Luận án nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (penaeus monodon) việt nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm

1 MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) lồi tơm có kích thước lớn coi lồi thủy sản nuôi kinh tế quan trọng nhiều nước giới Ở Việt Nam, tôm sú tiếp tục đối tượng nuôi chủ lực cho xuất thủy sản đem ngoại tệ cho đất nước Diện tích sản lượng tơm nước lợ nước ta ngày tăng Nhu cầu tôm giống năm 130 tỷ (trong có 30 tỷ giống tơm sú) Năm 2016, diện tích ni tôm 649.645 với sản lượng 657.282 tấn, giá trị xuất đạt 3,15 tỷ USD Đến năm 2025, mục tiêu xuất tôm Việt Nam đạt 10 tỷ USD; sản lượng 1,1 triệu quy mô 750.000 ha; nhu cầu tôm bố mẹ khoảng 500.000 - 600.000 con, nhu cầu tơm sú bố mẹ 100.000 con/năm (https://laodong.vn) Chiến lược phát triển ngành nuôi tôm sú Việt Nam quốc gia ni tơm giới có ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái Nền tảng cho chiến lược trọng phát triển nguồn tơm địa với chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống tăng trưởng Để đạt mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc chức toàn hệ gen tôm sú vấn đề khoa học có định hướng ứng dụng quan trọng Những nghiên cứu chi tiết genome, transcriptome, proteome đồ gen tôm sú cung cấp thông tin sinh học quan trọng giúp cho việc xác định tính trạng cần thiết tính kháng bệnh, tính chống chịu điều kiện bất lợi môi trường, tính trạng định suất chất lượng tôm Các thị phân tử (CTPT) thơng tin khác có từ việc nghiên cứu hệ gen lập đồ gen tơm sú có vai trị quan trọng cơng tác chọn giống phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm thương phẩm Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen tôm sú để phục vụ cho mục tiêu nói trên, nghiên cứu đa dạng di truyền hướng nghiên cứu quan tâm có ý nghĩa ứng dụng thiết thực thành công chiến lược quản lý lâu dài bền vững nguồn lợi thủy sản Ngày nay, CTPT ngày trở thành công cụ hữu hiệu ứng dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng đồ di truyền, ứng dụng nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, bệnh Trong số đó, thị đa hình chiều dài đoạn khuếch đại chọn lọc (AFLP) xem kỹ thuật đại hiệu cho phép đưa nhanh chóng xác ước lượng độ đa dạng di truyền quần thể với Nhiều kỹ thuật CTPT khác xây dựng để phát triển thị DNA sử dụng rộng rãi cho nhiều mục đích nghiên cứu Tùy thuộc vào mục đích cụ thể để lựa chọn loại CTPT phù hợp Đối với mục tiêu chọn giống, đa hình nucleotide đơn (SNP) xem loại CTPT hiệu phổ biến để chọn tính trạng quan trọng liên quan đến suất chất lượng giống Với mạnh vượt trội, CTPT ngày sử dụng công cụ chọn lọc đắc lực tính trạng quan tâm chương trình chọn giống nhiều lồi vật ni, trồng loài thủy sản Việc ứng dụng CTPT giúp cho nhà chọn giống nhận diện xác gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống Hiệu cải tiến giống gia tăng gấp nhiều lần so với phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực việc chọn lọc không cần trực tiếp tính trạng mong muốn mà thơng qua CTPT liên kết với tính trạng Hiện nay, nghiên cứu di truyền phân tử đối tượng tôm sú cịn chưa tương xứng với vai trị đối tượng nuôi kinh tế quan trọng Thông tin locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng Vì vậy, việc nghiên cứu xác định mối tương quan SNP loại biến dị phổ biến hệ gen - với tính trạng tăng trưởng tơm sú để tạo sở liệu cho nghiên cứu chọn giống dựa CTPT hướng nghiên cứu quan trọng thiết thực ngành công nghiệp nuôi tôm sú Trong khuôn khổ Đề tài “Lập đồ gen tôm sú (Penaeus monodon)” thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, thực đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen dịng tơm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”  Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tơm sú thu từ vùng biển Việt Nam; Sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm liên kết với tính trạng tăng trưởng cách áp dụng cơng nghệ giải trình tự gen hệ (phương pháp GBS) hai nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm  Nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tơm sú thu từ vùng biển khác Việt Nam kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp dòng tôm sú bố mẹ khác nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu hệ Go G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tơm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm hệ Go G1 nhằm sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc thị SNP G>A tôm sú tăng trưởng nhanh kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm ứng dụng SNP việc đánh giá nhanh chóng xác cá thể tôm nhằm hỗ trợ công tác chọn giống tơm sú  Những đóng góp luận án mặt khoa học thực tiễn (1) Luận án nghiên cứu đưa đánh giá đa dạng di truyền ba quần đàn tôm sú tự nhiên từ vùng biển Việt Nam kỹ thuật AFLP (2) Sàng lọc thị SNP nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh làm sở cho việc tìm kiếm thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh tơm sú Hai thị SNP xác định nghiên cứu luận án phát thị SNP nằm exon gen MHC họ giáp xác Những kết cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng thị phân tử chọn giống tơm sú Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tôm sú kỹ thuật AFLP Thu mẫu tôm sú từ quần đàn BTB, NTB, NB DNA tổng số từ mẫu tôm sú Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Đa hình AFLP quần đàn quần đàn tôm sú Tạo vật liệu nghiên cứu: tôm sú hệ Go G1 Sàng lọc SNPs liên quan đến tính trạng tăng trưởng tơm sú kỹ thuật GBS Kỹ thuật dựa SNP kiểm G1 tăng nhanh KASP thị tra tôm trưởng Thu mẫu dịng tơm sú: A, T, G, N Thiết lập gia đình tạo hệ Go, G1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Cây phát sinh chủng loại Tôm sú bố mẹ bệnh Tôm sú hệ Go, G1 Tách chiết DNA tôm sú Go, G1 Giải trình tự GBS Sàng lọc SNPs Chú giải gen chức Xác định tương quan contig chứa SNP so với gen MHC Xác định: vùng tương đồng contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, codon chứa SNP, vị trí tương ứng thị SNP gen MHC Thiết kế mồi đặc hiệu dựa trình tự chứa SNP G>A gen MHC Kiểm tra 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc hệ G1 Bộ liệu SNP nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm Hai thị SNP nằm vùng exon gen MHC:  SNP Contig83953:g.20T>C gen MHCa biến đổi codon AAAAAG, không làm thay đổi acid amin Lysine;  SNP Contig260347:g.19G>A gen MHC1 biến đổi codon GGA (mã hóa acid amin Glycine)  GAA (mã hóa acid amin Glutamic) 28 mẫu đồng hợp tử A:A; mẫu đồng hợp tử G:G; 10 mẫu dị hợp tử G:A Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÔM SÚ Penaeus monodon 1.1.1 Đặc điểm sinh học, phân loại phân bố địa lý Tơm sú có tên khoa học Penaeus monodon Fabricius mô tả đặt tên năm 1798 Tôm sú số lồi tơm ni quan trọng phân loại sau (Brusca et al., 1990): Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustatacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Siêu họ: Penaeoidea Họ: Penaeidae Giống: Penaeus Lồi: monodon Hình 1.1 Tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: Nguyễn Hữu Ninh, 2012) Cơ thể tơm sú có màu xanh đậm, có vân sắc tố trắng đen đốt bụng Phần lại thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh đỏ (Hình 1.1) Trong lồi tơm ni, tơm sú lồi có kích thước lớn (có thể dài đến 270 mm, nặng 260g lớn hơn) lồi tơm thương mại quan trọng (Motoh, 1985) Tơm có phận: chủy (cứng, có cưa, phía chủy có 7-8 răng, chủy có răng); mũi khứu giác râu (cơ quan nhận biết giữ thăng cho tôm); cặp chân hàm (lấy thức ăn bơi lội); cặp chân ngực (lấy thức ăn bò); cặp chân bụng (rf); đuôi (nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao, xuống thấp); phận sinh dục (Motoh, 1985) Tôm sú lồi giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngồi thể nên phát triển chúng mang tính gián đoạn đặc trưng gia tăng kích thước khối lượng Sau lần lột xác, thể tơm sú tăng nhanh kích thước Q trình phụ thuộc vào mơi trường nước, điều kiện dinh dưỡng giai đoạn phát triển cá thể Tơm sú thuộc loại dị hình phái tính, có kích thước lớn đực độ tuổi Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực thơng qua quan sinh dục phụ bên ngồi Cơ quan sinh dục đực nằm phía phần đầu ngực, bên ngồi có quan giao phối phụ nằm nhánh ngồi đơi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở hốc háng đôi chân ngực thứ Tinh trùng thuộc dạng chứa túi Con có buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở khớp háng đôi chân ngực thứ Bộ phận chứa túi tinh gồm phồng lên đôi chân ngực thứ thứ bụng tôm Tuổi thành thục sinh dục tôm đực tôm tự nhiên từ tháng thứ tám trở (Nguyễn Văn Thường Trương Quốc Phú, 2009) Vùng phân bố: Tơm sú thuộc lồi rộng muối nên chúng có mặt rộng từ Ấn Ðộ Dương sang hướng Nhật Bản, Ðài Loan, phía Ðơng Tahiti, phía Tây Châu Phi phía Nam Châu Úc Ở nước ta, tơm sú xuất dọc theo bờ biển Ðông vùng đảo Phú Quốc Nhìn chung, lồi phân bố từ kinh độ 30oE đến 155oE từ vĩ độ 35oN đến 35oS xung quanh vùng xích đạo như: Philipines, Malaysia, Indonesia Việt Nam Tôm bột (Postlarve), tôm giống (Juvenile) tơm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển rừng ngập mặn ven bờ Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ (Motoh, 1985) Vòng đời tôm sú: Tôm sú từ - 10 tháng tuổi tham gia sinh sản Chúng đẻ quanh năm chủ yếu tập trung thời kỳ tháng - tháng - 10 hàng năm Tôm đẻ trứng nhiều hay phụ thuộc vào chất lượng buồng trứng trọng lượng thể (Phạm Văn Tình, 2004) Vịng đời tơm sú chia làm giai đoạn: phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tơm tiền trưởng thành trưởng thành (Hình 1.2) - Giai đoạn phôi: giai đoạn trứng thụ tinh phân cắt thành 2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phơi vị đến nở Thời gian hồn tất giai đoạn khoảng 12 đến 15 tùy thuộc điều kiện nhiệt độ nước - Nauplius: chia làm giai đoạn phụ (N1- N6) kéo dài đến ngày, dinh dưỡng nỗn hồng - Zoae: chia làm giai đoạn phụ (Z1-Z3) kéo dài - ngày, dinh dưỡng chủ yếu tảo khuê - Mysis: chia làm giai đoạn phụ (M1-M3) kéo dài - ngày, tôm ăn chủ yếu phiêu sinh động vật ấu trùng Artemia, Branchionus plicatilis Hầu hết giai đoạn ấu trùng khoảng - 10 ngày, sau biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae) Giai đoạn tôm bám thành bể, sống đáy, có hình dạng giống tơm trưởng thành Ngồi động vật phù du tôm ăn mùn bã hữu cơ, sinh vật đáy, - tuần sau trở thành tôm giống Tôm giống - tháng sau đạt tiêu chuẩn tơm trưởng thành tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương et al., 1999) Tôm đẻ trứng vào ban đêm từ 22 đến sáng ngày hôm sau Trong tự nhiên tôm thường đẻ lần chu kỳ lột xác, điều kiện ni vỗ tơm đẻ nhiều lần (có thể đến lần) (Thạch Thanh et al., 2005) Trong nghề nuôi tôm, mùa vụ nuôi thời gian thu hoạch tôm sú thương phẩm năm tùy thuộc vào điều kiện khí hậu thời tiết vùng (Bộ Thủy sản, 2000) Trong chu kỳ sống, tơm sú có khả thích ứng với độ mặn từ 2‰ - 40‰ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển Giai đoạn ấu trùng thời kỳ đầu tôm giống, chúng thích nghi độ mặn từ 28 - 32‰ Lớn lên, tơm sú thích ứng với độ mặn giảm dần từ 10 - 15‰, đến cỡ tôm 50 - 70 gam, chúng sống sinh trưởng nhanh độ mặn 5‰ Khi trưởng thành đến thời kỳ sinh sản, chúng lại có nhu cầu sống độ mặn cao nước biển Do đặc điểm này, tự nhiên tôm sú sinh sản vùng biển sâu, nơi có độ mặn cao, phát triển thành tơm giống di cư vào vùng ven bờ, vùng cửa sông nơi có độ mặn thấp Đến thời kỳ sinh sản chúng lại quay biển (Vũ Văn Tồn, 2001) Hình 1.2: Vịng đời tơm sú (Nguồn: Motoh, 1985) 1.1.2 Khái qt tình hình ni tơm sú giới Việt Nam * Trên giới: Những tiến công nghệ nuôi tôm diễn theo hướng hồn thành vịng đời tơm ni vào năm 1934 Nhật Bản tiến sỹ Motosaku Fujinaga thành cơng việc kích thích sinh sản cho tơm he Nhật Bản (Penaeus japonicus) từ ấp nở trứng ương nuôi ấu trùng từ giai đoạn Nauplii sang Mysis nhờ sử dụng tảo silic Những thành tựu tiến sỹ Fujinaga cộng có tầm ảnh hưởng to lớn ngành nuôi tôm Thành công cho phép sản xuất tôm giai đoạn hậu ấu trùng quy mơ thương mại cho chương trình ni tái tạo Những năm 1963, sóng phát triển thứ hai ngành tôm bắt đầu trỗi dậy nhà khoa học cố gắng chuyển giao phương pháp Tiến sỹ Fujinaga sang khu vực khác nhiều loài khác Địa điểm chuyển giao ban đầu Mỹ Đài Loan (Kungvankij, 1984) Trong số lồi tơm thuộc họ tơm he (Penaeid) tơm sú (Penaeus monodon) lồi tăng trưởng nhanh khả thích ứng tốt với điều kiện canh tác Kỹ thuật nuôi thâm canh tôm sú nhanh chóng lan rộng khắp châu Á trở thành lồi thống trị tơm ni Trong năm 1980, suất nuôi tôm sú thâm canh đạt 10 tấn/ha, cỡ tôm khoảng 30 gram/con, sử dụng tôm bố mẹ tự nhiên Ecuador Đài Loan (đại diện cho châu Mỹ châu Á) quốc gia đầu giai đoạn xuất phát, Trung Quốc sau lại lên chiếm ưu (Kungvankij, 1984) Ở châu Á, nghề ni tơm he có từ lâu với mơ hình ni truyền thống, suất thấp chủ yếu tiêu thụ nội địa Việc xuất sản phẩm tơm ni bắt đầu hình thành năm thập kỷ 70 Với tiến kỹ thuật nuôi công nghệ chế biến thức ăn thủy sản cơng nghiệp ni thủy sản bắt đầu phát triển mạnh thập kỷ Năm 1975, sản lượng tôm nuôi công nghiệp chiếm 2,5% tổng sản lượng tôm giới Trong năm thập kỷ 90, sản lượng tôm nuôi công nghiệp tăng lên 30% Các nước châu Á Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Ấn độ, Việt Nam nước sản xuất tôm chủ yếu, sản xuất 80% sản lượng tôm Nam Mỹ (chủ yếu Ecuador) sản xuất khoảng 20% sản lượng Khoảng nửa sản lượng tơm sản phẩm từ Penaeus monodon, ngồi cịn có sản phẩm lồi tơm khác như: P vannamei, P indicus, P merguiensis, P chinensis (Rönnbäck, 2001) Năm 1999, suất ni tơm trung bình giới 0,65 tấn/ha với hình thức ni bán thâm canh chủ yếu (Rönnbäck, 2001) Tuy nhiên, phát triển ngành nuôi tôm, đặc biệt nước Đông Nam Á, suy giảm với sản lượng 600.000 vào năm 2007 (Aziz et al., 2011) Hiện tượng phát triển bùng nổ nghề ni tơm sau suy giảm diễn quy luật nhiều quốc gia, xảy Đài Loan vào năm 1988, Trung Quốc vào năm 1994 (Chanratchakool, 2003) Các quốc gia có nghề ni tơm phát triển khác Thái Lan, Indonesia Ecuador xảy tượng tương tự 5-10 năm sau phát triển nghề nuôi tôm thâm canh (Aziz et al., 2011) 10 Trong năm 1990, bệnh đốm trắng lan rộng tồn cầu Đúng lúc đó, Hiệp hội ni tơm biển Mỹ phát triển dịng tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), tên gọi trước Penaeus vannamei (tôm he Nam Mỹ) bệnh giới thiệu sang châu Á Loại tôm bệnh nuôi ao cho suất cao Nông dân nhanh chóng chuyển từ tơm sú tự nhiên, mang nhiều bệnh sang nuôi tôm thẻ chân trắng bệnh, đồng thời thay đổi phương pháp sản xuất để giảm nguy dịch bệnh cách giảm thay nước, khử trùng nước không sử dụng sinh vật tự nhiên làm thức ăn (Briggs et al., 2005) Sự du nhập ạt tôm he Nam Mỹ vào nước châu Á để thay tôm sú làm thay đổi đáng kể tỷ trọng hai loại tôm nuôi (Nguyễn Hữu Ninh, 2010) Các chuyên gia cho rằng, tôm chân trắng nuôi rộng rãi nước giới cơng nghệ gia hố thành công đàn lớn tôm bố mẹ lọc số bệnh nguy hiểm, chúng dễ sinh sản dưỡng, dễ nuôi mật độ cao, đòi hỏi hàm lượng protein thức ăn thấp so với tôm sú, chịu nhiệt độ thấp chịu nước có chất lượng so với tôm sú (Vũ Dũng Tiến Don Griffiths, 2012) Cùng lúc, sản lượng tơm sú (có nguồn gốc chủ yếu từ châu Á) lại liên tục giảm, 20 năm qua, kinh nghiệm kết nuôi tôm sú nước châu Á thu nhiều thành công đáng kể, giá cao nhiều thị trường ưa chuộng Sự giảm sút sản lượng việc nước châu Á dần từ bỏ đối tượng địa quan trọng này, theo chuyên gia, chủ yếu chưa gia hố kiểm sốt dịch bệnh nên khơng đảm bảo chất lượng tốt giống Trong lịch sử phát triển ngành ni tơm sú, có ba quốc gia vùng lãnh thổ Đài loan, Trung Quốc, Thái Lan đạt đỉnh cao công nghệ nuôi tôm sú, sản lượng cao cuối bị đổ vỡ chuyển sang nuôi tôm chân trắng Trong số hướng nghiên cứu lĩnh vực nuôi tôm thực bốn thập niên qua, có lẽ nghiên cứu cơng nghệ sản xuất tơm giống nhằm chủ động giống cho nuôi thương phẩm, giảm thiểu phụ thuộc vào nguồn tôm tự nhiên triển khai sớm đạt nhiều thành công (Aquacop, 1979; PHỤ LỤC Nguyên lý điện di mao quản Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) phương pháp phân tách chất dựa vào khác tốc độ chuyển động chúng tác dụng lực điện trường mao quản hẹp Kỹ thuật điện di mao quản dựa sở tính chất điện di phần tử chất phân tích mao quản (ɸ: 