tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc Đối với vài loại cặp gen-thuốc, CPIC đưa dẫn liều dùng cụ thể Như trình bày trên, gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 số gen CYP450 có tính đa hình cao mà dạng đa hình chúng khiến cho bệnh nhân có khả chuyển hóa loại thuốc cụ thể khác nhau, từ mạnh tới yếu Cho tới nay, hiểu biết đa dạng di truyền nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc người Việt Nam hạn chế Ngày nay, vai trò dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc tương tác thuốc lâm sàng mang tính cấp bách cần đầu tư nghiên cứu Hiểu biết tính đa dạng di truyền gen tham gia chuyển hóa thuốc người Việt Nam coi tiền đề để phát triển lĩnh vực Nghiên cứu tập trung vào việc phát allele biết xác định allele người Việt Nam Do vậy, số liệu thu từ nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học đa dạng di truyền gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Việt Nam Đây tiền đề có ý nghĩa đóng góp phần cho phát triển lĩnh vực di truyền dược học y học cá thể Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam - Xác định kiểu gen tần số allele 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Kinh Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức của các biế n thể mới Cách tiếp cận nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu 136 người Kinh khỏe mạnh khơng có quan hệ huyết thống Nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất biến thể nằm vùng promoter với tất exon vùng biên 03 gen CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình tự Sanger áp dụng nhằm xác định biến thể cơng bố có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bao gồm: *3, *6, *8 *9 Các CNV gen nghiên cứu xác định phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA) Những mẫu xác định có bất thường số kiểm tra lại phương pháp Long range PCR real-time PCR Các biến thể sau xác định tiếp tục tổng hợp số liệu để tính tốn tần số allele tần số kiểu gen tổng số mẫu nghiên cứu gen Tiến hành so sánh tần số phân bố allele gen quần thể người Kinh Việt Nam so với quần thể người khác Bên cạnh đó, biến thể tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán ảnh hưởng biến thể đến chức protein tương ứng Những đóng góp luận án: Xác định số biến thể promoter intron gen CYP450, cụ thể: biến thể in tron CYP2C9, biến thể intron CYP2C19, biến thể promoter biến thể intron CYP2D6 biến thể thuộc vùng mã hóa gen CYP2C9 CYP2D6 Đã phân tích in silico cho thấy biến thể gây ảnh hưởng có hại đến chức protein Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 CYP2D6*36-*10 xác định người Kinh Việt Nam biến thể làm giảm hoạt tính enzyme xác định với tỉ lệ là: 8,09%, 43,75%, 1,547% 12,13% CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CYP450 chuyển hóa thuốc gan Thuốc chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phịng-chữa bệnh hay điều trị giảm nhẹ Enzyme chuyển hóa thuốc biết đến nhiều enzyme CYP450, enzyme tham gia vào trình oxi hóa khử thủy phân Mục tiêu q trình chuyển hóa thuốc giúp đào thải thuốc khỏi thể Ví dụ tiền chất (khơng có hoạt tính dược lý) sau hấp