Luận văn nghiên cứu tạo phức hợp bao của b cyclodextrin với một số polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh

MỞ ĐẦU Hiện nay, việc nghiên cứu bào chế dược phẩm từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên hướng nghiên cứu hấp dẫn tính ưu việt, đa dạng tác dụng phụ Flavonoid nhóm chất phổ biến thực vật, có mặt hầu hết phận loài thực vật bậc cao có nhiều tác dụng sinh học Rutin quercetin hai số nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên sử dụng phổ biến điều trị bệnh nhờ hoạt tính quý báu hoạt tính chống oxi hóa, chống dị ứng, kháng viêm, chống ung thư khối u Tuy nhiên, rutin quercetin lại tan nước, đó, liều lượng cần để đưa vào thể lớn, độc tính cao, sinh khả dụng lại không đủ Hiện nay, với việc ứng dụng công nghệ nano ngành sản xuất dược phẩm, độ tan nhiều dược chất cải thiện đáng kể Trong đó, cyclodextrin biết đến với khả bao gói giúp độ tan nhiều loại dược chất tăng lên rõ rệt Do đó, khn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo phức hợp bao βcyclodextrin với số polyphenol định hướng ứng dụng y sinh” rutin chiết xuất tinh chế từ hoa hịe có hàm lượng hiệu suất cao; sau quercetin bán tổng hợp từ rutin phương pháp thủy phân môi trường axit; trình tạo phức với cyclodextrin để làm tăng độ tan dược chất tiến hành Sản phẩm trình tạo phức phân tích đặc trưng số phương pháp hóa-lý đại, đồng thời hoạt tính chống oxi hoạt chất khảo sát Mục tiêu đề tài - Chiết xuất tinh chế thành công rutin từ hoa hịe có hàm lượng cao - Bán tổng hợp thành công quercetin từ rutin phương pháp thủy phân môi trường acid - Tổng hợp thành công phức chất rutin/β-cyclodextrin, quercetin/2hydroxypropyl-β-cyclodextrin với kích thước nano có độ tan cao độ tan rutin quercetin Nội dung nghiên cứu - Chiết xuất rutin từ hoa hịe sử dụng dung dịch kiềm lỗng Na2CO3 2% - Tinh chế rutin hai phương pháp: phương pháp kết tinh cồn phương pháp kết tủa acid-base - Bán tổng hợp quercetin từ rutin môi trường axit - Tổng hợp phức hợp rutin quercetin với cyclodextrin có kích thước nanomet - Đặc trưng sản phẩm tạo phức, xác định độ tan dược chất phương pháp hóa–lý đại: FTIR, DSC, SEM, DLS, UV-Vis… - Xác định hoạt tính chống oxi hóa rutin quercetin trước sau tạo phức phương pháp bắt gốc tự DPPH Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu đề tài có ý nghĩa quan trọng việc chọn lựa điều kiện thích hợp để cải thiện độ tan số flavonoid nhóm quercetin phương pháp tạo phức hợp bao với cyclodextrin; sở cho việc nghiên cứu hoàn thiện phát triển sản phẩm rutin, quercetin bao gói cyclodextrin ứng dụng công nghệ thực phẩm dược phẩm Việt Nam Bên cạnh đó, kết nghiên cứu sử dụng giảng phịng thí nghiệm khóa học dành cho cử nhân thạc sĩ chuyên ngành "Hóa lý hóa lý thuyết", “hóa hữu cơ” 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 1.1.1 Khái niệm chung nhóm flavonoid Flavonoid nhóm chất phổ biến thực vật, có mặt hầu hết phận lồi thực vật bậc cao có nhiều tác dụng sinh học Có thể mơ tả khung cơng thức phân tử flavonoid là: C6 (vị trí A) - C3 (vị trí C) - C6 (vị trí B), chúng cịn gọi polyphenolic tiểu phần có cấu trúc từ vịng thơm benzen (hình 1.1) Flavonoid ví von “những người thợ sửa chữa sinh hóa thiên nhiên” nhờ vào khả sửa chữa phản ứng thể chống dị ứng, virus chất gây ung thư Nhờ chúng mang lại hoạt tính q báu Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính đặc trưng hợp chất flavonoid nhờ vào đặc điểm cấu trúc phân tử sau [1]: Chứa nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vịng thơm có khả nhường hydro giúp flavonoid tham gia vào phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ gốc tự - Chứa vòng thơm (vòng benzen, vòng dị nguyên tố) liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa gốc tự hình thành chúng bắt giữ phần tử oxi hoạt động - Chứa nhóm tạo phức chuyển tiếp với ion kim loại catechol giúp làm giảm trình sản sinh phần tử oxi hoạt động - Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid 11 Các flavonoid chia nhỏ thành phân nhóm khác tùy thuộc vào vị trí cacbon vịng C mà vịng B gắn vào mức độ khơng bão hịa oxy hóa vịng C (hình 1.2) Các flavonoid có vịng B liên kết vị trí C-3 vịng C gọi