25-100m) dung dịch chất điện giải có chất đệm pH thích hợp, tác dụng từ trường điện E định cung cấp nguồn cao chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản Nói cách khác, CE kỹ thuật phân tách thực mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển tách chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt tốn mẫu hố chất, số đĩa hiệu dụng Nef lớn tách chất xẩy nhanh với hiệu cao (http://www.impe-qn.org.vn/) Sơ đồ nguyên lý cấu tạo hệ điện di mao quản (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/) PHỤ LỤC Minh họa kết phân tích liệu AFLP phần mềm GeneMapper® Software Version 4.1 PHỤ LỤC Cơ sở lý thuyết phương pháp xác định nồng độ độ DNA thông qua đo mật độ quang học (Optical Density - OD) (Nguồn: Desjardins and Conklin, 2010) Dựa vào tính chất hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine để định lượng DNA dung dịch Giá trị mật độ quang học bước sóng 260 nm (OD260) mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có dung dịch, từ cho phép xác định nồng độ DNA mẫu Để kiểm tra độ tinh DNA dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD 280 nm (OD 280) 280 nm bước sóng protein có mức hấp thụ cao nhất, số protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260 nm acid nucleic làm sai lệch giá trị nồng độ thật acid nucleic Nồng độ độ DNA dung dịch tách chiết tính theo cơng thức: Nồng độ DNA (ng/µL) = OD260 x 50 x hệ số pha lỗng Độ DNA = OD260/OD280 Trong đó: OD260: giá trị đo bước sóng 260 nm OD280: giá trị đo bước sóng 280 nm Nếu độ DNA nằm khoảng 1,8 - 2,0 mẫu coi PHỤ LỤC Phương pháp sàng lọc bệnh tôm bố mẹ đầu vào Thu bảo quản mẫu Thực thu mẫu cá thể tôm để kiểm tra mầm bệnh Một phần chân bơi số cá thể tôm cắt vô trùng vfa cho vào Eppendorf mã hóa chứa cồn Mẫu chân bơi sau bảo quản lạnh phân tích Ly trích DNA/RNA virus từ tôm * Chuẩn bị mẫu: Mẫu chân bơi cắt thành mảnh nhỏ để dễ dàng ly trích DNA RNA Trọng lượng mẫu phân tích khơng q 500 µg * Ly trích tinh DNA tổng số: Ly trích DNA virus theo quy trình Gudkovs (2008) có điều chỉnh: sử dụng 200 - 500 µg mơ tơm nghiền 500 µL dịch đệm ly trích DNA, ủ bồn nước đá phút, sau đun 100oC 10 phút, lấy mẫu cho vào nước đá phút, ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút Hút dịch bên chứa DNA cho vào Eppendorf 1,5 mL mới, sau tủa dịch thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm 13.000 vòng/phút phút thu tủa DNA Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA làm khô 58oC 10 phút, hòa tan cặn tủa DNA 200 µL nước khử ion giữ -20oC * Ly trích tinh RNA tổng số: Ly trích RNA tổng số dung dịch Trizol (Invitrogen) Dùng panh kéo để lấy khoảng 100 mg mô tôm, loại bỏ cồn giấy thấm nghiền mL Trizol, sau ủ dịch nghiền nhiệt độ phịng phút; Thêm 200 µL Chloroform vào dịch nghiền; Vortex 20 giây, sau ủ nhiệt độ phịng phút Mẫu sau ủ ly tâm lạnh 12.000 vịng/phút 10 phút Hút 300 µL dịch có chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 mL mới; Thêm vào 300µL Isopropanol lạnh đảo nhẹ 3-4 lần Mẫu sau tủa RNA ủ nhiệt độphòng (25oC - 28oC) 15 phút Sau ủ, tủa RNA ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút, loại bỏ dịch Cặn RNA rửa lại mL Ethanol 70%, sau ly tâm lạnh 7500 vòng/phút phút, loại bỏ dịch nổi, làm khơ cặn RNA 55oC, hịa cặn RNA 100µL H2O-DEPC, sau bảo quản -20oC đến phân tích Phân tích diện virus Quy trình PCR RT-PCR để phát virus gây bệnh tôm (WSSV, IHHNV, YHV/GAV LSNV) dựa quy trình cơng bố Kiatpathomchai et al (2001), Cao Thành Trung et al (2013), OIE (2009) Sritunyalucksana et al (2006)  Quy trình phát Semi-nest PCR WSSV Quy trình sử dụng mồi xi F1 1µL ba mồi ngược R1 0.2 µL, R2 0.3 µL, R3 0.5 µL; Thể tích phản ứng 50µL; Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: Buffer Flexi 1X, MgCl2 3mM, dNTP 0.2 mM, Go Tag Flexi Polymerase 1.5U; Thực quy trình lần phản ứng: Quy trình với chu kỳ (gồm biến tính 93oC giây, bắt cặp mồi 70oC 20 giây kéo dài mạch 72oC 20 giây); Sau Quy trình thực 20 chu kỳ (gồm 93oC 20 giây, 55oC 20 giây 72oC 20 giây); Quy trình thực 25 chu kỳ (gồm 