thụ vào thể chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính Mặt khác đa số loại thuốc sau chuyển hóa chuyển sang trạng thái hoạt động Q trình chuyển hóa thuốc xảy nhiều quan thể gan, thành ruột, phổi, thận huyết tương Trong số đó, gan quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng vai trị vị trí thải độc loại thải chất ngoại lai cách biến đổi hợp chất tan lipid trở nên ưa nước hơn, q trình có tham gia enzyme Q trình chuyển hóa thuốc gan trải qua giai đoạn: pha I, pha II pha III Trong pha I có tham gia enzyme CYP450, pha II thực enzyme vận chuyển acid glucuronic UDP (UDP-glucuronosyltransferase) (chuyển hóa 40-70% loại thuốc) pha III enzyme vận chuyển thuốc (drug transporter) giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật Klingenberg lần phát CYP450 vào năm 1954 nghiên cứu chuyển hóa hoocmon steroid, ơng trích xuất loại protein từ tế bào gan [1] Gần thập kỷ sau, chức tầm quan trọng CYP450 xác định Năm 1963, Estabrook cộng mơ tả vai trị CYP450 chất xúc tác trình tổng hợp hormone steroid chuyển hóa thuốc Cooper đồng nghiệp sau xác nhận CYP450 enzyme chủ chốt liên quan đến phản ứng hydroxyl hóa thuốc steroid [2] Nhiều protein CYP450 phát rộng khắp thể, chứng tỏ tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính gây ung thư [3] Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I protein biểu chủ yếu mạng lưới nội chất trơn ti thể tế bào gan biểu mơ ruột non (ngồi cịn số quan khác) Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm gen giả, đặt tên CYP1A1 kết thúc CYP51P3 Các protein mã hóa CYP450 phân loại dựa mức độ tương đồng trình tự amino acid thành cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1, CYP2D6…) Trong số CYP450 biểu gan CYP3A4 có mức độ biểu mạnh (chiếm 22,1%), enzyme CYP2E1 (15,3%) CYP2C9 (14,6%) tính tổng số protein gan Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vịng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất khơng vịng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy) Trong số phản ứng này, phản ứng oxi hóa phản ứng giúp thêm nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, biểu diễn phương trình sau: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH Về mặt cấu trúc, CYP450 protein có khoảng 400-500 amino acid chứa nhóm heme với nguyên tử Fe trung tâm Tất CYP450 có chung cấu trúc bảo thủ tạo nên bốn vòng xoắn D, L, I E Trong nhóm heme nằm vịng xoắn I L Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn CYP450 có tính bảo thủ cao, có đa dạng cấu trúc họ CYP450 khác từ cho phép protein kết hợp với chất với kích thước khác mức độ đặc hiệu khác Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao q trình oxi hóa chất, CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa 50% loại thuốc thị trường Ở mức độ đơn giản mặt cấu hình nhận biết kết hợp với chất có vị trí nhận biết chất (Substrate recognition site-SRS) Các vị trí bao gồm vùng xoắn B' (SRS1), phần chuỗi xoắn F G (SRS2 SRS3), phần chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 chuỗi xoắn K (SRS6) cấu trúc kẹp tóc β4 (SRS5) trung tâm hoạt động CYP450 (Hình 1.1) Trên