Luận văn nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào dạng huyền phù cây dừa cạn ( catharanthus roseus l ) của việt nam

MỞ ĐẦU Từ lâu thực vật nguồn cung cấp số lƣợng khổng lồ hợp chất hóa học có hoạt tính đƣợc dùng làm thuốc Các hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hƣơng vị mỹ phẩm Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp gián tiếp từ thực vật có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp bán tổng hợp thay Vì nguồn sinh khối thực vật ngày tăng cao nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp có hoạt tính dƣợc học đòi hỏi cấp bách Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có bƣớc phát triển vƣợt bậc, phƣơng pháp thay thích hợp việc tạo nguồn sinh khối quy mô khác không phụ thuộc vào mùa vụ Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn tiến hành nơi điều kiện vô trùng sử dụng chất bảo vệ thực vật độc hại Một tiến đáng kể kỹ thuật nuôi cấy mơ thực vật tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào khơng bị biệt hóa) thực vật để nghiên cứu hoạt tính sinh học sản xuất chất trao đổi thứ cấp có giá trị Ni cấy tế bào huyền phù cịn giải pháp để cải thiện khó khăn nồng độ chất trao đổi thứ cấp thấp đƣợc phát triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ thơng đỏ, có tác dụng chữa ung thƣ) Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G Don) dƣợc liệu, chứa nhiều chất thứ cấp khác có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine vincristine để điều trị số bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết (lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, khối u dạng Wilkin ung thƣ tế bào lƣới Trên thực tế nhu cầu alkaloid ngày tăng, nhƣng trình sản xuất hợp chất gặp nhiều khó khăn hai hợp chất có mặt dừa cạn với hàm lƣợng thấp, khoảng 0,00020,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid phụ thuộc vào giống quan khác Vì thế, sử dụng kỹ thuật ni cấy tế bào in vitro để phát triển sinh khối sau điều khiển sinh tổng hợp chất thứ cấp có giá trị đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt dừa cạn, nhiên kết hạn chế phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu tập trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn (Catharanthus roseus L.) Việt Nam” nhằm chọn tạo đƣợc dòng tế bào có khả phát triển sinh khối với tốc độ nhanh giữ đƣơc khả tổng hợp chất thứ cấp Kết luận văn sở cho nghiên cứu nhằm cải thiện khả tổng hợp chất thứ cấp tế bào dừa cạn điều kiện in vitro Để đạt đƣợc mục tiêu, công việc cụ thể đƣợc tiến hành nhƣ sau: Nghiên cứu ảnh hƣởng vật liệu, mơi trƣờng, chất kích thích sinh trƣởng khác đến khả hình thành mơ sẹo 02 giống dừa cạn Việt Nam Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo dừa cạn đƣợc chọn lọc CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố Dừa cạn có tên khoa học Catharanthus roseus (L) G Don, tên thƣờng gọi dừa cạn bơng dừa hay trƣờng xn hoa lồi thực vật thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae) Chi Catharanthus gồm lồi, lồi có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar (C coriaceus, C lanceus, C longifolius, C ovalis, C roseus, C scitulus, C trichophyllus) loài C pusillus từ Ấn Độ Loài Catharanthus roseus (L) G Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố nhiều vùng, trải dài từ Bắc vào Nam [1] Loài chủ yếu đƣợc trồng nƣớc nhiệt đới, vùng lạnh đƣợc trồng vào mùa hè khơng chịu đƣợc lạnh Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195) Dừa cạn dạng thƣờng xanh thân thảo, cao tới 80 cm đến m hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím trắng [2] Lá có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm rộng từ 1- 3,5 cm, khơng có lơng, màu xanh bóng với gân màu nhạt cuống ngắn khoảng 1-1,8 cm đƣợc xếp theo cặp đối diện Hai giống C roseus phổ biến đƣợc đặt tên dựa màu hoa, bao gồm giống hoa màu hồng Rosel giống hoa màu trắng Alba Hoa có nhiều màu từ màu trắng đến hồng đậm với hoa gồm cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần 10 ống vành, tâm bì rời nỗn sào với năm cánh giống thùy hoa Quả cặp nang dài khoảng 2-4 cm rộng mm Dừa cạn C roseus loài khác biệt với hầu hết loài khác họ khả tự tƣơng thích Tuy nhiên, q trình tự thụ phấn hoa thƣờng không xảy dừa cạn tách biệt vật lý nhụy bao phấn, tƣợng đƣợc gọi herkogamy ngƣợc, nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3] Ở Việt Nam, dừa cạn hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định Phú n Ngồi dừa cạn cịn xuất đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo Phú Quốc [1] Ở vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có mọc gần nhƣ loại bãi cát dƣới rừng phi lao, trảng cỏ bụi thấp, có khả chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn vùng cát ven biển 1.1.2 Giá trị y học Catharanthus roseus đƣợc coi nhà máy sản xuất đến 130 terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, có nhiều chất có hoạt tính dƣợc học quan trọng đƣợc dùng điều trị ung thƣ, tiểu đƣờng, cao huyết áp, dị ứng, táo bón nhiều bệnh đƣờng ruột Trong đó, vinblastine hợp chất đƣợc FDA (Food and Drug Administration) Mỹ phê duyệt vào năm 1965 trở thành thành phần phƣơng pháp hóa trị liệu điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, u bạch huyết, ung thƣ vú, ung thƣ phổi tế bào nhỏ…, đƣợc bán thị trƣờng 40 năm Ngoài ra, vincristine vinblastine cịn thể hoạt tính kháng khuẩn [4] Một hợp chất khác nhóm