isoflavone Những chất vịng B liên kết vị trí C-4 gọi neoflavonoid, chất vịng B liên kết vị trí C-2 chia nhỏ thành nhiều nhóm sở đặc điểm cấu trúc vòng C Các phân nhóm là: flavon, flavonols, flavanones, flavanonol, flavanols catechin, anthocyanins chalcones [2] Hình 1.2: Phân loại flavonoid 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo phân tử nhóm chất quercetin Quercetin phân loại flavonol, sáu phân lớp hợp chất flavonoid Theo IUPAC, công thức phân tử quercetin 3,3',4',5,7pentahydroxyflavanone (hoặc 3,3',4',5,7-pentahydroxy-2-phenylchromen-4-one) Trong cấu tạo, quercetin có nhóm OH gắn vị trí 3, 5, 7, 3’ 4’ (hình 1.3) [3] 12 Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin Quercetin aglycone, khơng gắn thêm gốc đường Quercetin có màu vàng, hồn tồn khơng hịa tan nước lạnh, hịa tan nước nóng, hịa tan tốt rượu lipid Một glycoside quercetin hình thành cách gắn nhóm glycosyl (đường glucose, rhamnose, rutinose) để thay cho nhóm OH (thường vị trí C-3) Nhóm glycosyl kèm theo thay đổi độ hịa tan, hấp thụ Theo nguyên tắc chung, diện nhóm glycosyl (quercetin glycoside) làm tăng khả hòa tan nước so với quercetin aglycone [4] Một số dẫn xuất quercetin chứa disaccharide, chẳng hạn rutinose, bao gồm rhamnose nhóm glucose đặt tên α-Lrhamnopyranosyl- (1→6)- β-D-glucopyranose Avicularin chứa arabinofuranose gắn với quercetin 3-OH Hyperoside có nhóm 3-O-galactoside (oxy liên kết với nhóm galactoside) vị trí C-3 khơng phải nhóm OH Isoquercitin (được tìm thấy xồi) có 3-O-glucoside [5] Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin 13 Rutin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone-3-rhamnoglucoside) loại flavonoid thuộc nhóm flavon phân lập lần đầu tiền vào năm 1842 từ Cửu lý hương (Ruta graveolen) Veyss [6] Rutin coi loại vitamin P dạng glycoside (một dạng 3Orhamnoglucoside) quercetin (hình 1.4) Bột rutin cịn có đặc điểm bột kết tinh màu vàng vàng ánh xanh, để ngồi ánh sáng màu sẫm lại Tinh thể rutin ngậm phân tử nước, chuyển sang dạng khan sấy 12 100°C áp suất giảm (10mmHg) Do cấu trúc glycoside nên rutin dễ bị thủy phân men có sẵn dược liệu axit Với dung dịch kiềm bị ảnh hưởng, điều kiện dung dịch kiềm đặc có nhiệt độ cao cấu trúc rutin bị phá vỡ, cụ thể vòng C mở tạo thành dẫn chất acid thơm dẫn chất phenol [6] 1.1.3 Hoạt tính sinh học ứng dụng quercetin rutin Quercetin bioflavonoid quan trọng có 20 loại thực vật, biết đến với tác dụng chống viêm, hạ huyết áp, giãn mạch, chống vi khuẩn chống tăng cholesterol máu Một số tác dụng có lợi khác bao gồm bảo vệ tim mạch, chống ung thư khối u, chống loét, chống dị ứng, chống tiểu đường, tác dụng bảo vệ dày, hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch chống nhiễm trùng Người ta phát quercetin chất chuyển hóa liên hợp quercetin bảo vệ hồng cầu khỏi tổn thương màng hút thuốc gây [7], [8] Quercetin kết hợp với axit ascorbic làm giảm tỷ lệ tổn thương oxy hóa tế bào lympho cấu trúc mạch thần kinh da ức chế tổn thương tế bào thần kinh Nó biết có tác dụng bảo vệ tế bào não chống lại oxy hóa, tác nhân làm tổn thương mô dẫn đến bệnh Alzheimer bệnh thần kinh khác [9] Quercetin có đặc tính chống ung thư mạnh biết đến chất cảm ứng apoptosis, nhờ làm giảm phát triển khối u não, gan, ruột kết mô khác ức chế lây lan tế bào ác tính Quercetin ức chế Cr[VI], 14 biến đổi tế bào gây ung thư hóa học làm giảm khả hiển thị tế bào, tạo ROS tăng MicroRNA-21 (miR-21) ung thư ruột kết người [10], [11] Các nghiên cứu quercetin ức chế tiết axit dày trình peroxy hóa lipid tế bào dày đóng vai trị chất bảo vệ dày Nó ức chế lây nhiễm Helicobacter pylori [7] Quercetin biết có tác dụng kháng khuẩn hầu hết chủng vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa, hơ hấp, tiết niệu da Khả chống nhiễm trùng chống tái phát chúng góp phần vào đặc tính kháng vi-rút Các loại virus thường phản ứng với quercetin adenovirus, virus herpes simplex, virus viêm não Nhật Bản virus hợp bào hô hấp [12], [13], [14] Quercetin có tác dụng chống dị ứng cách ức chế giải phóng histamine từ tế bào mast chất dị ứng khác, hoạt động chất kháng histamine tự nhiên Khả ngăn ngừa tác động dị ứng quercetin có ý nghĩa to lớn việc điều trị phòng ngừa bệnh hen suyễn viêm phế quản [15] Tương tự quercetin, rutin nghiên cứu ứng dụng nhiều y học đại Rutin có tác dụng làm bền vững thành mạch, làm giảm tính thấm mao mạch, tăng bền vững hồng cầu Rutin có hoạt tính vitamin P cấu trúc có nhóm OH phenolic tự Rutin thể hoạt tính chống đái tháo đường cách ức chế cytokine gây viêm, đồng thời cải thiện khả chống oxy hóa lipid huyết tương chế độ ăn nhiều chất béo người bệnh tiểu đường týp streptozotocin gây Do đó, rutin hữu ích điều trị bệnh tiểu đường với loại thuốc trị tiểu đường tiêu chuẩn [16] Rutin đóng vai trị tác nhân tiềm để kiểm sốt đường huyết thơng qua việc tăng cường hoạt động kinase thụ thể phụ thuộc insulin, từ tạo đường truyền tín hiệu insulin làm tăng chuyển vị chất vận chuyển glucose tăng hấp thu glucose [17] Rutin bảo vệ chống lại tác động thối hóa thần kinh tích tụ prion cách tăng sản xuất yếu tố hướng thần kinh ức chế kích hoạt 15 apoptotic tế bào thần kinh Những kết cho thấy rutin có lợi ích lâm sàng bệnh prion rối loạn thoái hóa thần kinh khác [18] Rutin hữu ích chất bổ trợ điều trị chất phóng xạ, flavonoid làm tăng hấp thụ iodide tuyến giáp mà không ảnh hưởng nhiều đến chức tuyến giáp [19] 1.1.4 Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe điều chế quercetin Rutin thường chiết xuất nước, dung dịch kiềm số ancohol ethanol, methanol Chiết xuất rutin dung dịch kiềm axit loãng: Phương pháp tác giả T.R.Seshadri: hoa hòe chiết xuất dung dịch nước chứa hỗn hợp NaOH boric (tỉ lệ 1:2) Lọc, axit hóa dịch chiết thu rutin với hiệu suất 13% [20] Phương pháp tác giả Nguyễn Văn Đàn- Đỗ Tất Lợi: Cân 200g hoa hòe sấy khô 60-70oC, thêm vào 2L nước, đun sôi Lọc nóng qua vải, bã cịn lại đun với lượng nước lọc (làm lần) Gộp chung tất dịch lọc, để nguội có rutin kết tủa vàng (thô) Kết tinh lại rutin thô cách hịa tan nước sơi, lọc nóng, để nguội Rutin kết tủa, lọc lấy sản phẩm, sấy khô 70oC thu bột rutin màu vàng thẫm [20] Phương pháp nhóm tác giả thuộc viện Nghiên cứu phát triển sản phẩm thiên nhiên (IRDOP) hoa hòe giã dập, rửa HCl 0,5% rửa nước cho hết axit Chiết dung dịch Na2CO3 1% natri borat 1-3% Rutin tan nhiều có chức phenol phân tử Rút dịch chiết tiếp tục chiết hết rutin (3-4 lần) Gộp dịch chiết lại, dùng HCl điều chỉnh đến pH=2 ta có rutin kết tủa Lọc rửa tủa nước đến pH=4-5 Hoà tan, kết tinh lại cồn thu rutin tinh khiết [20] Chiết xuất rutin ancohol: Phương pháp nhóm tác giả Rusu, Mircea, Eugenia: Nụ hòe hoa hòe chiết MeOH-H2O, lọc bỏ bã thu thể huyền phù Sau cho hỗn 16 hợp isopropanol-dầu (1:1) vào, đem lọc thu rutin thô Rutin thô xử lý NaHCO3-NH3 Tinh chế lại lần EtOH [20] Đun hồi lưu kg hoa hịe sấy khơ với 4L cồn 90 o Rút dịch chiết, bã lại đun với 4L cồn lọc (làm lại lần) Gộp chung dịch lọc cất thu hồi dung môi đến 5L cồn Đề nguội thu rutin thô Kết tinh lại rutin thô cồn, tẩy màu than hoạt ta có rutin tinh khiết Phương pháp chiết cồn cho hiệu suất cao, tỷ lệ rutin hoa hoè lên đến 20-30% [21] Điều chế quercetin thủy phân rutin: Hình 1.5: phản ứng thủy phân rutin môi trường axit Theo nghiên cứu nhóm tác giả Jinwoo Yang cộng sự, rutin hịa tan hỗn hợp dung mơi axit cồn (80% etanol HCl 1,0 M nước) Dung dịch lắc máy lắc cách thủy 75°C với sinh hàn hồi lưu Khi phản ứng hoàn tất, sản phẩm phản ứng quercetin làm lạnh nước lạnh Dung môi sản phẩm phản ứng loại bỏ cách cô quay chân không đông khô [22] 1.2 CYCLODEXTRIN VÀ PHỨC HỢP THÀNH PHẦN LỒNG NHAU 1.2.1 Khái quát cyclodextrin β-cyclodextrin Cyclodextrin nhóm sản phẩm tự nhiên hình thành q trình tiêu hóa cellulose vi khuẩn Cyclodextrin có cấu trúc oligosaccarit tuần hoàn, bao gồm đơn vị α-D-glucopyranose liên kết với nhau, tạo khoang trung tâm ưa dầu bề mặt ưa nước Do cấu tạo dạng ghế đơn vị glucopyranose, cyclodextrin có hình dạng giống hình nón cụt hình trụ hồn hảo Các nhóm chức hydroxyl định hướng bên ngồi hình nón, nhóm hydroxyl phần đường cạnh hẹp hình nón nhóm 17 hydroxyl thứ cấp cạnh rộng Khoang trung tâm nối khung nguyên tử carbon oxy thuộc nhóm ether phần glucose, tạo cho đặc tính lipophilic Độ phân cực khoang ước tính tương tự dung dịch etanolic Các α-, β- γ-cyclodextrin tự nhiên bao gồm sáu, bảy tám