93oC 20 giây, 50oC 20 giấy 72oC 20 giấy) Sản phẩm sau khuếch đại bao gồm loại sản phẩm có kích thước 1100 bp, 526 bp 250 bp  Quy trình Multiplex PCR phát IHHNV Hỗn hợp phản ứng PCR sau: Hút 0,5 µM mồi vnIHF vnIHR, 0,2 µM mồi 309F 309R; Thêm Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1,5U GoTag® Hot Start Polymerase (Promega) Quy trình thực 35 chu kỳ (biến tính nhiệt độ 95oC 45 giây, bắt cặp mồi 58oC 45 giây, kéo dài mạch 72oC 60 giây) Giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút, 4oC sử dụng Sản phẩm khuếch đại cho loại sản phẩm có kích thước 997 bp 309 bp  Quy trình RT-nested PCR phát YHV/GAV Quy trình sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu nhận diện khuếch đại trình tự vật liệu di truyền YHV/GAV hai phản ứng bước bước hai Cặp mồi GY1, GY4 GY5 thiết kế cho phản ứng RT-PCR bước để khuếch đại đoạn gen chung vả virus GAV YHV Sản phẩm khuếch đại có kích thước 794 bp Phản ứng PCR bước hai thực với cặp mồi GY2, Y3 G6 đặc hiệu riêng biệt cho GAV YHV Sản phẩm khuếch đại virus GAV có kích thước 406 bp virus YHV 277 bp Thành phần hỗn hợp phản ứng gồm: 35 pmol mồi GY1, GY4 GY5, Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, 3mM mgCl2 (Promega), 0,2Mm dNTPs (Promega), 5U AMV reverse transcriptase (Promega) 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase Phản ứng thực gồm: tổng hợp cDNA chu kỳ 42oC 45 phút, sau phản ứng PCR gồm chu kỳ 95oC phút, 35 chu kỳ, giai đoạn biến tính nhiệt độ 95oC 45 giây, giai đoạn bắt cặp mồi58oC 60 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 45 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút Hút 2µL sản phẩm bước chuyển qua phản ứng bước gồm 35 pmol mồi GY2, Y3 G6, Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, 3mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega) Phản ứng thực 20 chu kỳ gồm 95oC 45 giây, giai đoạn bắt cặp mồi 58oC 60 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 30 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút Sản phẩm bảo quản 4oC để phân tích  Quy trình RT-PCR phát LSNV Thành phần hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,7 àM mi mi 20AF v 20AR, Colorless GoTagđ Flexi Buffer 1X, mM MgCl2 (Promega), 0,2 mM dNTPs (Promega), 5U AMV reverse transcriptase (Promega) 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega) Sản phẩm sau khuếch đại có kích thước 197 bp Phản ứng thực gồm: tổng hợp cDNA chu kỳ 42oC 30 phút, sau phản ứng PCR gồm chu kỳ 95oC phút, 35 chu kỳ, giai đoạn biến tính nhiệt độ 95oC 30 giây, giai đoạn bắt cặp mồi 55oC 30 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 30 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút PHỤ LỤC Nguyên tắc ghép phối tôm bố mẹ Go để tạo hệ G1 Các phép lai thực theo sơ đồ lai thiết kế sẵn (sơ đồ lai lý thuyết) Nguyên tắc sơ đồ lai theo lý thuyết đảm bảo tránh cận huyết theo Index * Tránh cận huyết: Để tránh cận huyết, việc ghép tinh tôm bố mẹ Go tạo hệ G1 thực theo sơ đồ lai lý thuyết thiết kế sẵn phần mềm Excel Khi nhập thông tin tôm tôm đực vào, phần mềm thiết kế cho kết phả hệ (cụ thể hệ ông bà) 0, 1, (Bảng PL7) Trường hợp kết có nghĩa phả hệ không trùng nhau, việc ghép tinh tôm đực tơm đảm bảo tránh cận huyết hồn tồn Trường hợp kết có nghĩa dịng hệ ơng bà (bà ngoại, ơng ngoại, bà nội, ơng nội) có trùng dịng (ví dụ tơm AN ghép với tơm đực AG) Trường hợp chấp nhận ghép Với kết tra cứu phả hệ 2, có nghĩa trùng dịng hệ ơng bà (Lai chéo trùng Nội dịng hay Lai chéo trùng Lai chéo) (ví dụ: AN ghép với đực AA; NN; AN; NA), trường hợp cần phải cẩn thận Tốt không nên ghép kết tra cứu phả hệ Tuy nhiên, trường hợp phát triển túi tinh buồng trứng khơng mong muốn chấp nhận kết với Lai chéo trùng Nội dòng (AN ghép với AA hay NN); cịn với Lai chéo trùng Lai chéo tuyệt đối không thực Trường hợp cuối cùng, kết tra cứu phả hệ 4, Nội dịng trùng với Nội dịng (chỉ có khả xảy ra: AA x AA; GG x GG; NN x NN; TT x TT) tuyệt đối khơng thực ghép tinh tơm tơm đực Bảng PL7 Sơ đồ lai theo lý thuyết để kiểm tra phả hệ 16 tổ hợp Go