TIA ajmalicin đƣợc sử dụng làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline đƣợc nghiên cứu ứng dụng điều trị bệnh tiểu đƣờng [5] Khi nghiên cứu để phát chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết từ dừa cạn Việt Nam, Nguyen cs [6] 11 phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme glucosidase từ rễ dừa cạn thu hái Hoài Nhơn, Bình Định, có chất lần đƣợc phân lập từ lồi Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thƣ ngƣời, gồm ung thƣ gan (HepG2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7), melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính (HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) ung thƣ ruột kết (HT-29) có kết định Mặc dù có vai trị quan nhƣng cấu trúc phức tạp vinblastine vincristine làm cho việc tổng hợp hóa học chất khó khăn Dừa cạn đƣợc dùng phổ biến thuốc Đông y để trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thơng tiểu tiện, bệnh tiểu đỏ Một số trƣờng hợp cịn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi [7] Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên Việt Nam tƣơng đối dồi Trƣớc năm 1975, miền Bắc xuất sang Đông Âu 1-3 tấn/năm Những năm gần đây, lƣợng xuất sang Pháp (khoảng 10 tấn/năm) thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu từ trồng Phú Yên 1.2 Nuôi cấy mô tế bào thuốc in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc đầu kỷ 20 Trong năm 1940 1960, tiến công nghệ dẫn đến phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động tế bào (bao gồm tế bào học, dinh dƣỡng, chuyển hóa, q trình phát sinh hình thái, hình thành phôi bệnh học), tạo bệnh điều kiện lƣu trữ tế bào nhân giống vô tính Từ năm 1960, q trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhiều loại tế bào thực vật nhiều ứng dụng đƣợc phát triển, cải thiện đáng kể cho q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật trở thành công cụ hiệu để sản xuất quy mơ lớn chất chuyển hóa thứ 12 cấp dùng chăm sóc sức khỏe cho ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung thƣ) [8] Những ƣu điểm hệ thống ni cấy mơ tế bào so với trồng trọt tự nhiên bao gồm: hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn đƣợc tạo liên tục khơng phụ thuộc yếu tố bên ngồi nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai khí hậu; tế bào nuôi cấy không bị đe dọa công vi sinh vật côn trùng; tế bào loài thực vật chí lồi q có nguy tuyệt chủng dễ dàng trì để tạo chất chuyển hóa thứ cấp; trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp điều khiển nhằm giảm chi phí cải thiện suất 1.2.1 Các xu hướng sản xuất chất thứ cấp in vitro Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất tế bào, mô quan đơn từ phân bào, tạo tế bào, mơ quan, có gen di truyền mẹ Việc sử dụng kỹ thuật in vitro để tạo chất thứ cấp, đặc biệt chất có hoạt tính dƣợc học có ƣu điểm nhƣ khơng bị ảnh hƣởng điều kiện mơi trƣờng bên ngồi điều kiện ni cấy đƣợc kiểm sốt phịng ni cấy; việc sinh tổng hợp chất thứ cấp có khả cải thiện cách tạo quy trình đặc thù cho bƣớc để tăng tốc tích lũy sinh khối tƣơi tăng nồng độ chất mơ; sản xuất quanh năm khơng phụ thuộc vào mùa vụ; chất thứ cấp đƣợc tạo điều kiện vơ trùng có rủi ro bị nhiễm hợp chất độc hại không mong muốn Các chất thứ cấp đƣợc sản xuất in vitro bắt đầu việc đƣa vật liệu ban đầu từ loài thuốc mong muốn vào nuôi cấy Vật liệu ban đầu đƣợc khử trùng bề mặt nuôi cấy điều kiện in vitro, sử dụng mơi trƣờng ni cấy đƣợc tối ƣu hóa điều kiện vật lý đƣợc kiểm soát cho giai đoạn khác Môi trƣờng nuôi cấy chứa nguồn dinh dƣỡng cần thiết cho việc phát triển tế bào nhƣ đƣờng, thƣờng bị hạn 13 chế trong điều kiện thiếu ánh sáng CO2 nồng độ thấp; chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, đƣợc sử dụng để kiểm soát phát triển mơ để kích thích gia tăng sinh khối thực vật hàm lƣợng chất thứ cấp; chất bổ sung khác nhƣ axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa chất khác tùy thuộc vào loài cụ thể Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thƣờng chồi mang mô phân sinh, mảnh non mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt (vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% natri hypochlorite Tiếp theo, vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro Khởi đầu hệ thống tạo mơ sẹo từ các mơ phân sinh, tạo hồn chỉnh, tạo chồi tạo rễ in vitro Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm giai đoạn đƣợc gọi organogenesis để biến dạng tế bào chuyên biệt thành tế bào có khả phân bào phát triển mơ sẹo (indirect organogenesis) chồi chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis) Sau thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với vi khuẩn nấm, giai đoạn bao gồm trình nhân tế bào, mô, chồi rễ Các giai đoạn quan trọng, có tính định hiệu kinh tế trình, chủ yếu nhiều tế bào mô đƣợc sản xuất, suất chất thứ cấp mục tiêu cao Việc nuôi cấy in vitro lồi thuốc giúp sản xuất dƣợc liệu theo nhiều phƣơng thức khác nhƣ : i) vi nhân giống dòng vơ tính quy mơ lớn với chất lƣợng di truyền ổn định nồng độ chất thứ cấp cao nhân giống lồi khó nhân giống phƣơng pháp thơng thƣờng, chẳng hạn nhƣ có chu kỳ sinh trƣởng dài bị nhiễm bệnh, ví dụ virus vi khuẩn nhân phƣơng pháp vơ tính thông thƣờng; ii) sử dụng elicitor (sinh học phi sinh học áp dụng để kích thích sản xuất chất thứ cấp) để kích thích mơ điều kiện in vitro để sản 14 xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen thuốc để sản xuất chất thứ cấp mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu sản xuất sinh khối, tế bào đó, chất thứ cấp từ lồi khó phát triển tự nhiên, chất nồng độ thấp loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu Quá trình vi nhân giống góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo dƣợc sản phẩm thông thƣờng sử dụng hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất từ thuốc Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh q trình sản xuất vơ tính từ giống có khả sinh tổng hợp chất thứ cấp tốt phát triển tốt điều kiện tự nhiên Mặc dù hai phƣơng thức lại dẫn đến việc sản xuất loại thuốc thảo dƣợc, nhƣng đƣợc ứng dụng chủ yếu để sản xuất chất thứ cấp có giá trị cao chi phí kỹ thuật liên quan tƣơng đối đắt đỏ [9] Dùng chất elicitor phƣơng tiện thúc đẩy khó khăn khác liên quan đến việc sản xuất quy mô lớn hầu hết chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quan trọng từ thực vật, ni cấy mơ biệt hóa khơng biệt hóa cách áp dụng nồng độ thấp yếu tố sinh học phi sinh học đƣợc tiến hành rộng rãi Một vài hợp chất hóa học thƣờng đƣợc sử dụng salicylic axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v có ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất phenolic kích hoạt enzym liên quan đến chống chịu thực vật [10] Đối với tạo thuốc biến đổi gen, có nhiều yêu cầu an toàn sinh học liên quan đến việc trồng dƣợc liệu chuyển gen tự nhiên nhận thức ngƣời tiêu dùng [9] Do vậy, mô chuyển gen in vitro có nghĩa để tạo sinh khối cho việc chiết xuất hợp chất hóa học tinh khiết (nhƣ không chuyển gen) Các dịng thuốc chuyển gen có khả sinh tổng hợp chất thứ cấp hiếm, nhƣ vincristine vinblastine đƣợc tạo Các tế bào mô sẹo thuốc chuyển gen đóng vai trị nơi để sản xuất chất mong 15 muốn Các tế bào phát triển nhanh cho phép tăng khả sinh tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân Tế bào thuốc đƣợc lựa chọn tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen cho phép điều khiển trình phát triển sinh khối Ngồi ra, thuốc biến đổi gen đƣợc dùng để sản xuất loại chất có hoạt tính khác nhƣ vắc-xin, hormone kháng thể [11] 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy mô tế bào thuốc in vitro Kiểu gen yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp việc sản xuất sinh khối thực vật chất thứ cấp Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao lựa chọn cho việc sử dụng ni cấy mơ Ví dụ nhƣ gai Ấn độ (Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, alkaloid có vai trị tăng cƣờng hoạt động hệ thần kinh giao cảm, nằm khoảng từ 16,3 đến 235,9 µg/g khơ tùy thuộc vào giống [12], có chênh lệch đến 14,5 lần hàm lƣợng pilocarpin Tuy nhiên, kiểu gen quý dƣợc liệu có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao cịn hạn chế cần phải có nghiên cứu chi tiết giống vùng địa lý khác Việc sử dụng kiểu gen có hàm lƣợng chất thứ cấp tự nhiên cao điều kiện cần thiết để đảm bảo hiệu nuôi cấy in vitro thuốc chi phí hệ thống ni cấy thƣờng cao so với kỹ thuật thông thƣờng khác Bên cạnh đó, ni cấy in vitro dựa nguyên phân, kiểu gen sinh tổng hợp chất có hoạt tính cao dẫn đến hàm lƣợng chất mong muốn cao đáng kể mô đƣợc nuôi cấy Tuy nhiên, với kiểu gen điều kiện phát triển ngồi tự nhiên quần thể thƣờng có nhiều biến động di truyền, dẫn đến biến động sinh khối hàm lƣợng chất trao đổi thứ cấp [13] Do đó, điều cần thiết phải nghiên cứu tƣơng tác kiểu gen môi trƣờng, để tạo điều kiện nuôi trồng tốt nhất, kể với hệ thống ni cấy in vitro Trong điều kiện ni trồng ngồi tự nhiên, yếu tố nội sinh nhƣ kiểu gen, loại quan tuổi 16 mô, đồng hồ sinh học; yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang, cƣờng độ chiếu sáng bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất thành phần khơng khí, riêng rẽ phối hợp ảnh hƣởng đến thành phần nồng độ chất thứ cấp đơn lẻ nhiều chất khác [14,15] Những yếu tố tƣơng tự ảnh hƣởng đến hình thành chất thứ cấp có hoạt tính ni cấy in vitro Ví dụ, Kapoor cs [16] cho biết cần thay đổi yếu tố chất lƣợng ánh sáng có ảnh hƣởng đến tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trƣởng nồng độ hợp chất phenolic Salidroside rễ vàng Rhodiola imbricata Dƣới tác động ánh sáng đỏ, mô sẹo có số tăng trƣởng cao (2,97) nồng độ phenolic tổng số Salidroside lại cao dƣới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy Trong trƣờng hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng sau để tăng cƣờng sinh tổng hợp chất mong muốn chuyển đổi sang ánh sáng xanh Các yếu tố khác đƣợc cần đƣợc tối ƣu hóa để cải thiện q trình ni cấy, chẳng hạn nhƣ kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ thích hợp cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối sinh tổng hợp chất thứ cấp Điều khiển yếu tố môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào in vitro để tăng cƣờng sinh khối theo sinh tổng hợp chất thứ cấp ƣu việt hệ thống khơng phụ thuộc vào mùa vụ năm điều kiện vô trùng Tuy nhiên, nhƣợc điểm nằm chi phí sản xuất cao, cần phải đƣợc bù đắp hệ thống nuôi cấy đƣợc thiết kế phù hợp Các yếu tố đƣợc sử dụng để tính suất thu nhận chất thứ cấp điều kiện in vitro khối lƣợng sinh khối tƣơi khơ nồng độ chất kèm theo, diện tích dùng cho ni cấy (bình ni bioreactor) thời gian cần thiết để có hồn thành chu kỳ sản xuất Các yếu tố khác, nhƣ thể tích mơi trƣờng ni cấy, đƣợc sử dụng cơng thức Tuy nhiên, môi trƣờng nuôi cấy thƣờng