đơn vị glucopyranose tương ứng [23] Hình 1.6: Cấu trúc hóa học hình dạng phân tử β-cyclodextrin (βCD) Các α- β-cyclodextrin tự nhiên không giống γ-cyclodextrin, bị thủy phân amylase nước bọt tuyến tụy người Tuy nhiên, α- β-cyclodextrin lên men hệ vi sinh đường ruột Cyclodextrin hydrophilic coi khơng độc hại liều uống thấp đến trung bình Các dẫn xuất cyclodextrin lipophilic, chẳng hạn cyclodextrin bị methyl hóa, mức độ hấp thụ từ đường tiêu hóa vào hệ tuần hồn chứng minh độc hại sau tiêm tĩnh mạch [20] Hình 1.7: Một số cyclodextrin tự nhiên điển hình 18 Hình 3.11 biểu diễn kết phân tích nhiệt quét vi sai Quer vùng nhiệt rộng với đỉnh nội nhiệt 1400C tương ứng với điểm nóng chảy Quer Tương tự βCD, phổ DSC HPβCD cho vùng rộng (từ 600C đến 1250C) tương ứng với q trình giải phóng phân tử nước từ khoang bên HPβCD với nhiệt độ nóng chảy 88oC So sánh đường cong nhiệt phức hợp với đường cong Quer HPβCD cho thấy, đỉnh nội nhiệt HPβCD phức hợp 790C, thay đổi không nhiều cường độ pic giảm kể so với HPβCD Đỉnh nội nhiệt Quer phức giảm rõ rệt gần biến (133 0C) Đây minh chứng cho thấy có tương tác Quer HPβCD, phần phân tử Quer vào khoang rỗng HPβCD tạo phức 3.3.3 Kết phân tích hình thái cấu trúc Hình thái học bề mặt RuT, Quer, trước sau tạo phức thể hình 3.12 a) b) c) d) Hình 3.12: Ảnh FESEM hạt RuT (a), Quer (c), [RuT-βCD] (b) [Quer-HPβCD] (d) 60 Từ hình 3.12 ta nhận thấy, RuT Quer (hình a b) có cấu trúc dạng nhỏ mảnh khắp bề mặt tinh thể Sau tạo phức, (Hình c d), hạt thu có dạng hình cầu, đồng với kích thước trung bình 40-60 nm Đây giá trị tương ứng với kích thước điển hình đơn vị chức thể sống, cho phép chúng tương tác hiệu với phân tử sinh học, làm tăng tính khả dụng sinh học hạn chế số tác dụng phụ diện lâu dài niêm mạc dày Trong ảnh hiển vi phức hợp [Quer-HPβCD] (Hình 3.12d), hạt nano có bề mặt có độ xốp nhám cao Tuy nhiên, hình dạng hạt nano khơng qn có xu hướng kết tụ Kích thước chúng thay đổi từ vài nm đến 100 nm 3.3.4 Kết xây dựng giản đồ pha q trình hồ tan Xây dựng giản đồ q trình hịa tan thường áp dụng lĩnh vực hóa học siêu phân tử để xác định tỉ lệ phản ứng chất số bền phức chất Khái niệm giản đồ pha hòa tan lần đưa tác giả Higuchi Connors thể độ hòa tan thuốc thay đổi nồng độ cyclodextrin tăng lên Trước xác định giản đồ pha hòa tan cần phải xây dựng phương trình đường chuẩn hoạt chất dung dịch phương pháp pha loãng đa nồng độ máy quang phổ UV-Vis Các phương trình đường chuẩn sử dụng để tính tốn nồng độ hịa tan RuT Quer dung mơi có chứa cyclodextrin Hình 3.13 trình bày ví dụ phổ hấp thụ UV-Vis dung dịch quercetin khơng có HPβCD (đường cong a) có nồng độ HPβCD tăng (đường cong 1-5) khoảng ÷ mM Có thể thấy khoảng 300 - 450 nm, Quer thể cực đại hấp thụ (đường cong a) bước song 370 nm, coi chuyển tiếp vòng benzen đơn (Buchweitz M cộng sự, 2016 ) Các đường cong 1-5 hình 3.13 cho thấy hình thành phức hợp bao Quer với HPβCD dẫn đến hiệu ứng bathochromic: hấp thụ cực đại bị dịch chuyển phía bước sóng dài (375 nm) 61 0.25  = 375 nm 0.20 Absorbance 0.15 a 0.10  = 370 nm 0.05 0.00 300 350  / nm 400 450 1.0x10-4 0.08 8.0x10-5 CQuer, mol/l CRu, mmol/l Hình 3.13: Phổ UV-Vis quercetin khơng có HPβCD (đường cong a) có HPβCD với nồng độ tăng dần (đường cong 1-5) Từ phương trình đường chuẩn hoạt chất ta xác định xác nồng độ RuT Quer hòa tan dung dịch cyclodextrin Mối tương quan nồng độ phân tử chủ độ tan phân tử khách trình bày hình 3.14 0.06 0.04 6.0x10-5 4.0x10-5 0.02 2.0x10-5 0.0 0.00 CCD, mmol/l 2.0x10-3 4.0x10-3 6.0x10-3 8.0x10-3 CHPCD, mol/l b) a) Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ cyclodextrin độ tan RuT (a) Quer (b) Kết cho thấy, độ tan RuT Quer tăng lên đáng kể phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cyclodextrin dung dịch, kết cụ thể trình 62 bày bảng 3.4 Hình dạng tuyến tính chứng minh tỉ lệ hóa học tốt để tạo phức hợp thành phần hai hệ 1:1 Bảng 3.4: Kết phân tích giản đồ pha trinh hòa tan với phức hợp [RuT-βCD] [Quer-HPβCD] Phức hợp giản đồ pha q trình hịa tan Hệ số Hằng Biến thiên hồi quy số bền lượng Gibbs, kJ/mol [RuT-βCD] y=0.0226x+0,00012 0,992 154 -12,48 [Quer-HPβCD] y=0,00792x+0,00002 0,989 363 -14,60 Biến