Luận văn Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào dạng huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN “NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.) CỦA VIỆT NAM” LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN “NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.) CỦA VIỆT NAM” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 6020114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn : TS Trần Mỹ Linh Hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Tƣờng Vân Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2020 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn TS Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST), TS Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học, VAST ThS Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST tận tình hƣớng dẫn, động viên tơi suốt q trình thực luận văn Xin cảm ơn Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số QTBY01.05/18-19 TS Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm hỗ trợ trình thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Học viện Khoa học Cơng nghệ, VAST hết lịng truyền đạt kiến thức cho xong suốt hai năm học vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán thuộc Phòng Nghiên cứu Tài nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST tạo điều kiện giúp đỡ q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Thanh Huyền MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Giới thiệu chung dừa cạn 10 1.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố 10 1.1.2 Giá trị y học 11 1.2 Nuôi cấy mô tế bào thuốc in vitro 12 1.2.1 Các xu hƣớng sản xuất chất thứ cấp in vitro 13 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng ni cấy mơ tế bào thuốc in vitro 16 1.2.3 Nuôi nhân chồi in vitro 19 1.2.4 Nuôi cấy mô sẹo tế bào huyền phù 20 1.3 Nuôi cấy mô dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23 1.4 Những thách thức sản xuất chất thứ cấp in vitro 26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Các giống thực vật nghiên cứu 27 2.1.2 Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Khử trùng nảy mầm hạt 28 2.2.2 Tạo nguồn vật liệu phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro 28 2.2.3 Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn 28 2.2.3.1 Tối ƣu hóa loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lên khả tạo mô sẹo 28 2.2.3.2 Đánh giá ảnh hƣởng ví trí kích thƣớc đoạn thân đến hình thành mơ sẹo 29 2.2.3.3 Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân 29 2.2.3.4 So sánh khả tạo mô sẹo giống dừa cạn thu thập Việt Nam30 2.2.4 Tối ƣu hóa mơi trƣờng nhân nhanh mơ sẹo dừa cạn 30 2.2.5 Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn 30 2.2.6 Đánh giá ảnh hƣởng ánh sáng nhiệt độ lên phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 31 2.2.7 Tách chiết định lƣợng alkaloid tổng số 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ vật liệu ban đầu khác hai giống dừa cạn 33 3.1.1 Đánh giá khả nảy mầm hạt dừa cạn điều kiện in vitro 33 3.1.2 Đánh giá khả nhân chồi in vitro dừa cạn 33 3.1.3 Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ vật liệu nuôi cấy in vitro 35 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng đoạn lóng thân đến khả hình thành mơ sẹo 39 3.1.5 Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân dùng thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo39 3.1.5 Đánh giá khả hình thành mơ sẹo hai giống dừa cạn QN02 H01 từ đoạn thân thứ 3, kích thƣớc 0,3cm 41 3.2 Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 43 3.2.1 Phát triển môi trƣờng nhân nhanh mô sẹo, bảo toàn khả sinh tổng hợp alkaloid 43 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ tế bào ban đầu đến phát triển tế bào dừa cạn nuôi lỏng 47 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ánh sáng lên tốc độ phát triển tế bào 49 3.2.4 So sánh khả nhân nhanh tế bào huyền phù hai giống dừa cạn QN02 H01 51 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit 2,4-D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic B5 Môi trƣờng nuôi cấy Gamborg (1968) BAP 6-benzyladenine CT Công thức DDW Nƣớc cất hai lần (double distilled water) DW Trọng lƣợng khô – dry weight IAA Indole Acetic acid IBA Indole-3-butyric acid Kin Kinetin LS Môi trƣờng nuôi cấy Linsmaier Skoog (1965) MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige Skoog (1962) N6 Môi trƣờng nuôi cấy Chu cs (1975) NAA α-Naphthaleneacetic acid TDZ Thidiazuron DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn 27 Bảng 2.2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô 27 Bảng 3.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo đoạn lóng thân lên mơi trƣờng CT2 36 Bảng 3.2 A Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm công thức môi trƣờng nhân nhanh tế bào 45 Bảng 3.2 B Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm công thức môi trƣờng nhân nhanh tế bào 45 Bảng 3.3 Sự tăng trƣởng tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy 48 Bảng 3.4 Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn thử nghiệm môi trƣờng lỏng CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ môi trƣờng đặc CT3 sang môi trƣờng lỏng CT4 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây dừa cạn 10 Hình 2.1 Lựa chọn đoạn thân thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo dừa cạn 29 Hình 3.1 Hạt dừa cạn nảy mầm sau tuần gieo hạt 33 Hình 3.2 Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo nguyên liệu cho TN tạo mô sẹo 34 Hình 3.3 Mơ sẹo dừa cạn QN02 (A) H01 (B) sau tuần phát triển mơi trƣờng CT2 có nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA 35 Hình 3.4 Hình ảnh mơ sẹo dừa cạn QN02 (A) H01 (B) sau tuần phát triển môi trƣờng CT2 có nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA 37 Hình 3.5 Mơ sẹo dừa cạn H01 sau tuần phát triển mơi trƣờng CT2 có nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác 38 Hình 3.6 Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 sau tuần phát triển mơi trƣờng CT2 có nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác 38 Hình 3.7 Một số hình ảnh thí nghiệm tối ƣu vị trí đoạn lóng thân thí nghiệm tạo mơ sẹo sau tuần đặt môi trƣờng tạo mô sẹo A: đoạn 1; B: đoạn 2; C: đoạn 39 Hình 3.8 Hình ảnh thí nghiệm tối ƣu kích thƣớc đoạn thân TN tạo mô sẹo 40 Hình 3.9 Mơ sẹo dừa cạn mơi trƣờng CT2 chứa 1,5 mg/L 2,4-D 41 Hình 3.10 Tốc độ nhân sinh khối tế bào dừa cạn QN02 H01 47 Hình 3.11 Hình ảnh tế bào dừa cạn QN02 phát triển môi trƣờng CT3-547 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển tế bào dừa cạn 50 Hình 3.13 Ảnh hƣởng ánh sáng đến phát triển tế bào huyền phù dừa cạn A tế bào ni tối; B tế bào ni ngồi ánh sáng 50 Hình 3.14 Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng thời điểm A: ngày; B: ngày; C: ngày; D: ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày 52 MỞ ĐẦU Từ lâu thực vật nguồn cung cấp số lƣợng khổng lồ hợp chất hóa học có hoạt tính đƣợc dùng làm thuốc Các hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hƣơng vị mỹ phẩm Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp gián tiếp từ thực vật có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp bán tổng hợp thay Vì nguồn sinh khối thực vật ngày tăng cao nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp có hoạt tính dƣợc học địi hỏi cấp bách Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có bƣớc phát triển vƣợt bậc, phƣơng pháp thay thích hợp việc tạo nguồn sinh khối quy mô khác khơng phụ thuộc vào mùa vụ Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn tiến hành nơi điều kiện vô trùng sử dụng chất bảo vệ thực vật độc hại Một tiến đáng kể kỹ thuật ni cấy mơ thực vật tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) thực vật để nghiên cứu hoạt tính sinh học sản xuất chất trao đổi thứ cấp có giá trị Ni cấy tế bào huyền phù giải pháp để cải thiện khó khăn nồng độ chất trao đổi thứ cấp thấp đƣợc phát triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ thơng đỏ, có tác dụng chữa ung thƣ) Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G Don) dƣợc liệu, chứa nhiều chất thứ cấp khác có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine vincristine để điều trị số bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết dịch tế bào chuẩn tƣơng đƣơng với 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào vòng 27 ngày trọng lƣợng tƣơi tế bào tăng đạt mức 35,271 g/100 mL CT4 ngày thứ 27 Ở thí nghiệm với lƣợng tế bào ban đầu cho vào 1,5 mL mL, tế bào tăng trƣởng vịng tuần đầu, sau khơng tiếp tục tăng trƣởng, trọng lƣợng tƣơi tế bào hầu nhƣ khơng thay đổi Ở thí nghiệm, lƣợng tế bào ban đầu đƣa vào mL môi trƣờng chuẩn tƣơng đƣơng với 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào đạt đƣợc sinh khối lớn sau 27 ngày nuôi cấy Chính chúng tơi chọn nồng độ ban đầu tối ƣu để đƣa vào 100 mL môi trƣờng nuôi cấy huyền phù dừa cạn 150 mg trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn, tƣơng đƣơng với mL dung dịch nuôi cấy chuẩn thời điểm 18 ngày 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng lên tốc độ phát triển tế bào Tốc độ phát triển tế bào dừa cạn thể hình 3.12 tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy Tốc độ tăng đƣợc tìm thấy khoảng nhiệt độ từ 20 đến 30oC Kết phù hợp với quy luật chung nuôi cấy tế bào thực vât khác Nhiệt độ tối ƣu quan sát thấy 25oC với trọng lƣợng tƣơi 22,147 mg/100 mL CT4 sau 21 ngày nuôi cấy Nhiệt độ thấp dƣới 24oC làm giảm tốc độ phát triển nhƣng an toàn nhiệt độ 30oC Nhiệt độ 35oC ức chế trao đổi chất bình thƣờng, tế bào chuyển màu nâu chết sau ngày nuôi cấy Màu sắc tế bào dừa cạn khác điều kiện sáng tối Trong điều kiện có chiếu sáng 16h/ngày, tế bào có màu vàng xanh, màu trắng đục trọng điệu kiện tối (Hình 3.13) Tế bào có xu hƣớng đóng vón điều kiện chiếu sáng, tốc độ phát triển giảm Nhiệt độ nuôi cấy tế bào đồng thời ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào cần phải tối ƣu hóa Hầu hết tế bào thực vật ni cấy nhiệt độ phịng khoảng từ 20 đến 28oC Việc sản xuất paclitaxel tăng lên tới 137,5 mg/L giữ nhiệt độ nuôi cấy tế bào thông đỏ Taxus chinensis khoảng 24-29oC [75] Nuôi cấy tế bào Ammi majus đƣợc cho tối ƣu điều kiện 20-22oC [76] Nhiệt độ phù hợp cho tế bào dừa cạn tổng hợp ajmalicine 27,5oC [77] 49 Điều kiện chiếu sáng đƣợc định thời gian chiếu sáng phù hợp với đặc tính phát triển tế bào Chế độ chiều sáng để nuôi tế bào huyền phù bao gồm tối, 12 h, 16 h liên tục chiếu sáng Tế bào thực vật thích nghi với loại điều kiện chiếu sáng Trên thực tế, ánh sáng cực tím đỏ thƣờng đƣợc dùng nhƣ cách để tăng cƣờng tổng hợp chất thứ cấp Việc sản