chiếm chƣa đến 5% tổng chi phí 17 dịch tế bào chuẩn tƣơng đƣơng với 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào vòng 27 ngày trọng lƣợng tƣơi tế bào tăng đạt mức 35,271 g/100 mL CT4 ngày thứ 27 Ở thí nghiệm với lƣợng tế bào ban đầu cho vào 1,5 mL mL, tế bào tăng trƣởng vòng tuần đầu, sau khơng tiếp tục tăng trƣởng, trọng lƣợng tƣơi tế bào hầu nhƣ không thay đổi Ở thí nghiệm, lƣợng tế bào ban đầu đƣa vào mL môi trƣờng chuẩn tƣơng đƣơng với 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào đạt đƣợc sinh khối lớn sau 27 ngày ni cấy Chính chọn nồng độ ban đầu tối ƣu để đƣa vào 100 mL môi trƣờng nuôi cấy huyền phù dừa cạn 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn, tƣơng đƣơng với mL dung dịch nuôi cấy chuẩn thời điểm 18 ngày 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng lên tốc độ phát triển tế bào Tốc độ phát triển tế bào dừa cạn thể hình 3.12 tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ ni cấy Tốc độ tăng đƣợc tìm thấy khoảng nhiệt độ từ 20 đến 30oC Kết phù hợp với quy luật chung nuôi cấy tế bào thực vât khác Nhiệt độ tối ƣu quan sát thấy 25oC với trọng lƣợng tƣơi 22,147 mg/100 mL CT4 sau 21 ngày nuôi cấy Nhiệt độ thấp dƣới 24oC làm giảm tốc độ phát triển nhƣng an toàn nhiệt độ 30oC Nhiệt độ 35oC ức chế trao đổi chất bình thƣờng, tế bào chuyển màu nâu chết sau ngày nuôi cấy Màu sắc tế bào dừa cạn khác điều kiện sáng tối Trong điều kiện có chiếu sáng 16h/ngày, tế bào có màu vàng xanh, màu trắng đục trọng điệu kiện tối (Hình 3.13) Tế bào có xu hƣớng đóng vón điều kiện chiếu sáng, tốc độ phát triển giảm Nhiệt độ nuôi cấy tế bào đồng thời ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào cần phải tối ƣu hóa Hầu hết tế bào thực vật ni cấy nhiệt độ phịng khoảng từ 20 đến 28oC Việc sản xuất paclitaxel tăng lên tới 137,5 mg/L giữ nhiệt độ nuôi cấy tế bào thông đỏ Taxus chinensis khoảng 24-29oC [75] Nuôi cấy tế bào Ammi majus đƣợc cho tối ƣu điều kiện 20-22oC [76] Nhiệt độ phù hợp cho tế bào dừa cạn tổng hợp ajmalicine 27,5oC [77] 49 Điều kiện chiếu sáng đƣợc định thời gian chiếu sáng phù hợp với đặc tính phát triển tế bào Chế độ chiều sáng để nuôi tế bào huyền phù bao gồm tối, 12 h, 16 h liên tục chiếu sáng Tế bào thực vật thích nghi với loại điều kiện chiếu sáng Trên thực tế, ánh sáng cực tím đỏ thƣờng đƣợc dùng nhƣ cách để tăng cƣờng tổng hợp chất thứ cấp Việc sản xuất catharanthine tế bào dừa cạn tăng lên sử dụng ánh sáng UV-B [78] Hàm lƣợng stilbene anthocyanin tế bào nho Vitis vinifera tăng lên kể xử lý với ánh sáng đỏ [79] Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển tế bào dừa cạn A B Hình 3.13 Ảnh hƣởng ánh sáng đến phát triển tế bào huyền phù dừa cạn A tế bào nuôi tối; B tế bào ni ngồi ánh sáng 50 3.2.4 So sánh khả nhân nhanh tế bào huyền phù hai giống dừa cạn QN02 H01 Sử dụng mL dung dịch nuôi cấy chuẩn tế bào dừa cạn QN02 H01 18 ngày tuổi cấy chuyển sang 100 mL môi trƣờng lỏng CT4 Theo số liệu thống kê bảng 3.2, tế bào huyền phù dừa cạn QN02 H01 có mức độ tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau, sau 28 ngày nuôi lắc, trọng lƣợng tƣơi tế bào huyền phù QN02 tăng 22472%, trọng lƣợng tƣơi tế bào H01 tăng 22847% Khi nuôi cấy điều kiện nuôi lỏng tế bào huyền phù dừa cạn có tốc độ tăng sinh khối cao gấp lần (QN02) 3,4 lần (H01) so với nuôi cấy môi trƣờng đặc sau 28 ngày cấy chuyển Từ trọng lƣợng ban đầu 128 mg, sau ngày sinh khối tế bào QN02 tăng lên 533 mg, sau 14 ngày tăng lên 4452 mg, sau 21 ngày tăng 17476 mg, sau 28 ngày tăng đến 28765 mg Bảng 3.4 Phát triển sinh khối tế bào dừa cạn môi trƣờng CT4 lỏng Giống Ngày Dừa cạn QN02 (mg) Dừa cạn H01 (mg/) 14 21 28 14 21 28 128 533 4452 17476 28765 135 642 4946 18462 30843 416 3478 13653 22472 476 3664 13676 22847 Trọng lƣợng tƣơi tế bào Tốc độ TT (%) Tƣơng tự, tốc độ tăng sinh khối dừa cạn H01 tƣơng tự QN02, từ trọng lƣợng ban đầu 135 mg, sau ngày sinh khối tế bào tăng lên 642 mg, sau 14 ngày tăng lên 4.946 mg, sau 21 ngày tăng 18.462 mg, sau 28 ngày tăng đến 30.843 mg Tế bào tăng nhanh khoảng từ 7-21 ngày, tế bào có màu vàng Sang tuần thứ 4, số tế bào chuyển sang trắng đen bị chết Tại thời điểm cần cấy chuyển tế bào sang môi trƣờng lỏng CT4 để phục hồi tế bào tiếp tục thu sinh khối tế bào huyền phù Tế bào huyền phù ni lỏng tuần đƣợc hút 100 µl dịch tế bào chuyển sang 100 mL môi trƣờng CT4 lỏng Hình thái phát triển tế bào huyền phù đƣợc thể hình 3.14 51 A B C D E F Hình 3.14 Một số hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng thời điểm A: ngày; B: ngày; C: ngày; D: ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện ni cấy đóng vai trị quan trọng việc định chất lƣợng số lƣợng sinh khối tế bào ni cấy huyền phù Có nhiều nghiên cứu cho thấy yếu tố nhƣ nguồn carbon, nitơ, chất điều hòa sinh trƣởng, pH, nhiệt độ, ánh sáng yếu tố dễ dàng điều chỉnh để tác động đến trình biểu đƣờng chuyển hóa thứ cấp thực vật Bùi Văn Lệ Nguyễn Ngọc Hồng [80] thu đƣợc dịch huyền phù tế bào dừa cạn tạo từ mô sẹo xanh cảm ứng từ dừa cạn in vitro Tế bào phát triển môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA, 0,5 mg/L kinetin 60 g/L saccharose cho sinh khối, lƣợng vincristine alkaloid toàn phần cao Trong nghiên cứu khác, Nguyễn Văn Vinh [81] tạo mô sẹo từ dừa cạn tuần tuổi in vitro đạt sinh khối cao môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 1,0 mg/L BA 0,5 mg/L Các tế bào từ khối mơ sẹo phát triển mơi