thực tế, SRS định trước tính đặc hiệu chất CYP450 đột biến điểm xảy vị trí ảnh hưởng đến độ đặc hiệu chất [4] Các SRS vùng cấu trúc linh hoạt, di chuyển kết hợp với chất có khả cảm ứng phù hợp với chất, từ tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết enzyme-cơ chất sau phản ứng xúc tác [5] Hình 1.1 Cấu trúc CYP450 vị trí nhận biết chất (SRS) [6] CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ thể vòng xoắn (đánh dấu chữ in hoa) Các SRS tô đậm tối màu 1.2 Đa dạng di truyền gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc Các gen chuyển hóa phần hệ gen dược học Đây gen đóng vai trị quan trọng biến đổi sinh học thuốc, thay đổi di truyền gen góp phần tạo nên khác biệt cá thể đáp ứng thuốc [7] Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I pha II Các enzyme chuyển hóa thuốc có mức độ đa hình cao biểu hoạt tính chúng Các CYP450 nguồn gốc gây đa dạng dược động học dược lý học thuốc Các protein CYP450 biểu mạnh gan bao gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 CYP1A2 Trong protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 CYP3A5 biểu Các CYP450 khác CYP2J2, CYP1A1 CYP1B1 biểu chủ yếu gan Các kiểu đa hình di truyền khác gen CYP450 định mặt chức kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM UM) Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A4/5 Năm gen CYP450 nói mã hóa cho enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% loại thuốc thường kê đơn Trong số protein thuộc 18 họ CYP450, protein có tính đa hình cao CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 CYP2C19 Bên cạnh có số protein CYP450 thuộc phân họ khác có tính đa hình thấp CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1 Về chức chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường nhất, enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 CYP2E (Hình 1.2) Phần tổng quan trình bày khái quát đa hình 04 gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 Hình 1.2 Đa dạng di truyền gen CYP450 vai trò chuyển hóa thuốc [8] (a)Số lượng SNP số gen CYP450 (b) Số lượng thuốc chuyển hóa enzyme CYP450 Các số biểu đồ thể số lượng SNP/thuốc chuyển hóa 1.2.1 Gen CYP2C9 Gen CYP2C9 nằm vai dài nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có 490 amino acid có khối lượng phân tử 55,6 kDa Vùng gen chứa CYP2C9 bao gồm gen mã hóa cho enzyme CYP2C8, CYP2C18 CYP2C19 Trong số gen này, CYP2C9 gen biểu mạnh tham gia nhiều vào q trình chuyển hóa thuốc Trên thực tế, liệu khối phổ cho thấy CYP2C9 chiếm 20% tổng số protein CYP450 gan Ngoài gan, CYP2C9 biểu đường tiêu hóa Sau CYP3A4 CYP2D6, CYP2C9 enzym quan trọng thuộc họ cytochrome 450 tham gia vào phản ứng oxi hóa chuyển hóa khoảng 15% loại thuốc lưu hành bao gồm số thuốc có số trị liệu hẹp [9] Sự khác biệt cá thể biểu hoạt tính enzyme CYP2C9 ảnh hưởng tới hiệu sử dụng an toàn dùng thuốc Các phản ứng tương tác thuốc xảy ức chế hay kích hoạt CYP2C9 đa hình di truyền gen nguyên nhân gây nên đa dạng hoạt tính enzyme cấp độ in vivo [10, 11] *Cơ chất đặc hiệu CYP2C9 CYP2C9 tham gia vào trình oxi hóa nhiều loại thuốc, đồng thời tham gia chuyển hóa nhiều