xuất catharanthine tế bào dừa cạn tăng lên sử dụng ánh sáng UV-B [78] Hàm lƣợng stilbene anthocyanin tế bào nho Vitis vinifera tăng lên kể xử lý với ánh sáng đỏ [79] Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển tế bào dừa cạn A B Hình 3.13 Ảnh hƣởng ánh sáng đến phát triển tế bào huyền phù dừa cạn A tế bào ni tối; B tế bào ni ngồi ánh sáng 50 3.2.4 So sánh khả nhân nhanh tế bào huyền phù hai giống dừa cạn QN02 H01 Sử dụng mL dung dịch nuôi cấy chuẩn tế bào dừa cạn QN02 H01 18 ngày tuổi cấy chuyển sang 100 mL môi trƣờng lỏng CT4 Theo số liệu thống kê bảng 3.2, tế bào huyền phù dừa cạn QN02 H01 có mức độ tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau, sau 28 ngày nuôi lắc, trọng lƣợng tƣơi tế bào huyền phù QN02 tăng 22472%, trọng lƣợng tƣơi tế bào H01 tăng 22847% Khi nuôi cấy điều kiện nuôi lỏng tế bào huyền phù dừa cạn có tốc độ tăng sinh khối cao gấp lần (QN02) 3,4 lần (H01) so với nuôi cấy môi trƣờng đặc sau 28 ngày cấy chuyển Từ trọng lƣợng ban đầu 128 mg, sau ngày sinh khối tế bào QN02 tăng lên 533 mg, sau 14 ngày tăng lên 4452 mg, sau 21 ngày tăng 17476 mg, sau 28 ngày tăng đến 28765 mg Bảng 3.4 Phát triển sinh khối tế bào dừa cạn môi trƣờng CT4 lỏng Giống Ngày Dừa cạn QN02 (mg) Dừa cạn H01 (mg/) 14 21 28 14 21 28 128 533 4452 17476 28765 135 642 4946 18462 30843 416 3478 13653 22472 476 3664 13676 22847 Trọng lƣợng tƣơi tế bào Tốc độ TT (%) Tƣơng tự, tốc độ tăng sinh khối dừa cạn H01 tƣơng tự QN02, từ trọng lƣợng ban đầu 135 mg, sau ngày sinh khối tế bào tăng lên 642 mg, sau 14 ngày tăng lên 4.946 mg, sau 21 ngày tăng 18.462 mg, sau 28 ngày tăng đến 30.843 mg Tế bào tăng nhanh khoảng từ 7-21 ngày, tế bào có màu vàng Sang tuần thứ 4, số tế bào chuyển sang trắng đen bị chết Tại thời điểm cần cấy chuyển tế bào sang môi trƣờng lỏng CT4 để phục hồi tế bào tiếp tục thu sinh khối tế bào huyền phù Tế bào huyền phù nuôi lỏng tuần đƣợc hút 100 µl dịch tế bào chuyển sang 100 mL mơi trƣờng CT4 lỏng Hình thái phát triển tế bào huyền phù đƣợc thể hình 3.14 51 A B C D E F Hình 3.14 Một số hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng thời điểm A: ngày; B: ngày; C: ngày; D: ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện nuôi cấy đóng vai trị quan trọng việc định chất lƣợng số lƣợng sinh khối tế bào nuôi cấy huyền phù Có nhiều nghiên cứu cho thấy yếu tố nhƣ nguồn carbon, nitơ, chất điều hòa sinh trƣởng, pH, nhiệt độ, ánh sáng yếu tố dễ dàng điều chỉnh để tác động đến trình biểu đƣờng chuyển hóa thứ cấp thực vật Bùi Văn Lệ Nguyễn Ngọc Hồng [80] thu đƣợc dịch huyền phù tế bào dừa cạn tạo từ mô sẹo xanh cảm ứng từ dừa cạn in vitro Tế bào phát triển mơi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA, 0,5 mg/L kinetin 60 g/L saccharose cho sinh khối, lƣợng vincristine alkaloid toàn phần cao Trong nghiên cứu khác, Nguyễn Văn Vinh [81] tạo mô sẹo từ dừa cạn tuần tuổi in vitro đạt sinh khối cao môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 1,0 mg/L BA 0,5 mg/L Các tế bào từ khối mơ sẹo phát triển mơi trƣờng MS lỏng có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/l BA 0,5 mg/L Các phân tích hóa học mẫu dừa cạn tự nhiên nuôi cấy in vitro chứa hợp chất alkaloid 52 Các thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào thực vật yếu tố định tăng trƣởng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp [82] Nhiều loại chất kích thích sinh trƣởng môi trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng nhƣ môi trƣờng MS, B5, LS N6 môi trƣờng cải tiến khác tùy theo kiểu phát triển tế bào lồi