trƣờng MS lỏng có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/l BA 0,5 mg/L Các phân tích hóa học mẫu dừa cạn tự nhiên nuôi cấy in vitro chứa hợp chất alkaloid 52 Các thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào thực vật yếu tố định tăng trƣởng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp [82] Nhiều loại chất kích thích sinh trƣởng mơi trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng nhƣ môi trƣờng MS, B5, LS N6 môi trƣờng cải tiến khác tùy theo kiểu phát triển tế bào lồi định [83] Những mơi trƣờng ni cấy cần đƣợc bổ sung hàm lƣợng sucrose cần thiết chất điều hòa sinh trƣởng thực vật phù hợp cho nuôi cấy tế bào huyền phù [84] Sự khác biệt loại môi trƣờng bao gồm nồng độ khác chất dinh dƣỡng thuộc nhóm carbon, nitrogen, phosphate khống chất vơ [85, 86] Nồng độ phosphate cao đƣợc biết làm tăng tốc độ phát triển tế bào nhƣng lại có ảnh hƣởng xấu đến tích lũy chất thứ cấp [87] Khi ni cấy tế bào thìa canh Gymnema sylvestre, nồng độ muối đa lƣợng cao dẫn đến khả tăng sinh khối tích lũy gymnemic acid (11,35 mg/g DW) Pawar Thengane [88] tối ƣu hóa đƣợc điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù mù Calophyllum inophyllum để thu đƣợc nồng độ cao hợp chất có giá trị Độ pH môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh khoảng 5,0–6,2 trƣớc khử trùng Độ pH 5,8 đƣợc cho phù hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sâm Ấn Độ Withania somnifera tránh độ pH kiềm hay acid [89] Các chất kích thích sinh trƣởng bao gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), a-naphthaleneacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA), indole-3Butytric acid (IBA), cytokinin, ethylene, 6-benzyladenine (BA) and kinetin có vai trị điều kiển q trình phân chia biệt hóa tế bào [83] Trong ni cấy tế bào huyền phù nhót tây Eriobotrya japonica, bổ sung môi trƣờng nuôi cấy với 2,5 mg/L BA 1,0 mg/L NAA nồng độ triterpene tổng số tăng lên đáng kể [90] Nhiều nghiên cứu cho thấy cytokinin ethylene tăng cƣờng tích tụ alkaloid tế bào dừa cạn Catharanthus roseus qua đƣờng sinh tổng hợp độc lập [91] 53 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã xác định đƣợc vật liệu ban đầu sử dụng để cảm ứng tạo mô sẹo đoạn lóng thứ tính từ đỉnh chồi cây, kích thƣớc đoạn lóng thân thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo 0,3 cm - Tốc độ hình thành mơ sẹo hình thái mơ sẹo hai giống dừa cạn hoa trắng hoa đỏ tƣơng đƣơng - Đã tối ƣu hóa đƣợc mơi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo giống dừa cạn trắng đỏ 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D - Đã tối ƣu hóa đƣợc mơi trƣờng nhân nhanh tế bào giống dừa cạn trắng đỏ là: Môi trƣờng đặc: 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,6 mg/L Kinetin; Môi trƣờng lỏng: 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,6 mg/L kinetin - Lƣợng tế bào ban đầu cho vào môi trƣờng nuôi cấy huyền phù 150 mg tế bào/ 100 mL môi trƣờng nuôi cấy, tƣơng đƣơng với mL dung dịch tế bào chuẩn nuôi thời điểm 18 ngày - Điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù đƣợc thực điều kiện lắc với tốc độ 120 v/p 25oC ± 10C tối 4.2 Kiến nghị Tiếp tục sử dụng hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn hai giống QN02 H01 để phát triển tế bào có khả tăng cƣờng sinh tổng hợp hợp chất alkaloid phenolic có tiềm làm thuốc 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thực vật chí Việt Nam, Tập V 2007 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Gajalakshmi S, Vijayalakshmi S, Devi RV (2013) Pharmacological activities of Catharanthus roseus: A perspective review International Journal of Pharmaceutical Science 4(2):431-439 [3] Sreevalli Y, Baskaran K, Kulkarni RN, Kumar S (2000) Further evidence for the absence of automatic and intra-flower selfpollination in periwinkle Current Science 79 (12):1648-1649 [4] Grellier P, Sinou V, Garrea de Loubresse N et al (1999) Selective and reversible effects of vinca alkaloids on Trypanosoma cruzi epimastigote forms: blockage of cytokinesis without inhibition of the organelle duplication Cell Motil Cytoskeleton 42:36–47 [5] Tiong SH, Looi CY, Hazni H, Arya A, Paydar M, Wong WF, Cheah SC, Mustafa MR, Awang K (2013) Antidiabetic and antioxidant properties of alkaloids from Catharanthus roseus (L.) G Don Molecules 18:9770-9784 [6] Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, and Tran Van Sung (2014) Further chemical constituents of Catharanthus rosues (L.) G Don collected from Binh Dinh province, Vietnam Vietnam Journal of Chemistry, 52(5), 626-628 [7] Võ Văn Chi ( 2012), Từ điển thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học, Hà Nội, Tr 830-831 [8] Georgiev M, Weber J (2014) Bioreactors for plant cells: Hardware configuration and internal environment optimization as tools for wider commercialization Biotechnology letters 36 [9] Cardoso JC, Sheng Gerald LT, Silva JAT (2018) Micropropagation in the twentyfirst century In: Loyola-Vargas V, Ochoa-Alejo, N (org) Methods in molecular biology 4th ed New York: Springer 1815: 17-46 [10] Mendoza D, Cuaspud O, Arias JP, Ruiz O, Arias M (2018) Effect of salicylic acid and methyl jasmonate in the production of phenolic compounds in plant cell suspension cultures of Thevetia peruviana Biotechnology reports (Amsterdam, Netherlands) 19, e00273 [11] Goldstein DA, Thomas JA (2004) Biopharmaceuticals derived