hợp chất nội sinh thể acid linoleic, acid arachidonic chất ngoại sinh thuốc khác (galangin, methiocarb, pyrene, sulprofos) Phần lớn chất CYP2C9 hợp chất dạng acid yếu, nhiên CYP2C9 chuyển hóa dạng N-demethylation số loại thuốc amitriptyline, fluoxetins zopiclone S-flurbiprofen, S-wafarin, tolbutamide, phenytoin, losartan diclofenac chất CYP2C9 Trong đó, Diclofenac tolbutamide chất thường xuyên sử dụng nghiên cứu đánh giá kiểu hình hoạt tính enzyme Nói chung, loại thuốc chất chuyển hóa CYP2C9 phân làm nhóm thuốc chống đơng máu, thuốc hạ huyết áp, thuốc kháng viêm steroid thuốc hạ đường huyết dạng uống *Đa hình di truyền CYP2C9 phân bố quần thể giới Allele CYP2C9*2 (3608C>T, p.Arg144Cys) *3 (42614A>C, p.Ile359Leu) allele nghiên cứu nhiều nhất, đồng thời allele nghiên cứu rộng rãi tren nhiều quần thể người [12] Đối với allele CYP2C9*2 *3, kết nghiên cứu cho thấy biến thể làm giảm chuyển hóa S-warfarin tolbutamide in vitro Đồng thời bệnh nhân có mang biến thể có liên quan chặt chẽ đến việc sử dụng warfarin với liều thấp liều thông thường tăng nguy chảy máu [13] Một số allele khác phổ biến xác định, nhiên ngày nhiều liệu biến thể di truyền CYP2C9 giới nhờ kĩ thuật phát triển mạnh mẽ giải trình tự tồn hệ gen hệ gen biểu CYP2C9*3 allele phổ biến nước Nam Á CYP2C9*2 xuất nước Đông Á Trong biến thể gây sai nghĩa dịch khung đọc mở có thiên hướng CYP2C9*9 allele phổ biến so với *2 *3 quần thể châu Phi Tương tự, CYP2C9*11 có tần số xuất châu Phi cao gấp 10 lần so với châu Âu *11 *12 allele phổ biến châu Âu sau *2 *3 Như nói, nước khu vự Đơng Á có *3 allele phổ biến xuất *2 khu vực Trên thực tế, CYP2C9*52 (33498C>G, p.Thr299Arg)-một biến thể gây sai nghĩa biến thể khu vực Đông Á sau *3 [14] Khu vực nam Ấn Độ xuất allele *2, *3 *14 (2%)-đây allele xuất quần thể khác giới Trong nghiên cứu quần thể người khác Mexico, allele CYP2C9*2 xuất quẩn thể với tần số cao so với khu vực Đông Á CYP2C9*3 xuất quần thể với tần số từ 3.7%-10.4% [15] Kết phù hợp với tình trạng dân tộc có nguồn gốc pha trộn châu Á châu Âu quần thể khu vực Các biến thể gây dịch khung hiếm, allele CYP2C9*6 bị xóa nucleotide exon công bố [16] Biến thể gây nên protein tổng hợp không hồn chỉnh khơng có hoạt tính, tần số xuất biến thể châu Phi 1% thấy quần thể người khác Việc giải trình tự CYP2C9 số quần thể độc lập tiến hành Ví dụ, nghiên cứu người Alaska địa Ấn-Mỹ cho thấy CYP2C9*2 *3 người Yupik xuất với tần số thấp hơp so với chủng tộc người khác Alaska Trong khu vực Đông Á, CYP2C9*29 chiếm 2% tộc người Yupik, ngồi tộc người cịn xuất biến thể p.Met1Leu (6%) p.Asn218Ile (4%) [17] Với việc thực nghiên cứu giải trình tự quần thể người, nhà khoa học phát thêm biến thể CYP2C9 Sự phân bố số biến thể sai nghĩa dịch khung CYP2C9 thể chi tiết Hình 1.3 10 Hình 1.3 Các biến thể sai nghĩa dịch khung CYP2C9 [18] Gen CYP2C9 mã hóa cho protein bao gồm 490 amino acid (khối lượng 55,6 kDa) Gen CYP2C9 bao gồ m exon, nằm cụm gen bao gồm số gen CYP450 thuộc nhiễm sắc thể số 10 Cơ sở liệu đa dạng di truyền gen dược học (Pharmacogene variationPharmVar) công bố 62 biến thể CYP2C9 Trong số có biến thể gây