thiên lượng Gibbs phản ứng tạo phức tính tóán dựa vào phương trình: ∆rG = – RTlnK (3), kết thống kê bảng 3.4 Như vậy, phản ứng tạo phức tự diễn môi trường nước nhiệt độ 298K Các kết thu phù hợp với kết nghiên cứu mà tác giả I M Savic cộng thu công bố 3.3.5 Kết xác định độ hòa tan rutin phức hợp [RuT-βCD] Tương tự phần 3.3.4 trước xác định độ tan rutin dung dịch có pH 7,4 ta xây dựng phương trình đường chuẩn RuT theo phương pháp pha loãng đa nồng độ Kết thu phương trình đường chuẩn RuT y=13752x-0,0031 với hệ số hồi quy R2=0,9995 Hình 3.13 biểu diễn độ tan rutin trước sau tạo phức theo thời gian mơi trường pH 7,4 63 Hình 3.15: Phần trăm hòa tan RuT phức [RuT-βCD] theo thời gian mơi trường pH 7,4 Từ hình 3.15 thấy, tất thời điểm rút mẫu, phức có độ hịa tan tốt rutin Ở phút thứ sau hòa tan, độ tan phức đạt giá trị 85% đạt giá trị lớn 97% khoảng thời gian nghiên cứu Ngược lại, độ tan lớn rutin dạng tự 78% sau 110 phút Như vậy, việc tạo phức nano với β-cyclocdextrin cải thiện rõ rệt độ tan rutin 3.3.6 Kết xác định khả bắt gốc tự DPPH rutin phức hợp [RuT-HPβCD] Khả bắt gốc tự DPPH mẫu nồng độ khác trình bày hình 3.16 Từ hình 3.16 ta nhận thấy, theo tăng dần nồng độ từ 0,5 µg/ml – 14 µg/ml, tỉ lệ % bắt gốc tự DPPH rutin phức hợp tăng dần Ở nồng độ, % khả bắt gốc tự DPPH phức hợp cao rutin Với nồng độ 14 µg/ml, tỉ lệ % khả bắt gốc tự rutin phức hợp 67% 75% Các phương trình hồi quy đơn giản thể mối tương quan tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH nồng độ dược chất xây dựng dựa vào phần mềm Origin Trên sở đó, phương trình chọn phương trình có 64 Hoạt tính chống oxi hóa, % hệ số tương quan tương quan hiệu chỉnh cao với độ tin cậy > 95% Từ phương trình ta xác định giá trị IC50 rutin phức hợp giá trị nồng độ dược chất, mà % khả bắt gốc tự DPPH đạt 50% Kết trình bày bảng 3.4 80 [RuT-CD] 70 RuT 60 50 40 30 20 10 10 12 14 CRuT, g/ml Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn mối tương quan % bắt gốc tự DPPH rutin phức [RuT-HPβCD] theo giá trị nồng độ rutin Bảng 3.5: Phương trình tương quan % bắt gốc tự DPPH nồng độ dược chất rutin phức hợp giá trị IC50 tương ứng Phương trình tương quan Hệ số hồi quy Giá trị IC50, µg/ml RuT y=3,2346+5,63x 0,996 8,31 [RuT-HPβCD] y=11,54+5,287x 0,995 7,27 Từ bảng 3.5 ta nhận thấy sau tạo phức hoạt tính chống oxi hóa rutin tăng lên rõ rệt: giá trị IC50 giảm từ 8,31 xuống 7,27 µg/ml Như vậy, việc tạo phức nano với cyclodextrin cho thấy kết khả quan việc cải thiện độ tan sinh khả dụng dược chất 65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN -Trong nghiên cứu này, rutin chiết xuất dung dịch Na2CO3 2% tinh chế axit axetic nồng độ khác khoảng 10-50%, quercetin thu từ rutin tinh chế cồn 960 Kết phân tích sắc ký mỏng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân sắc ký lỏng hiệu cao cho thấy rutin thu có dạng bột màu vàng, độ tinh khiết đạt giá trị cực đại 98,83% tinh chế axit axetic 40%; quercetin có dạng bột màu vàng xanh, độ cao ˗ Phức chất rutin với β-cyclodextrin quercetin với hydroxypropyl-βcyclodextrin tổng hợp thành công dung môi hỗn hợp nước-cồn tuyệt đối phương pháp đồng kết tủa Hiệu suất tổng hợp phức dung môi hỗn hợp tất điểm nghiên cứu lớn giá trị tương ứng môi trường nước Giá trị hiệu suất đạt cực đại 73% 80% dung mơi có hàm lượng EtOH 15-20% v/v ˗ Kết nghiên cứu đặc trưng phức chất phương pháp FTIR, UVVis, DLS, DSC phân tích hình thái cấu trúc vật liệu FESEM cho thấy có dịch chuyển suy giảm mạnh dao động đặc trưng cho liên kết C=C, O-H CO-H phân tử rutin, chứng tỏ phần phân tử rutin chui vào bên khoang rỗng phân tử chất mang; đỉnh nội nhiệt rutin phức giảm đáng kể cường độ nhiệt độ; kích thước hạt đồng với đường kính ~ 50-60 nm ˗ Sự khác biệt chủ yếu quang phổ IR phức [Quer-HPβCD] so với Quer HPβCD là: dải dao động hóa trị liên kết O-H phức (3424 cm-1) mở rộng so với dao động tương ứng HPβCD; dao động hóa trị liên kết carbonyl thơm đặc trưng quercetin chuyển sang vùng có số sóng 66 ngắn 1646 cm-1 với việc suy giảm cường độ rõ rệt, chứng tỏ liên kết C=O tham gia vào việc tạo phức Kết DSC cho thấy, Đỉnh nội nhiệt Quer phức giảm rõ rệt gần biến (1330C) ˗ Kết xây dựng giản