from genetically modified plants QJM: International Journal of Medicine 97: 705-716 55 [12] Sandhu SS, Abreu IN, Colombo CA, Mazaferra P (2006) Pilocarpine content and molecular diversity in jaborandi Scientia Agraria 63: 478-482 [13] Vaz APA, Scaranari C, Batista LAR, Figueira GM, Sartoratto A, Magalhães PM (2006) Biomassa e composiỗóo quớmica de genútipos melhorados de espécies medicinais cultivadas em quatro municípios paulistas Pesquisa Agropecuária Brasileira 41: 869-872 [14] Gobbo-Neto L, Lopes NP (2007) Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários Quimica Nova 30: 374-381 [15] Cui XH, Murthy HN, Jin YX, Yim YH, Kim JY, Paek KY (2011) Production of adventitious root biomass and secondary metabolites of Hypericum perforatum L in a balloon type airlift reactor Bioresource Technology 102: 10072-10079 [16] Kapoor S, Raghuvanshi R, Bhardwaj P, Sood H, Saxena S, Chaurasia OP (2018) Influence of light quality on growth, secondary metabolites production and antioxidant activity in callus culture of Rhodiola imbricata Journal of Photochemical and Photobiology B: Biology 183: 258-265 [17] Gerth A, Schmidt D, Wilken D (2007) The production of plant secondary metabolites using bioreactors Acta Horticulturae764: 95-104 [18] Thakore D, Srivastava AK, Sinha AK (2017) Mass production of ajmalicine by bioreactor cultivation of hairy roots of Catharanthus roseus Biochemical Engineering Journal 119: 84-91 [19] Grzegorczyk-Karolak I, Kuzma L, Wisokinska H (2015) The effect of cytokinins on shoot proliferation, secondary metabolite production and antioxidant potential in shoot cultures of Scuttelaria alpina Plant Cell Tissue and Organ Culture122: 699-708 [20] Ali M, Abbasi BH, Ali GS (2015) Elicitation and antioxidant secondary metabolites with jasmonates and gibberellic acid in cell suspension cultures of Artemisia absinthium L Plant Cell Tissue and Organ Culture 120: 1099-1106 [21] Siddiqui ZH, Mujib A, Aslam J (2013) In vitro production of secondary metabolites using elicitor in Catharanthus roseus: a case study In: Hakeem KR, Ahmad P, Ozturk M: Crop Improvement: 401-419 [22] Tonk D, Mujib A, Maqsood M, Ali M, Zafar N (2016) Aspergillus flavus fungus elicitation improves vincristine and vinblastine yield by augmenting callus biomass growth in Catharanthus roseus Plant Cell Tissue Organ Culture 126: 291-303 56 [23] Sharma M, Ahuja A, Gupta R, Mallubhotla S (2015) Enhanced bacoside production in shoot cultures of Bacopa monnieri under the influence of abiotic elicitors Natural Product Research 29: 745-749 [24] Ferri M, Tassoni A (2011) Chitosan as elicitor of health beneficial secondary metabolites in in vitro plant cell cultures In: MACKAY, RG; TAIT, JM (eds) Handbook of Chitosan Research and Applications Chapter22: 389-413 [25] Maqsood M, Abdul M (2017) Yeast extract elicitation increases vinblastine and vincristine yield in protoplast derived tissues and plantlets in Catharanthus roseus, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 27( 5): 549-556 [26] Ramirez-Estrada K, Vidal-Limon H, Hidalgo D, Moyano E, Goleniowski M, Cusidó, RM, Palazon J (2016) Elicitation, an effective strategy for the biotechnological production of bioactive high-added value compounds in plant cell factories Molecules 21: 182 [27] Klein FRS, Reis A, Kleinowski RT, Telles RT, Amarante L, Peters JA, Braga EJB (2018) UV-B radiation as an elicitor of secondary metabolite production in plants of the genus Alternanthera Acta Botanica Brasilica32: 615-623 [28] Ludwig-Müller J (2015) Plants and endophytes: equal partners in secondary metabolite production? Biotechnology Letters 37: 1325-1334 [29] Ahmad N, Rab A, Ahmad N (2016) Light-induced biochemical variations in secondary metabolite production and antioxidant activity in callus culture of Stevia rebaudiana (Bert.) Journal of Photochemical and Photobiology B: Biology 154: 5156 [30] Gao X, Bjork L (2000) Chemical characters, height and root weight in callus regenerated plants of Valeriana officinalis L Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 7: 31-39 [31] Chang C, Chang WC (1998) Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var misericors Plant Cell Rep 17: 251–255 [32] Kumar KS., Bhavanandan KV (1988) Micropropagation of Plumbago rosea Linn Plant Cell Tiss Organ Cult 15: 275–278 [33] Chalageri G, and Babu UV (2012) In vitro plant regeneration via petiole callus of Viola patrinii and genetic fidelity assessment using RAPD markers Turk J of Bot 36, 358-368 57 [34] Lee, NYS, Khoo WKS, Adnan MA, Mahalingam TP, Fernandez AR, Jeevaratnam K (2016) The pharmacological potential of Phyllanthus niruri Journal of Pharmacy and Pharmacology 68: 953-969 [35] Wang J, Qian J, Yao L, Lu Y (2015) Enhanced production of flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of Hypericum perforatum Bioresources and Bioprocesses 2: DOI 10.1186/s40643-014-0033-5 [36] Chen L, Cai Y, Liu X (2018) Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation Crop Journal 6: 162-171 [37] Sujatha G, Korac-Zdravkovic S, Calic D, Flamini G, Kumari BDR (2013) Highefficiency Agrobacterum rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: Hairy root production and essential oil analysis Industrial Crops Production 44: 643-652 [38] Thiruvengadam M, Rekha K, Chung IM (2016) Induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenesis-mediated