tạo hệ G1 CON CÁI CON ĐỰC AA AG AN AT GA GG GN GT NA NG NN NT TA TG TN TT AA 2 2 0 0 0 AG AN AT GA GG GN GT NA NG NN NT TA TG TN TT 2 2 0 0 0 1 2 1 1 0 1 0 1 2 1 1 0 1 0 1 2 1 2 1 1 0 1 0 0 2 0 0 1 2 1 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 2 1 2 1 0 0 2 0 0 1 0 1 1 2 1 2 1 0 1 0 1 1 2 1 2 1 0 1 1 2 1 2 0 0 0 2 2 * Theo Index: Việc ghép tôm đực tôm Go với cần vào giá trị Index chúng Nhằm đảm bảo tính đa dạng di truyền, đồng thời tích lũy giá trị chọn lọc trước hết tất gia đình Go nên trì dịng máu hệ (G1), nhiên tỷ trọng góp “máu“ chúng có khác tùy thuộc vào giá trị Index chúng Index (I) gia đình i Ii = (xi x LSM khối lượng gia đình i) + (yi x tỷ lệ sống gia đình i); đó: xi hệ số cho tính trạng khối lượng, yi hệ số cho tính trạng tỷ lệ sống, LSM trung bình bình phương tối thiểu (Least Square Medium) Các gia đình xếp theo giá trị I, chia làm nhóm: Nhóm tơm có giá trị Index cao (Ii > 110), Nhóm tơm có giá trị Index trung bình (90≤ Ii ≥ 110) Nhóm tơm có giá trị Index thấp (Ii < 90) Nhằm đảm bảo ưu lai tính trạng tăng trưởng đồng thời đảm bảo độ đa dạng di truyền hệ Go, quần thể Go hình thành với việc chọn đại diện nhóm với tỷ lệ khác Cụ thể tỷ lệ nhóm tơm G o mong muốn giữ lại là: Nhóm cao 65-75%, Nhóm trung bình 20-30%, Nhóm thấp 5% 10 PHỤ LỤC Phương pháp đánh dấu huỳnh quang cá thể tơm sú Quy trình đánh dấu sử dụng phẩm màu huỳnh quang sau: - Chuẩn bị phẩm màu: Phẩm màu huỳnh quang (VIE) chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất (Công ty Northwest Marine Technology) Pha dung dịch màu (VIE) với chất xúc tác theo tỷ lệ 10:1 trộn đều, liên tục vòng phút Dung dịch sau trộn chuyển vào xi-lanh 0,3 ml gắn với dụng cụ đánh dấu cầm tay Màu sau pha tốt bảo quản điều kiện lạnh ( ≈ 4oC) Phẩm màu bảo quản tốt sử dụng vịng 12 nữa, không nên sử dụng lại VIE bảo quản qua đêm - Thao tác đánh dấu: Phẩm màu tiêm vào lớp mặt bụng tôm giống, song song với lớp vỏ kitin Phẩm màu tiêm nhẹ nhàng tránh làm tổn thương lớp thịt tôm kết thúc trước kim tiêm rút khỏi thể tôm Trong trình đánh dấu khơng cần phải gây mê tơm VIE Dấu VIE tôm sú (thu hoạch sau ba tháng ni) Các vị trí đánh dấu tơm sú (vị trí đánh dấu bên trái từ đến tương tự bên phải) 11 PHỤ LỤC Cơ chế hóa học phương pháp KASP (Nguồn: https://www.lgcgroup.com/kasp/?#.WxjWlUiFPIU) 1) Các thành phần phản ứng: - Mẫu DNA chứa SNP quan tâm (DNA template); - KASP Assay mix chứa hai mồi xuôi đặc hiệu alen cạnh tranh khác với trình tự đuôi đặc trưng mồi ngược; - KASP Master mix chứa băng FRET, Taq polymerase dung dịch đệm tối ưu 2) PCR vòng 1: Chú giải Trình tự oligo gắn FAM Alen-1 (Alen-2 primer khơng kéo dài) (Alen-1 primer gắn vào kéo dài) H F Trình tự oligo gắn HEX Alen-2 (Mồi ngược kéo dài chiều 5’-3’) Mồi ngược F Trong chu kỳ PCR đầu tiên, mồi đặc hiệu alen bắt cặp với trình tự đích chứa SNP với mồi ngược khuếch đại vùng đích H 3) Tổng hợp đoạn bổ sung với trình tự đặc hiệu alen – PCR vòng 2: Mồi ngược gắn vào, kéo dài tổng hợp sợi bổ sung 4) Phát tín hiệu huỳnh quang – PCR vòng 3: H F Oligo gắn FAM bắt cặp với trình tự bổ sung tổng hợp tín hiệu huỳnh quang khơng bị dập tắt Trong chu kỳ PCR tiếp theo, mức độ đuôi đặc hiệu alen tăng lên Phần gắn huỳnh quang băng FRET (FRET cassette) bắt cặp bổ sung gắn vào trình tự tổng hợp, giải phóng chất huỳnh quang từ quencher để tạo tín hiệu huỳnh quang Chất huỳnh quang kết hợp với alen G không bị dập tắt Chất huỳnh quang khơng kết hợp với alen T cịn lại bị dập tắt 12 PHỤ LỤC 10 Minh họa kết điện di gel agarose mẫu DNA tách chiết từ tôm sú 10 11 12 13 14 15 16 17 A 10 11 12 13 14 B C A- Các mẫu BTB; B- Các mẫu NTB; C- Các mẫu NB 13 PHỤ LỤC 11 Các mẫu tôm sú hệ Go sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNPs Nhóm Tôm sú Lớn nhanh (F) ♀ STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Nhóm Tơm sú Lớn chậm (S) ♂ ♀ ♂ Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình TDOO TDOO TOTO TOTO OOTT OTHO THOO THOO OXOH TOOT OTDO TOOH TOOH TDOO TOOH TOOH TOOH OTOX OTOD OOTC OTOD TOOX OTOX OTOD TOOX OTOX OTXO