đồ pha q trình hịa tan cho thấy, nước rutin quer tạo phức với CD theo tỷ lệ stoichometric 1:1, độ tan của dược chất tăng lên đáng kể phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ CD dung dịch ˗ Độ tan rutin phức hợp theo thời gian khảo sát Tại tất điểm rút mẫu, độ tan phức cao độ tan rutin ˗ Khả bắt gốc tự DPPH phức hợp cao rutin Cụ thể, hoạt tính chống oxi hóa rutin sau tạo phức tăng lên rõ rệt: giá trị IC50 giảm từ 8,31 xuống 7,27 µg/ml 4.2 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu nhận thấy: ˗ Việc sử dụng axit axetic để tinh chế rutin hồn tồn thay axit HCl với độ tinh lên đến >98% Hơn việc sử dụng axit axetic có ưu điểm an tồn với người lao động, không độc hại lại không gây tổn hao thiết bị, máy móc, cần nghiên cứu quy mô rộng ˗ Việc tăng độ tan hoạt chất phức hợp tạo thành mà kích thước hạt ảnh hưởng đáng kể Do đó, việc tạo phức nano có kích thước ổn định, nhỏ quan tâm nghiên cứu ˗ Độ tan, khả bắt gốc tự quercetin phức [Quer-HPβCD] cần nghiên cứu 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Peng Z.F., Strackb D., Baumert A et al, Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropip L, Phytochem, 2003 (62): 219-504 A N Panche, A D Diwan and S R Chandra, Flavonoids: an overview Journal of Nutritional Science (2016), vol 5, e47, page 1-15 doi:10.1017/jns.2016.41 Satyendra et al, A review of quercetin: Antioxidant and anticancer properties, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Volumee 11, Issue 1, 146-160 Ross JA, Kasum CM, Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety, Annu Rev Nutr 2002;22:19-34 Hollman PC, Bijsman MN, van Gameren Y, et al, The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man, Free Radic Res 1999;31:569-573 Hosseinzadeh H, Nassiri-Asl M, Review of the protective effects of rutin on the metabolic function as an important dietary flavonoid, J Endocrinol Invest 2014; 37: 783–788 Salvamani S, Gunasekaran B, Shaharuddin NA, Ahmad SA, Shukor MY, Antiartherosclerotic effects of plant flavonoids, Biomed Res Int 2014 2014: 480258 Sultana B, Anwar F, Flavonols (Kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chem 2008; 108:879–84 Lakhanpal P, Rai DK, Quercetin: A versatile flavonoid, Int J Med Update, 2007; 2:22–37 10 Akan Z, Garip AI, Antioxidants may protect cancer cells from apoptosis signals and enhance cell viability, Asian Pac J Cancer Prev, 2013; 14:4611–4 68 11 Vásquez-Garzón VR, Arellanes-Robledo J, García-Román R, AparicioRautista DI, Villa-Treviño S, Inhibition of reactive oxygen species and preneoplastic lesions by quercetin through an antioxidant defense mechanism, Free Radic Res 2009; 43:128–37 12 Johari J, Kianmehr A, Mustafa MR, Abubakar S, Zandi K, Antiviral activity of baicalein and quercetin against the Japanese encephalitis virus, Int J Mol Sci 2012; 13:16785–95 13 Cushnie TP, Lamb AJ, Antimicrobial activity of flavonoids Int J Antimicrob Agents, 2005; 26:343–56 14 Ramos FA, Takaishi Y, Shirotori M, Kawaguchi Y, Tsuchiya K, Shibata H, et al, Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products from yellow onion (Allium cepa) skin, J Agric Food Chem 2006; 54:3551–7 15 Coles LS Quercetin: A Review of Clinical Applications, Available : http://www.chiro.org/nutrition/ABSTRACTS/Quercetin_A_Review.shtml 16 P Stanley Mainzen Prince, N Kamalakkannan, Rutin improves glucose homeostasis in streptozotocin diabetic tissues by altering glycolytic and gluconeogenic enzymes, J Biochem Mol Toxicol, 20 (2) (2006), pp 96-102 17 N Kamalakkannan, P.S Prince, Antihyperglycaemic and antioxidant effect of rutin, a polyphenolic flavonoid, in streptozotocin-induced diabetic wistar rats, Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98 (1) (2006), pp 97-103 18 J Nones, A.P Costa, R.B Leal, F.C Gomes, A.G Trentin, The flavonoids hesperidin and rutin promote neural crest cell survival, Cell Tissue Res., 350 (2) (2012), pp 305-315 19 C.F Gonỗalves, M.C Santos, M.G Ginabreda, R.S Fortunato, D.P Carvalho, A.C Freitas Ferreira, Flavonoid rutin increases thyroid iodide uptake in rats, PLoS One, (9) (2013), p e73908 69 20 Nguyễn Hoàng Hợp (2002) Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hòe (Sophora japonica L Fabaceae) Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học Dược Hà Nội 21 Beatriz Gullon et al Rutin: A review on extraction, identification and purification methods biological activities and approaches to enhance its bioavailability Trends in Food Science & Technology 67 (2017) 220-235 22 Jinwoo Yang et al Conversion of Rutin to Quercetin by Acid Treatment in Relation to Biological Activities Prev Nutr Food Sci 2019 Sep; 24(3): 313–320 23 A Magnúsdóttir, M Másson and T Loftsson, J Incl Phenom Macroc Chem 44, 213-218, 2002 24 Del Valle EMM (2004), Cyclodextrins and their uses: a review, Process Biochem 39: 1033-1046 25 K Miyake, H Arima, F Hirayama, M Yamamoto, T Horikawa, H Sumiyoshi, S Noda, K Uekama, Improvement of solubility and oral bioavailability of rutin by complexation with 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, Pharm Dev Technol 5(3) (2000) 399–407 DOI: 10.1081/pdt-100100556 26 S Shuang, J Pan, S Guo, M Cai, C Liu, Fluorescence study on the inclusion complexes of rutin with β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin, Anal Lett 30(12) (1997) 2261–2270 DOI: 10.1080/00032719708001737 27 I.M Savic, I.M Savic-Gajic, V.D Nikolic, B.L Nikolic, B.C Radovanovic, A Milenkovic-Andjelkovic, Enhencemnet of solubility and photostability of rutin by complexation with β-cyclodextrin and (2-hydroxypropyl)β-cyclodextrin, J Incl Phenom Macrocycl Chem 86 (2016) 33–43 DOI 10.1007/s10847-016-0638-8 28 Azat Bilalov, Jonas Carlstedt et al, DNA with amphiphilic counterions: tuning colloidal DNA with cyclodextrin, Soft Matter, 2012, 8, 4988–4994 70 29 Sylvan G Frank Inclusion Compounds Journal of Pharmaceutical sciences.Vol 64, No 10, October 1975 1585-1604 30 Patil J.S et al, Inclusion complex system; A novel technique to improve the solubility and bioavailability of poorly soluble drugs: A review, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Volume 2, Issue 2, May – June 2010; Article 006, 29-34 ISSN 0976 – 044X 31 Nerome H., Machmudah S., Wahyudiono et al Nanoparticle formation of lycopene/β-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent precipitation The Journal of Supercritical Fluids 2013 (83): 97-103 32 Khalid Q., Ahmad M., Minhas M U Synthesis of β-cyclodextrin hydrogel nanoparticles for improving the solubility of dexibuprofen; Characterization and Toxicity Evaluation Drug Development and Industrial Pharmacy, 2017 DOI:10.1080/03639045.2017.1350703 33 Coneac G., Gafiţanu E., Hădărugă N G et al Quercetin and rutin/2hydroxypropyl-β-cyclodextrin nanoparticles: obtaining, characterization and antioxidant activity Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 2009 (15) (3): 441-448 34 Bùi Quang Thuật Nghiên cứu công nghệ tạo hương liệu bột từ cyclodextrin, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 2010, 48, 67-69 35 Nguyễn Ngọc Sao Mai, Nguyễn Thanh Hải, Võ Thụy Cẩm Vy, Huỳnh Văn Hóa Nghiên cứu điều chế đánh giá phức hợp piroxicam-cyclodextrin Tạp chí Dược học, 2009, 5, 19-23 36 Tiêu Vĩnh Thuận, Phạm Đình Duy, Huỳnh Văn Hóa Tối ưu hóa quy trình sản xuất viên nén chứa phức piroxicam-beta cyclodextrin thiết kế thực nghiệm Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 2010, 1, 169-173 37 Phùng Đức Truyền, Nguyễn Phước Trường, Huỳnh Văn Hóa, Đặng Văn Tịnh Nghiên cứu điều chế hệ phân tán rắn hydroxybutyl-beta-cyclodextrin làm tăng độ tan rutin Tạp chí Dược học, 2013, 442, 53, 23-27 71 38 Phan Thanh Thảo Nghiên cứu tổng hợp phức chất curcumincyclodextrin curcumin-phospholipid kỹ thuật CO2 siêu tới hạn Báo cáo đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, 2015 39 Nguyen T.