transformation of spine gourd (Momordica dioica Roxb Ex Willd) for the assessment of phenolic compounds and biological activities Scientia Horticulturae 198: 132-141 [39] Deus B, Zenk MH (1982) Exploitation of plant cells for the production of natural compounds Biotechnol Bioeng 24:1965–1974 [40] Kurz WGW, Chatson KB, Constabel F (1985) Biosynthesis and accumulation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus cultivars In: Neumann KH, Barz W, Reinhard E, editors Primary and Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures 1st ed Volume Springer-Verlag; Berlin, Germany, pp 143– 153 [41] Ganapathi B, Kargi F (1990) Recent Advances in Indole Alkaloid Production by Catharanthus roseus (Periwinkle) J Exp Bot 41:259–267 [42] Mannonen L, Toivonen L, Kauppinen VC (1990) Effects of long term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell culture Plant Cell Rep 9:173–177 [43] Bachiri Y, Gazeau C, Hansz J, Morisset C, Dereuddre J (1995) Successful cryopreservation of suspension cells by encapsulation dehydration Plant Cell Tissue Organ Cult 43:241–248 58 [44] El-Sayed M, Verpoorte R (2007) Catharanthus terpenoid indole alkaloids: Biosynthesis and regulation Phytochem Rev 6:277–305 [45] Endo T, Goodbody AE, Misawa M (1987) Alkaloid production in root and shoot cultures of Catharanthus roseus Planta Med 53:479–482 [46] Shukla AK, Shasany AK, Verma RK, Gupta MM, Mathur AK, Khanuja PSP (2010) Influence of cellular differentiation and elicitation on intermediate and late steps of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus Protoplasma 24:35–47 [47] Van der Heijden R, Verpoorte R, ten Hoopen HJG (1989) Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus (L.) G Don: A literature survey Plant Cell Tissue Organ Cult 18:231–280 [48] Zhao J, Hu Q, Guo YQ, Zhu WH (2001) Effects of stress factors, bioregulators, and synthetic precursors on indole alkaloid production in compact callus clusters cultures of Catharanthus roseus Appl Microbiol Biotechnol 55:693–698 [49] Wang JY, Liu ZP, Liu L, Liu C (2008) Effects of NaCl on the growth and alkaloid content of Catharanthus roseus seedlings J Appl Ecol 19:2143–2148 [50] Zhao J, Zhu WH, Hu Q, He XW (2001) Enhanced indole alkaloid production in suspension compact callus clusters of Catharanthus roseus: Impacts of plant growth regulators and sucrose Plant Growth Reg 33:33–41 [51] Schlatmann JE, Koolhaas CMA, Vinke JL, ten Hoopen HJG, Heijnen JJ ( 1995) The role of glucose in ajmalicine production by Catharanthus roseus cell cultures Biotechnol Bioeng 47:525–534 [52] Zhao J, Zhu WH, Hu Q (2001) Effects of light and plant growth regulators on the biosynthesis of vindoline and other indole alkaloids in Catharanthus roseus callus cultures Plant Growth Reg 33:43–49 [53] Jung KH, Kwak SS, Kim SW, Lee H, Choi CY, Liu JR (1992) Improvement of the catharanthine productivity in hairy root cultures of Catharanthus roseus by using monosaccharides as a carbon source Biotechnol Lett 14:695–700 [54] Almagro L, Lopez Perez AJ, Pedreno MA (2011) New method to enhance ajmalicine production in Catharanthus roseus cell cultures based on the use of cyclodextrins Biotechnol Lett 33(2):381-385 59 [55] Van der Heijden R, Jacobs D., Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R (2004) The Catharanthus alkaloids: Pharmacognosy and biotechnology Curr Med Chem, 11:1241–1253 [56] Asada M, Shuler ML (1989) Stimulation of ajmalicine production and excretion from Catharanthus roseus: Effects of adsorption in situ, elicitors, and alginate immobilization Appl Microbiol Biotechnol 30:475–481 [57] Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalicine and catharanthine from immobilized Catharanthus roseus cells Biotechnol Bioeng 67:61–71 [58] El-Sayed M, Verpoorte R (2002) Effect of phytohormones on growth and alkaloid accumulation by a Catharanthus roseus cell suspension cultures fed with alkaloid precursors tryptamine and loganin Plant Cell Tissue Organ Cult 68:265–270 [59] Lee CWT, Shuler ML (1991) Different shake flask closures alter gas phase composition and ajmalicine production in Catharanthus roseus cell suspensions Biotechnol Technol 5:173–178 [60] Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S (2003) Studies on Production of Ajmalicine in Shake Flasks by Multiple Shoot Cultures of Catharanthus roseus Biotechnol Prog 19:1071–1075 [61] Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana Plant J 16(6):735-743 [62] Mishra MR, Srivastava RK, Akhtar N (2018) Enhanced Alkaloid Production from Cell Culture System of Catharanthus roseus in Combined Effect of Nutrient Salts, Sucrose and Plant Growth Regulators J Biotech Biomedical Sci 1(4):14-34 [63] Sreevidya N, Mehrotra S (2003) Spectrophotometric method for estimation of alkaloids precipitable with Dragendorff's reagent in plant materials Journal of AOAC international 86(6):1124-1127 [64] Fatemeh KA, Abdolreza B (2013) The effect of hormonal composition, type of explant and light condition on callus production in Periwinkle (Catharanthus roseus L.) Plant Tissue Cult Biotechnol 23(1):107-13 [65] Haq R, Naz S, Aslam F, Manzoor F (2013) Comparison of in vitro response of micropropagation and callogenesis of medicinal plant, Vinca rosea L J Agric Res 51(1):9-17 60 [66] Soleimani F, Zarghami R, Ebrahimzadeh M (2013) Effects