giảm (*2, *3), hồn tồn hoạt tính enzyme (*6, *15, *25) với số biến thể khác chưa rõ chức (như *13) Có số nghiên cứu đa hình CYP2C9 vùng trình tự điều khiển gen (khoảng 10.000 base ngược chiều với trình tự khởi đầu dịch mã) Tổng quát lại, nghiên cứu cho thấy đa hình vùng mã hóa góp phần quan trong khác biệt hoạt tính enzyme có phát thú vị biến thể vùng trình tự khơng mã hóa Các biến thể vùng khơng mã hóa ảnh hưởng chúng tới chức protein quan tâm nhiều cá thể mà khơng có đa hình tìm thấy vùng mã hóa Biến thể -1188C>T (rs4918758) báo cáo vài nghiên cứu người châu Âu, Bắc Mỹ Nhật Bản Mặc dù vậy, chưa có chứng cho thấy -1188C>T làm thay đổi trình phiên mã ảnh hưởng tới liều dùng wafarin [19] Biến thể -2663delTG (rs71486745) nằm vùng trình tự kết hợp với yếu tố phiên mã Nrf2 xuất phổ biến cá thể không mang đa hình CYP2C9 vùng mã hóa Xa phía vùng 5’ CYP2C9, biến thể -4302C>T (rs12251841) tìm thấy người Mexico lại khơng xuất người Mĩ trắng khơng có nguồn gốc Latin [19] Biến thể 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 FVN111 FVN112 FVN113 FVN114 MVN01 MVN03 MVN 04 MVN 05 MVN 06 MVN MVN MVN MVN 10 MVN 11 MVN 12 MVN 13 MVN 14 MVN 15 MVN 16 MVN 17 MVN 18 MVN 19 MVN 20 MVN 21 MVN 22 MVN 23 MVN 24 MVN 25 MVN 26 MVN 27 MVN 28 MVN 29 MVN 30 MVN 31 MVN 32 MVN 33 MVN 34 MVN 35 MVN 36 MVN 37 Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh 76,8 87,6 114,2 55,7 25,4 38,3 42,2 39,3 19,4 53,4 42,6 33,6 29,7 53,8 68,6 21,7 123,1 94,8 106,5 44,7 40 57,8 106,7 55,6 88,5 60,1 113,9 111,6 92,2 83 73,1 152,9 44,5 94,9 74,7 26,6 26,1 92,6 51,2 129,5 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 MVN 38 MVN 39 MVN 40 MVN 41 MVN 42 MVN 43 MVN 44 MVN 45 MVN 46 MVN 47 MVN 48 MVN 49 MVN 50 MVN 51 MVN 52 MVN 53 MVN 54 MVN 55 MVN 56 Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh 44,1 36,6 27,7 84,3 116,6 115,2 90 86,7 29,8 31,7 25,5 40,7 30 35 43,8 53,6 58,1 32,6 40,8 Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2C9 STT Name Position ObsHET PredHET HWpval 251 0,02 0,0101 251T>C 3235G>C 3235 0,01 0,01 3411T>C 3411 0,01 0,01 3415C>T 3415 0,01 0,01 9032G>C 9032 0,05 0,049 10311A>G 10311 0,06 0,058 10376T>C 10376 0,01 0,01 33622T>C 33622 0,01 0,01 38658A>G 38658 0,01 0,01 10 42614A>C 42614 0,07 0,068 11 42627C>A 42627 0,02 0,02 12 42726C>T 42726 0,06 0,058 13 42801A>G 42801 0,01 0,01 14 47543delT 47543 0 Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2C19 STT Name Position ObsHET PredHET HWpval (-)806C>T -806 0,02 0,02 (-)98T>C -98 0,398 0,354 0,3679 12637C>G 12637 0,01 0,01 12662A>G 12662 0,37 0,326 0,3161 17948G>A 17948 0,061 0,059 19154G>A 19154 0,35 0,326 0,727 57637delG 57637 0 57678T>G 57678 0,01 0,01 57740C>G 57740 0,394 0,351 0,3839 10 80160C>T 80160 0,41 0,36 0,2769 11 80161A>G 80161 0,06 0,058 12 87106T>C 87160 0,43 0,439 0,9749 13 87313A>C 87313 0,07 0,068 14 90008C>T 90008 0,01 0,01 Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2D6 STT Name Position ObsHET PredHET HWpval (-740) C>T -740 0,178 0,186 0,8467 (-678) G>A -678 0,193 0,231 0,1204 (-498) C>A -498 0,096 0,131 0,034 (-184) A>T -184 0,007 0,007 (-175) A>T -175 0,074 0,071 100C>T 100 0,311 0,449 7.00E-04 137insT 137 0 214G>C 214 0,17 0,18 0,7685 221C>A 221 0,176 0,185 0,8386 10 223C>G 223 0,147 0,161 0,5393 11 227T>C 227 0,176 0,196 0,4066 12 232G>C 232 0,206 0,251 0,085 13 233A>C 233 0,147 0,196 0,0221 14 245A>G 245 0,14 0,155 0,4715 15 310G>T 310 0,132 0,327 3,98E-10 16 1039C>T 1039 0,221 0,409 3,43E-07 17 1661G>C 1661 0,301 0,348 0,1787 18 1759G>A 1759 0,015 0,015 19 1846G>A 1846 0,022 0,022 20 2097A>G 2097 0,353 0,443 0,0275 21 2137G>C 2137 0,007 0,007 22 2607G>A 2607 0,022 0,05 0,0029 23 2611T>A 2611 0,007 0,007 24 2851C>T 2851 0,213 0,256 0,1084 25 2988G>A 2988 0,044 0,043 26 3157G>T 3157 0,007 0,007 27 3384A>C 3384 0,14 0,486 1,40E-17 28 3790C>T 3790 0,051 0,34 1,33E-20 29 3851G>A 3851 0,015 0,015 30 4181G>C 4181 0,082 0,49 1,92E-24 Phụ lục Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng LR-PCR (Tham khảo từ Hersberger cộng sự, 2000) Tên mồi Vị trí Trình tự mồi Vị trí Dup 43 5'-CACACCGGGCACCTGTACTCCTCA-3' 66 Dlow 7846 5'-CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC-3' 7822 DPKup -259 5'-GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3' -232 DPKlow 4844 5'-GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA-3' 4819 Vị trí mồi đánh số dựa trình tự tham chiếu gen CYP2D6 (GenBank Accession No M33388) Riêng mồi Dup nằm vùng nối gen CYP2D7 CYP2D6 (GenBank Accession No X90926) Phụ lục Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự Sanger Gen CYP2C9 Vùng gen Trình tự mồi Promoter Exon 5'-AGGGGGTTTAATGGTAAAGGTGT-3' 5'-TGCTGACCAGATCCCACAATA-3' Exon 5'-GCAAGTATAATCATCATCATGGTTTCTATT-3' Exon 5'-CTCTCAGCTTCAAACCCCC-3' Exon 5'-ATGCATGCCGAACTCTTTTT-3' Exon 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3' Exon 5'-TTTGGGCAAGTTGGTCTACA-3' Exon 5'-CACATTTGTGCATCTGTAACCA-3' Exon 5'-TGGAAATGGTACTGCCCTTC-3' Exon 5'-CCCATCCACCCATCTATCTC-3' Promoter Exon 5'-TCCTGCCTTCACGTGTTTTT-3' 5'-TAGTGGGCCTAGGTGATTGG-3' Exon 5'-AGTCAGGCTTAGTAAATGGA-3' CYP2C19 Exon 5'-ATCTCCCTCCTAGTTTCGT-3' Exon 5'-ATGCATGCCAAACTCTTTTT-3' Exon 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3' Exon 5'-AGCCAAAGACAAAAACCACATC-3' CYP2D6 CYP3A5 Exon 5'-TGATGTTTGGATACCTTCATCAT-3' Exon 5'-CTGCTCTTCTTTGGAATGGTG-3' Exon 5'-GATGACGGGTCAGAAGAAGC-3' Promoter Exon 5'-CCAGTGCTTCTAGCCCCATA-3' 5'-ACTGGCAGCACAGTCAACAC-3' Exon 5'-CTCCTTCCACCTGCTCACTC-3' Exon 5'-CAAGGTGGATGCACAAAGAG-3' Exon 5'-AAGAAGTCGCTGGAGCAGTG-3' Exon 5'-GGCCAAGGACTCTGTACCTCCTA-3' Exon 5'-GGCAGAGATGGAGGTGA-3' Exon 5'-CGTGAGCCCATCTGGGAAA-3' Exon 5'-CAGCAGGGAGGTGAAGAAGA-3' Exon 5'-TGCTCAGCCTCAACGTACCCCT-3' *3 *6 5'-CTTGCAGCATTTAGTCCTTGTGAG-3' 5'-GACAGCTAAAGTGGTGAGGG-3' *8 5'-CTTGACCATTCCAGTTCCTGA-3' *9 5'-ATG CTT CTGCCAGTAGCAAC-3' Phụ lục Dữ liệu MLPA CNV gen CYP2D6 số mẫu nghiên cứu Tên mẫu Vị trí đầu dò kit MLPA cho CYP2D6 tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio) Exon Exon Exon Exon FVN19 1,59 1,65 1,65 1,07 FVN22 0,81 0,95 1,01 FVN23 0,86 1,01 0,93 0,99 FVN30 1,35 1,63 1,58 0,91 FVN50 0,73 0,74 0,7 1,39 FVN69 0,41 0,38 0,36 0,49 FVN74 1,58 1,56 1,54 1,02 FVN76 0,57 0,62 0,94 0,77 FVN86 0,71 0,77 0,72 1,41 