OTOT OTOX OTOX AA08 AA08 AG06 AG06 AG07 AG08 GG06 GG06 NT07 TA02 TA03 TG03 TG03 AA08 TG03 TG03 TG03 TG04 NT08 AN05 NT08 TA04 TG04 NT08 TA04 TG04 GA07 AA07 TG04 TG04 TOTO TOTO OOTT THOO THOO THOO OTDO TOOH TOOH TDOO TOTO THOO OXOH OOTC OOTC TCOO OTOD TTOO OXOH THOO TOTO OXOH OTXO OXHO OTOD TCOO OTOD OTOD OOTT TOOX AG06 AG06 AG07 GG06 GG06 GG06 TA03 TG03 TG03 AA08 AG06 GG06 NT07 AN05 AN05 AT04 NT08 AA06 NT07 GG06 AG06 NT07 GA07 AT02 NT08 AT04 NT08 NT08 AG07 TA04 HXOO HOXO HOOX HOOX ODOH CHOO OHXO DHOO DHOO OOHX HDOO DOOH DOOH DOOH HOOX CHOO OHXO OOHX ODOH HDOO HOHO OHOX HHOO OHCO HODO HCOO OHOX OHOX OOCH OHOH AA04 NA07 NG11 NG11 NG13 NG14 NN08 NN09 NN09 NT06 TN01 TT06 TT06 TT06 NG11 NG14 NN08 NT06 NG13 TN01 TT01 NT05 TT03 NT04 TT05 TN02 NT05 NT05 TA01 TT05 HXOO HOXO HOOX HOOX ODOH CHOO OHXO DHOO DHOO OOHX HDOO DOOH DOOH DOOH HXOO HXOO HDOO DOOH HXOO OOHX HDOO HCOO OHOX HCOO HODO HOHO OHOX OHOX HOOX OHCO AA04 NA07 NG11 NG11 NG13 NG14 NN08 NN09 NN09 NT06 TN01 TT06 TT06 TT06 AA04 AA04 TN01 TT06 AA04 NT06 TN01 TN02 NT05 TN02 TT05 TT01 NT05 NT05 NG11 NT04 14 PHỤ LỤC 12 Các mẫu tôm sú hệ G1 sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNPs Nhóm Tơm sú Lớn nhanh (F) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Nhóm Tơm sú Lớn chậm (S) ♀ ♂ ♀ ♂ Dấu VIE Dấu VIE Dấu VIE Dấu VIE CODO CODO COOC COOC COXO COXO COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC CODO CODO COOC COOC COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODCO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC CCOO CCOO DOHO DOHO DOOH DOOH OCOC OCOC OCOD OCOD ODOC ODOC OOXX OOXX OXOD OXOD XODO XODO XOOH XOOH XXOO XXOO DCOO DCOO DDOO DDOO DHOO DHOO ODOX ODOX CCOO CCOO COCO COCO DOHO DOHO DOOH DOOH OCOC OCOC OCOD OCOD ODOC ODOC OOXX OOXX OXOD OXOD XODO XODO XOOH XOOH XXOO XXOO DCOO DCOO DDOO DDOO DHOO DHOO 15 PHỤ LỤC 13 Các mẫu tôm sú Lớn nhanh hệ G1 sử dụng cho phương pháp KASP STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Dấu VIE Trọng lượng (g) CODO CODO COOC COOC COXO COXO COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC VDOO VDOO VODO VODO VVOO VVOO XHOO XHOO XOOC XOOC 22,1 22,1 24,0 24,0 26,6 26,6 26,6 16,6 16,6 20,4 20,4 19,4 19,4 26,9 25,1 25,1 24,8 24,8 22,0 22,0 21,9 21,9 22,8 22,8 32,1 32,1 21,8 21,8 20,3 20,3 15,7 15,7 24,2 24,2 25,2 25,2 22,7 22,7 29,6 29,6 16 PHỤ LỤC 14 Giải thích thuật ngữ (Nguồn: http://bioinformatics.vn) Thuật ngữ Giải thích Adaptor/ adapter Đoạn trình tự oligonucleotide ngắn, tổng hợp hóa học, có dạng sợi đơn sợi đôi, sử dụng kỹ thuật di truyền để gắn vào đầu phân tử DNA RNA Read DNA sau nhân nhiều lần cắt ngẫu nhiên thành mẩu đủ nhỏ để giải trình tự Các đoạn nhỏ giải trình tự gọi read Contig Một contig đoạn trình tự liên tục có từ việc lắp ráp đoạn read có vùng trùng lặp với Lắp ráp contig Trình tự đoạn read tạo sử dụng phương pháp giải trình tự từ lên (bottom-up) Với phương pháp giài trình tự từ lên, phân tử DNA chia cắt thành mẩu nhỏ (bottom), đọc trình tự đoạn nhỏ này, lắp ráp chúng lại thành contig cuối hệ gen (up) Khả để lắp ráp thành công đoạn read thành contig phụ thuộc vào mức độ trùng lặp read, việc chia cắt phân tử DNA thành mẩu nhỏ ngẫu nhiên thực hàng loạt phân tử DNA Sau giải trình tự, đoạn read có trùng lặp lắp ráp thành contig chương trình máy tính Độ sâu kỹ thuật giải trình tự DNA mức độ trùng lặp đoạn trình tự vị trí nucleotide định kết nối Depth (or read depth) 17 ... dịng tơm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm? ?? 3  Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tôm sú thu từ vùng biển Việt Nam; Sàng lọc đa hình nucleotide... NGHIÊN CỨU BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tơm sú kỹ thuật AFLP Thu mẫu tôm sú từ quần đàn BTB, NTB, NB DNA tổng số từ mẫu tôm sú Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Đa hình. .. trạng tăng trưởng tôm sú (3) Phát tán tôm sú bố mẹ chọn giống Đến nay, đề tài chưa có sản phẩm thương mại Vì vậy, với mục tiêu luận án nghiên cứu đa hình hệ gen dịng tơm sú Việt Nam, đặc biệt sàng