định [83] Những mơi trƣờng nuôi cấy cần đƣợc bổ sung hàm lƣợng sucrose cần thiết chất điều hòa sinh trƣởng thực vật phù hợp cho nuôi cấy tế bào huyền phù [84] Sự khác biệt loại môi trƣờng bao gồm nồng độ khác chất dinh dƣỡng thuộc nhóm carbon, nitrogen, phosphate khống chất vơ [85, 86] Nồng độ phosphate cao đƣợc biết làm tăng tốc độ phát triển tế bào nhƣng lại có ảnh hƣởng xấu đến tích lũy chất thứ cấp [87] Khi ni cấy tế bào thìa canh Gymnema sylvestre, nồng độ muối đa lƣợng cao dẫn đến khả tăng sinh khối tích lũy gymnemic acid (11,35 mg/g DW) Pawar Thengane [88] tối ƣu hóa đƣợc điều kiện ni cấy tế bào huyền phù mù Calophyllum inophyllum để thu đƣợc nồng độ cao hợp chất có giá trị Độ pH mơi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh khoảng 5,0–6,2 trƣớc khử trùng Độ pH 5,8 đƣợc cho phù hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sâm Ấn Độ Withania somnifera tránh độ pH kiềm hay acid [89] Các chất kích thích sinh trƣởng bao gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), a-naphthaleneacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA), indole-3Butytric acid (IBA), cytokinin, ethylene, 6-benzyladenine (BA) and kinetin có vai trị điều kiển q trình phân chia biệt hóa tế bào [83] Trong ni cấy tế bào huyền phù nhót tây Eriobotrya japonica, bổ sung môi trƣờng nuôi cấy với 2,5 mg/L BA 1,0 mg/L NAA nồng độ triterpene tổng số tăng lên đáng kể [90] Nhiều nghiên cứu cho thấy cytokinin ethylene tăng cƣờng tích tụ alkaloid tế bào dừa cạn Catharanthus roseus qua đƣờng sinh tổng hợp độc lập [91] 53 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã xác định đƣợc vật liệu ban đầu sử dụng để cảm ứng tạo mơ sẹo đoạn lóng thứ tính từ đỉnh chồi cây, kích thƣớc đoạn lóng thân thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo 0,3 cm - Tốc độ hình thành mơ sẹo hình thái mô sẹo hai giống dừa cạn hoa trắng hoa đỏ tƣơng đƣơng - Đã tối ƣu hóa đƣợc mơi trƣờng cảm ứng tạo mơ sẹo giống dừa cạn trắng đỏ 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D - Đã tối ƣu hóa đƣợc mơi trƣờng nhân nhanh tế bào giống dừa cạn trắng đỏ là: Môi trƣờng đặc: 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,6 mg/L Kinetin; Môi trƣờng lỏng: 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,6 mg/L kinetin - Lƣợng tế bào ban đầu cho vào môi trƣờng nuôi cấy huyền phù 150 mg tế bào/ 100 mL môi trƣờng nuôi cấy, tƣơng đƣơng với mL dung dịch tế bào chuẩn nuôi thời điểm 18 ngày - Điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù đƣợc thực điều kiện lắc với tốc độ 120 v/p 25oC ± 10C tối 4.2 Kiến nghị Tiếp tục sử dụng hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn hai giống QN02 H01 để phát triển tế bào có khả tăng cƣờng sinh tổng hợp hợp chất alkaloid phenolic có tiềm làm thuốc 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thực vật chí Việt Nam, Tập V 2007 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Gajalakshmi S, Vijayalakshmi S, Devi RV (2013) Pharmacological activities of Catharanthus roseus: A perspective review International Journal of Pharmaceutical Science 4(2):431-439 [3] Sreevalli Y, Baskaran K, Kulkarni RN, Kumar S (2000) Further evidence for the absence of automatic and intra-flower selfpollination in periwinkle Current Science 79 (12):1648-1649 [4] Grellier P, Sinou V, Garrea de Loubresse N et al (1999) Selective and reversible effects of vinca alkaloids on Trypanosoma cruzi epimastigote forms: blockage of cytokinesis without inhibition of the organelle duplication Cell Motil Cytoskeleton 42:36–47 [5] Tiong SH, Looi CY, Hazni H, Arya A, Paydar M, Wong WF, Cheah SC, Mustafa MR, Awang K (2013) Antidiabetic and antioxidant properties of alkaloids from Catharanthus roseus (L.) G Don Molecules 18:9770-9784 [6] Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, and Tran Van Sung (2014) Further chemical constituents of Catharanthus rosues (L.) G Don collected from Binh Dinh province, Vietnam Vietnam Journal of Chemistry, 52(5), 626-628 [7] Võ Văn Chi ( 2012), Từ điển thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học, Hà Nội, Tr 830-831 [8] Georgiev M, Weber J (2014) Bioreactors for plant cells: Hardware configuration and internal environment optimization as tools for wider commercialization Biotechnology letters 36 [9] Cardoso JC, Sheng Gerald LT, Silva JAT (2018) Micropropagation in the twentyfirst century In: Loyola-Vargas V, Ochoa-Alejo, N (org) Methods in molecular biology 4th ed New York: Springer 1815: 17-46 [10] Mendoza D, Cuaspud O, Arias JP, Ruiz O, Arias M (2018) Effect of salicylic acid and methyl jasmonate in the production of phenolic compounds in plant cell suspension cultures of Thevetia peruviana Biotechnology reports (Amsterdam, Netherlands) 19, e00273 [11] Goldstein DA, Thomas JA (2004) Biopharmaceuticals derived from genetically modified plants QJM: International Journal of Medicine 97: 705-716 55 [12] Sandhu SS, Abreu IN, Colombo CA, Mazaferra P (2006) Pilocarpine content and molecular diversity in jaborandi Scientia Agraria 63: 478-482 [13] Vaz APA, Scaranari C, Batista LAR, Figueira GM, Sartoratto A, Magalhóes PM (2006) Biomassa e composiỗóo quớmica de genótipos melhorados de espécies medicinais cultivadas em quatro municípios paulistas Pesquisa Agropecuária Brasileira 41: 869-872 [14] Gobbo-Neto L, Lopes NP (2007) Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários Quimica Nova 30: 374-381 [15] Cui XH, Murthy HN, Jin YX, Yim YH, Kim JY, Paek KY (2011) Production of adventitious root biomass and secondary metabolites of Hypericum perforatum L in a balloon type airlift reactor Bioresource Technology 102: 10072-10079 [16] Kapoor S, Raghuvanshi R, Bhardwaj P, Sood H, Saxena S, Chaurasia OP (2018) Influence of light quality on growth, secondary metabolites production and antioxidant activity in callus culture of Rhodiola imbricata Journal of Photochemical and Photobiology B: Biology 183: 258-265 [17] Gerth A, Schmidt D, Wilken D (2007) The production of plant secondary metabolites using bioreactors Acta Horticulturae764: 95-104 [18] Thakore D, Srivastava AK, Sinha AK (2017) Mass production of ajmalicine by bioreactor cultivation of hairy roots of Catharanthus roseus Biochemical Engineering Journal 119: 84-91 [19] Grzegorczyk-Karolak I, Kuzma L, Wisokinska H (2015) The effect of cytokinins on shoot proliferation, secondary metabolite production and antioxidant potential in shoot cultures of Scuttelaria alpina Plant Cell Tissue and Organ Culture122: 699-708 [20] Ali M, Abbasi BH, Ali GS (2015) Elicitation and antioxidant secondary metabolites with jasmonates and gibberellic acid in cell suspension cultures of Artemisia absinthium L Plant Cell Tissue and Organ Culture 120: 1099-1106 [21] Siddiqui ZH, Mujib A, Aslam J (2013) In vitro production of secondary metabolites using elicitor in Catharanthus roseus: a case study In: Hakeem KR, Ahmad P, Ozturk M: Crop Improvement: 401-419 [22] Tonk D, Mujib A, Maqsood M, Ali M, Zafar N (2016) Aspergillus flavus fungus elicitation improves vincristine and vinblastine yield by