FVN87 1,45 1,47 1,49 0,56 FVN92 0,46 0,43 0,46 0,64 FVN94 1,47 1,37 1,57 0,53 MVN 03 1,85 1,96 1,94 0,96 MVN 09 0,48 0,58 0,55 0,63 MVN 26 0,61 0,67 0,6 MVN 37 1,76 1,83 1,69 1,07 MVN 41 0,97 1,03 1,05 MVN 42 1 0,99 1,07 Các vị trí đầu dị đánh dấu màu vàng: tăng số CYP2D6 Các vị trí đầu dị dánh dấu màu xanh: số CYP2D6 Phụ lục Tổng hợp số liệu kiểu gen kiểu hình chuyển hóa thuốc gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 mẫu nghiên cứu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Mã mẫu FVN01 FVN02 FVN03 FVN04 FVN05 FVN06 FVN07 FVN08 FVN09 FVN10 FVN11 FVN12 FVN13 FVN14 FVN15 FVN16 FVN17 FVN18 FVN19 FVN20 FVN21 CYP2C9 Kiểu gen Kiểu hình *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*3 IM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM CYP2C19 Kiểu gen Kiểu hình *1/*3 IM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*2 IM *1/*2 IM *1/*2 IM *1/*2 IM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*3 IM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*3 IM *1/*1 EM *1/*2 IM *1/*2 IM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*1 EM *1/*2 IM CYP2D6 Kiểu gen *10/*15 *10/*10 *60/*60 *1/*10 *5/*10 *10/*10 *5/*36-*10 *10/*10 *2/*10 *1/*1 *10/*36-*10 *2/*10 *10/*36-*10 *1/*10 *10/*10 *2/*68-*4 *10/*10 *10/*10 *10/*36-*10 *5/*36-*10 *1/*2 Kiểu hình IM IM PM IM IM IM ND IM ND EM ND ND ND IM IM ND IM IM ND ND EM CYP3A5 Kiểu gen Kiểu hình *1/*3 IM *1/*3 IM *1/*3 IM *1/*3 IM *3/*3 PM *1/*3 IM *3/*3 PM *1/*3 IM *3/*3 PM *1/*3 IM *3/*3 PM *3/*3 PM *3/*3 PM *1/*3 IM *1/*3 IM *1/*1 EM *1/*3 IM *1/*3 IM *3/*3 PM *3/*3 PM *1/*3 IM 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 FVN22 FVN23 FVN24 FVN25 FVN26 FVN27 FVN28 FVN29 FVN30 FVN31 FVN32 FVN33 FVN34 FVN35 FVN36 FVN37 FVN38 FVN39 FVN40 FVN41 FVN42 FVN43 FVN44 FVN45 FVN46 FVN47 FVN48 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *2/*2 *1/*1 *1/*1 *2/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 EM IM EM IM IM EM EM IM EM IM EM IM EM EM IM EM IM EM EM IM PM EM EM PM EM EM EM *10/*10 *1/*2 *10/*10 *2/*65 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*2 *1/*10 *1/*36-*10 *13/*10 *5/*10 *5/*36-*10 *1/*5 *1/*10 *10/*36-*10 *2/*10 *36-*10/*36-*10 *1/*36-*10 *2/*10 *10/*10 *10/*10 *4/*10 *10/*10 *10/*10 *1/*1 *2/*10 *10/*10 IM EM IM IM ND IM EM IM ND IM IM ND IM IM ND ND ND ND ND IM IM ND IM IM EM ND IM *3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 PM PM PM PM PM EM PM PM PM PM EM IM PM EM PM PM IM PM IM IM EM PM PM IM PM IM IM 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 FVN49 FVN50 FVN51 FVN52 FVN53 FVN54 FVN55 FVN56 FVN111 FVN112 FVN113 FVN114 MVN 01 MVN 03 MVN 04 MVN 05 MVN 06 MVN MVN MVN MVN 10 MVN 11 MVN 12 MVN 13 MVN 14 MVN 15 MVN 16 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *2/*17 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*2 EM EM EM EM IM EM EM EM IM IM EM EM EM EM EM EM IM EM IM IM EM EM IM EM EM IM IM *1/*5 *1/*10 *1/*10 *1/*10 *1/*1 *1/*10 *1/*1 *10/*10 *1/*10 *10/*10 *10/*10 *1/*2 *5/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*10 *1/*10 *10/*65 *10/*10 *5/*10 *5/*10 *5/*10 *10/*36-*10 *10/*36-*10 *10/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*36-*10 *1/*5 IM IM IM EM IM EM IM IM IM IM EM IM ND IM IM IM IM IM IM IM ND ND IM ND ND IM *1/*1 *1/*3 *1/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 EM IM IM EM IM PM PM IM IM IM IM PM IM IM IM PM IM PM EM IM PM IM PM PM PM IM PM 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 MVN 17 MVN 18 MVN 19 MVN 20 MVN 21 MVN 22 MVN 23 MVN 24 MVN 25 MVN 26 MVN 27 MVN 28 MVN 29 MVN 30 MVN 31 MVN 32 MVN 33 MVN 34 MVN 35 MVN 36 MVN 37 MVN 39 MVN 41 MVN 42 MVN 43 FVN75 FVN77 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/Del *1/*3 *1/Del *1/Del *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 - IM EM EM EM ND IM ND ND EM EM EM EM EM EM IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM - *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *2/*2 *2/*17 *1/*1 *2/*3 *1/*2 *1/*2 *1/*1 - EM EM IM EM EM IM EM IM EM EM EM IM EM IM IM IM EM EM PM IM EM PM IM IM EM - *5/*13-*2 *10/*67 *65/*36-*10 *5/*36-*10 *36-*10/*36-*10 *1/*10 *1/*2 *10/*36-*10 *1/*1 *5/*36 *10/*10 *10/*65 *2/*10 *1/*10 *1/*5 *5/*13-*1 *5/*65 *2/*10 *1/*10 *10/*10 *10/*36-*10 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*14 *10/*10 *1/*10 *2/*65 ND ND ND ND ND IM EM ND EM PM IM IM ND IM IM ND IM ND IM IM ND ND IM ND IM IM IM *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*1 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *3/*3 - PM IM PM IM PM IM IM IM PM IM EM IM IM IM PM EM IM IM PM PM PM EM PM PM PM - 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 FVN78 FVN79 FVN80 FVN82 FVN83 FVN84 FVN85 FVN86 FVN87 FVN89 FVN90 FVN91 FVN92 FVN93 FVN95 FVN96 FVN97 FVN98 FVN99 MVN 38 MVN 40 MVN 44 MVN 45 MVN 46 MVN 47 MVN 48 MVN 49 - - - - *1/*10 *1/*1 *2/*65 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*10 *10/*36-*10 *4/*13-*1 *5/*36-*36-*10 *1/*10 *2/*10 *5/*13-*2 *2/*5 *10/*36-*10 *13/*10 *1/*2 *10/*36-*10 *10/*10 *5/*36-*10 *10/*10 *10/*10 *10/*65 *10/*10 *1/*1 *10/*10 *1/*1 *2/*10 IM EM IM ND IM IM ND ND ND IM ND ND ND ND IM EM ND IM ND IM IM IM IM EM IM EM ND - - 130 131 132 133 134 135 136 MVN 50 MVN 51 MVN 52 MVN 53 MVN 54 MVN 55 MVN 56 - - Chú thích: EM: Chuyển hóa thuốc bình thường IM: Chuyển hóa thuốc trung bình PM: Chuyển hóa thuốc yếu ND: Chưa biết - - *10/*10 *1/*86 *1/*10 *10/*10 *10/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*10 IM IM IM IM IM ND IM - - ... truyền số gen CYP450 ngư? ?i Việt Nam phạm vi nghiên cứu luận án 1.6.1 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền gen CYP450 Việt Nam gi? ?i Ở Việt Nam, nghiên cứu đặc ? ?i? ??m di truyền gen liên quan đến... công bố biến thể tồn tồn gen CYP2D6 ngư? ?i Việt Nam 1.6.2 Phạm vi nghiên cứu luận án Dân tộc Kinh dân tộc v? ?i tỉ lệ chiếm 86.2% tổng dân số coi đ? ?i diện cho quần thể ngư? ?i Việt Nam Ngư? ?i Kinh sống... CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 CYP3A5 ngư? ?i Việt Nam [102-107] Các nghiên cứu tập trung vào đa hình biết gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme gen n? ?i trên ngư? ?i Việt Nam Cụ thể, nghiên cứu