-D., Tran T Hong-Ngan, Nguyen C.H et al Synthesis and Characterization of β-Cyclodextrin/alginate Nanoparticle as a Novel Drug Delivery System Chem Biochem Eng Q., 2015, 29(3), 429–435 40 Z Yuan, Y, Ye, F Gao, H Yuan, M Lan, K Lou, W Wang, Chitosangraf-β-cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release Int J Pharm., 2013, 446, 191–198 41 Nguyễn Cao Hiền, Tan Văn Hâu, Lê Thị Thanh Vân, Võ Tuấn Quốc, Tổng hợp hệ nano hydroxypropyl-betacyclodextrin/alginate làm vật liệu mang thuốc, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm, 2017, 13(1), 89-94 42 Corciovă A., Caşcaval D Characterization of rutin-cyclodextrin inclusion compounds // Chemistry & Chemical Engineering, Biotechnology, Food Industry 2011 (12) (4): 341 – 346 43 Coneac G., Gafiţanu E., Hădărugă N G et al Quercetin and rutin/2hydroxypropyl-β-cyclodextrin nanoparticles: obtaining, characterization and antioxidant activity Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 2009 (15) (3): 441-448 44 Paczkowska M., Mizera M., Piotrowska H Complex of Rutin with βCyclodextrin as Potential Delivery System PloS ONE 2015 (10) (3): e0120858 45 T V Ilyich et al Inclusion Complexes of Quercetin with βCyclodextrins: Ultraviolet and Infrared Spectroscopy and Quantum Chemical Modeling Biophysics, 2020, Vol 65, No 3, pp 381–389 46 Nguyen T A., Liu B., Zhao J et al An investigation into the supramolecular structure, solubility, stability and antioxidant activity of rutin/cyclodextrin inclusion complex Food Chemistry 2013 (136): 186–192 72 47 Savic I M., Savic-Gajic I M., Nikolic V D Enhencemnet of solubility and photostability of rutin by complexation with β-cyclodextrin and (2hydroxypropyl)-β-cyclodextrin Incl Phenom Macrocycl Chem 2016 (86): 33-43 48 Pham Thi Lan et al Quercetin nanoparticles: Obtaining, characteristics and potential application improved water solubility of quercetin by preparing complexation with cyclodextrins in binary solvent 49 Hand book of Thin Layer Chromatography, Sherma, J.and Fried, B (authors) 3rd ed Marcel Dekker,New York 50 Nguyễn Đình Triệu (2013), Các Phương Pháp Phổ Trong Hóa Học Hữu Cơ, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia, Hà Nội 51 Malviya R, Bansal V., Pal O.P and Sharma P.K High performance liquid chromatography: a short review Journal of Global Pharma Technology 2010; 2(5): 22-26 52 T Higuchi, K.A Connors, Phase-solubility techniques, Adv Anal Chem Instrum (1965) 117-212 53 Molecular biology, vol.6 Moscow 1975 tr 7–33 54 Joseph Goldstein, Dale E Newbury, David C Joy, Charles E Lyman, Patrick Echlin, Eric Lifshin, L.C Sawyer, J.R Michael (2003) Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis Springer; 3rd ed ISBN-13 978-0306472923 55 Brand – Williams, W., Cuvelier, M E & Berset, C (1995), “Use of free radical method to evaluate antioxidant activity”, LWT, Vol 28, pp 25 – 30 56 Le Thi My Chau, Vu Dinh Hoang, Nguyen Thi Minh Tu, Tran Dinh Thang CHEMICAL CONSTITUENTS OF THE RHIZOMES OF Zingibercollinsii Mood &Theilade (ZINGIBERACEAE) GROWING IN VIETNAM Journal of Science and Technology 54 (4A) (2016) 283-289 57 Yoshii H., Kometani T., Furuta T et al Formation of Inclusion Complexes of Cyclodextrin with Ethanol under Anhydrous Conditions Biosci Biotechnol Biochem 1998 (62): 2166-2170 73 58 Coleman A.W, Munoz M., Chatjigakis A.K Classification of the solubility behaviour of β-cyclodextrin in aqueous-co-solvent mixtures J Phys Org Chem 1993 (6): 651-659 59 Kukushkin V.Yu., Kukushkin Yu.N Theory and Practice of the Synthesis of Coordination Compounds Nauka, incl Leningrad 1990, 127-141 60 Gamov G.A., Khokhlova A.Yu., Gushina A.S et al Protolytic and tautomeric equilibria of pyridoxine in aqueous ethanol J Chem Therm., 2016 (97): 322-330 61 Al-Nasiri G., Cran M J., Smallridge A J., Bigger S W Optimisation of β-Cyclodextrin Inclusion Complexes with Natural Antimicrobial Agents:Thymol, Carvacrol and Linalool J Microencapsul 2018 (35) (1): 26-35 74 ... 1: với phân tử khách, bao b? ??c khoang phân tử chủ Các hợp chất cyclodextrin, bis N, N’-alkylenebenzidine, thuốc kháng sinh số protein định phân loại nhóm Một số protein định hoạt động phức hợp bao. .. thuật ngữ phức hợp bao đại phân tử “r? ?y phân tử” sử dụng để mơ tả nhóm phức hợp bao cao phân tử Các hợp chất nghiên cứu rộng rãi sử dụng quy trình cơng nghiệp phịng thí nghiệm Phức hợp bao đơn... tử β -cyclodextrin (βCD) Các α- β -cyclodextrin tự nhiên không giống γ -cyclodextrin, b? ?? th? ?y phân amylase nước b? ??t tuyến t? ?y người Tuy nhiên, α- β -cyclodextrin lên men hệ vi sinh đường ruột Cyclodextrin