of 2,4-D and kinetin concentrations on vinblastine and vincristine alkaloid contents in callus of periwinkle (Catharanthus roseus) Int J AgriSci 3(10):759-765 [67] Verma AK, Singh RR, Singh S (2012) Improved alkaloid content in callus culture of Catharanthus roseus Bot Serbica 36(2):123-30 [68] Negi RS (2011) Fast in-vitro callus induction in Catharanthus roseus - A medicinally important plant used in cancer therapy Res J Pharm Biol Chem Sci 2(4):597-603 [69] Kalidass C, Ramasamy MV, Daniel A (2010) Effect of auxin and cytokinin on vincristine production by callus cultures of Catharanthus roseus L (apocynaceae) Tropical and Subtropical Agroecosystems 12:283-288 [70] George EF, Sherrington PD (2008) Plant Propagation by Tissue Culture, Fourth edition Ltd England [71] Skoog F, Miller CO (1957) Chemical control of growth and bud formation in tobacco segment and callus cultured in vitro J Bot 35: 782-790 [72] Faisal M, Anis M (2003) Rapid mass propagation of Tylophora indica Merrill via leaf callus culture Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 125–129 [72] Shahzad A, Ahmad N and Anis M (2006) An improved method of organogenesis from cotyledon callus of Acacia sinuata (Lour.) Merr using thidiazuron J Plant Biotech 8(1): 15-19 [73] Faisal M, Ahmad N, Anis M (2006) Plant regeneration via organogenesis in callus cultures of Ruta graveolens L Phytomorphology 56:183–187 [74] Maity S, Ray S, Banerjee N (2005) The role of plant growth regulators on direct and indirect plant regeneration from various organs of Leucaena leucocephala Acta Physiologiae Plantarum 27: 473-480 [75] Choi H, Kim S, Son J, et al (2000) Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in suspension culture of Taxus chinensis Enzyme Microb Tech 27: 593–598 [75] Sidhu Y (2010) In vitro micropropagation of medicinal plants by tissue culture Plymouth Student Sci 4(1):432-49 [76] Staniszewska I, Krolicka A, Malinski E, et al (2003) Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L Enzyme Microb Tech 33: 565–568 61 [77] Ten Hoopen HJG, Vinke JL, Moreno PRH, et al (2002) Influence of temperature on growth and ajmalicine production by Catharantus roseus suspension cultures Enzyme Microb Tech 30:56–65 [78] Ramani S, Chelliah J (2007) UV-B-induced signaling events leading to enhancedproduction of catharanthine in Catharanthus roseus cell suspension cultures BMC Plant Biol 7: 61 [79] Tassoni A, Durante L, Ferri M (2012) Combined elicitation of methyl-jasmonate and red light on stilbene and anthocyanin biosynthesis J Plant Physiol 169: 775–781 [80] Bùi Văn Lệ Nguyễn Ngọc Hồng (2006) Ảnh hƣởng chất điều hòa tăng trƣởng thực vật đƣờng saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus Tạp chí phát triển KH&CN 9(6): 59-66 [81] Nguyễn Văn Vinh (2010) Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dừa cạn (Catharanthus roceus L.) điều kiện nuôi cấy in vitro Tạp chí phát triển KH&CN 48(1): 87-95 [82] Zhang Y, Zhong J (1997) Hyperproduction of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng cells Enzyme Microb Tech 21:59–63 [83] Coste A, Vlase L, Halmagyi A, et al (2011) Effects of plant growth regulators and elicitors on production of secondary metabolites in shoot cultures of Hypericum hirsutum and Hypericum maculatum Plant CellTissue Organ Culture (PCTOC) 106: 279–88 [84] Han J, Zhong J (2003) Effects of oxygen partial pressure on cell growth and ginsenoside and polysaccharide production in high density cell cultures of Panax notoginseng Enzyme Microb Tech 32:498–503 [85] Gamborg OLC, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res 50: 151–158 [86] Hockin NL, Mock T, Mulholland F, et al (2012) The response of diatom central carbon metabolism to nitrogen starvation is different from that of green algae and higher plants Plant Physiol 158: 299–312 [87] Chandler SF, Dodds JH (1983) The effect of phosphate, nitrogen and sucrose on the production of phenolics and solasodine in callus cultures of Solanum laciniatum Plant Cell Rep 2: 205–208 62 [88] Pawar KD, Thengane SR (2009) Influence of hormones and medium components on expression of dipyranocoumarins in cell suspension cultures of Calophyllum inophyllum L Process Biochem 44: 916–922 [89] Nagella P, Murthy HN (2010) Establishment of cell suspension cultures of Withania somnifera for the production of withanolide A Bioresource Technol, 101, 6735–9 [90] Ho H, Liang K, Lin W, et al (2010) Regulation and improvement of triterpene formation in plant cultured cells of Eriobotrya japonica Lindl J Biosci Bioeng 110: 588–592 [91] Yahia A, Kevers C, Gaspar T, Chénieux JC, Rideau M, Crèche J (2005) Cytokinins and ethylene Catharanthus roseus suspension cells Biotechnol Bioeng 89(3):367-371 63 ... 21 28 Kin (mg /L) 2,4-D (mg /L) TL tƣơi (mg) TL tƣơi (mg) Tốc độ TT (% ) TL tƣơi (mg) Tốc độ TT (% ) TL tƣơi (mg) Tốc độ TT (% ) TL tƣơi (mg) Tốc độ TT (% ) Alkaloid tổng số (mg/g DW)* CT3-1 50 167... trƣởng bào dừa cạn giống H01 Kích thích sinh trƣởng Cơng thức Dừa cạn H01 (ngày) 14 TL tƣơi TL tƣơi Tốc độ TL tƣơi (mg) (mg) TT (% ) (mg) 21 28 Tốc độ TT (% ) TL tƣơi (mg) Tốc độ TT (% ) TL tƣơi (mg)... văn này, nghiên cứu tập trung “ Nghiên cứu thiết l? ??p hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn (Catharanthus roseus L. ) Việt Nam? ?? nhằm chọn tạo đƣợc dịng tế bào có khả phát triển sinh khối với