augmenting callus biomass growth in Catharanthus roseus Plant Cell Tissue Organ Culture 126: 291-303 56 [23] Sharma M, Ahuja A, Gupta R, Mallubhotla S (2015) Enhanced bacoside production in shoot cultures of Bacopa monnieri under the influence of abiotic elicitors Natural Product Research 29: 745-749 [24] Ferri M, Tassoni A (2011) Chitosan as elicitor of health beneficial secondary metabolites in in vitro plant cell cultures In: MACKAY, RG; TAIT, JM (eds) Handbook of Chitosan Research and Applications Chapter22: 389-413 [25] Maqsood M, Abdul M (2017) Yeast extract elicitation increases vinblastine and vincristine yield in protoplast derived tissues and plantlets in Catharanthus roseus, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 27( 5): 549-556 [26] Ramirez-Estrada K, Vidal-Limon H, Hidalgo D, Moyano E, Goleniowski M, Cusidó, RM, Palazon J (2016) Elicitation, an effective strategy for the biotechnological production of bioactive high-added value compounds in plant cell factories Molecules 21: 182 [27] Klein FRS, Reis A, Kleinowski RT, Telles RT, Amarante L, Peters JA, Braga EJB (2018) UV-B radiation as an elicitor of secondary metabolite production in plants of the genus Alternanthera Acta Botanica Brasilica32: 615-623 [28] Ludwig-Müller J (2015) Plants and endophytes: equal partners in secondary metabolite production? Biotechnology Letters 37: 1325-1334 [29] Ahmad N, Rab A, Ahmad N (2016) Light-induced biochemical variations in secondary metabolite production and antioxidant activity in callus culture of Stevia rebaudiana (Bert.) Journal of Photochemical and Photobiology B: Biology 154: 5156 [30] Gao X, Bjork L (2000) Chemical characters, height and root weight in callus regenerated plants of Valeriana officinalis L Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 7: 31-39 [31] Chang C, Chang WC (1998) Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var misericors Plant Cell Rep 17: 251–255 [32] Kumar KS., Bhavanandan KV (1988) Micropropagation of Plumbago rosea Linn Plant Cell Tiss Organ Cult 15: 275–278 [33] Chalageri G, and Babu UV (2012) In vitro plant regeneration via petiole callus of Viola patrinii and genetic fidelity assessment using RAPD markers Turk J of Bot 36, 358-368 57 [34] Lee, NYS, Khoo WKS, Adnan MA, Mahalingam TP, Fernandez AR, Jeevaratnam K (2016) The pharmacological potential of Phyllanthus niruri Journal of Pharmacy and Pharmacology 68: 953-969 [35] Wang J, Qian J, Yao L, Lu Y (2015) Enhanced production of flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of Hypericum perforatum Bioresources and Bioprocesses 2: DOI 10.1186/s40643-014-0033-5 [36] Chen L, Cai Y, Liu X (2018) Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation Crop Journal 6: 162-171 [37] Sujatha G, Korac-Zdravkovic S, Calic D, Flamini G, Kumari BDR (2013) Highefficiency Agrobacterum rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: Hairy root production and essential oil analysis Industrial Crops Production 44: 643-652 [38] Thiruvengadam M, Rekha K, Chung IM (2016) Induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenesis-mediated transformation of spine gourd (Momordica dioica Roxb Ex Willd) for the assessment of phenolic compounds and biological activities Scientia Horticulturae 198: 132-141 [39] Deus B, Zenk MH (1982) Exploitation of plant cells for the production of natural compounds Biotechnol Bioeng 24:1965–1974 [40] Kurz WGW, Chatson KB, Constabel F (1985) Biosynthesis and accumulation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus cultivars In: Neumann KH, Barz W, Reinhard E, editors Primary and Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures 1st ed Volume Springer-Verlag; Berlin, Germany, pp 143– 153 [41] Ganapathi B, Kargi F (1990) Recent Advances in Indole Alkaloid Production by Catharanthus roseus (Periwinkle) J Exp Bot 41:259–267 [42] Mannonen L, Toivonen L, Kauppinen VC (1990) Effects of long term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell culture Plant Cell Rep 9:173–177 [43] Bachiri Y, Gazeau C, Hansz J, Morisset C, Dereuddre J (1995) Successful cryopreservation of suspension cells by encapsulation dehydration Plant Cell Tissue Organ Cult 43:241–248 58 [44] El-Sayed M, Verpoorte R (2007) Catharanthus terpenoid indole alkaloids: Biosynthesis and regulation Phytochem Rev 6:277–305 [45] Endo T, Goodbody AE, Misawa M (1987) Alkaloid production in root and shoot cultures of Catharanthus roseus Planta Med 53:479–482 [46] Shukla AK, Shasany AK, Verma RK, Gupta MM, Mathur AK, Khanuja PSP (2010) Influence of cellular differentiation and elicitation on intermediate and late steps of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus Protoplasma 24:35–47 [47] Van der Heijden R, Verpoorte R, ten Hoopen HJG (1989) Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus (L.) G Don: A literature survey Plant Cell Tissue Organ Cult 18:231–280 [48] Zhao J, Hu Q, Guo YQ, Zhu WH (2001) Effects of stress factors, bioregulators, and synthetic precursors on indole alkaloid production in compact callus clusters cultures of Catharanthus roseus Appl Microbiol Biotechnol 55:693–698 [49] Wang JY, Liu ZP, Liu L, Liu C (2008) Effects of NaCl on the growth and alkaloid content of Catharanthus roseus seedlings J Appl Ecol 19:2143–2148 [50] Zhao J, Zhu WH, Hu Q, He XW (2001) Enhanced indole alkaloid production in suspension compact callus clusters of Catharanthus roseus: Impacts of plant growth regulators and sucrose Plant Growth Reg 33:33–41 [51] Schlatmann JE, Koolhaas CMA, Vinke JL, ten Hoopen HJG, Heijnen JJ ( 1995) The role of glucose in ajmalicine production by Catharanthus roseus cell cultures Biotechnol Bioeng 47:525–534 [52] Zhao J, Zhu WH, Hu Q (2001) Effects of light and plant growth regulators on the biosynthesis of vindoline and other indole alkaloids in Catharanthus roseus callus cultures Plant Growth Reg 33:43–49 [53] Jung KH, Kwak SS, Kim SW, Lee H, Choi CY, Liu JR (1992) Improvement of the catharanthine productivity in hairy root cultures of Catharanthus roseus by using monosaccharides as a carbon source Biotechnol Lett 14:695–700 [54] Almagro L, Lopez Perez AJ, Pedreno MA (2011) New method to enhance ajmalicine production in Catharanthus roseus cell cultures based on the use of cyclodextrins Biotechnol Lett 33(2):381-385 59 [55] Van der Heijden R, Jacobs D., Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R (2004) The Catharanthus alkaloids: Pharmacognosy and biotechnology Curr Med Chem, 11:1241–1253 [56] Asada M, Shuler ML (1989) Stimulation of ajmalicine production and excretion from Catharanthus roseus: Effects of adsorption in situ, elicitors, and alginate immobilization Appl Microbiol Biotechnol 30:475–481 [57] Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalicine and catharanthine from immobilized Catharanthus roseus cells Biotechnol Bioeng 67:61–71 [58] El-Sayed M, Verpoorte R (2002) Effect of phytohormones on growth and alkaloid accumulation by a Catharanthus roseus cell suspension cultures fed with alkaloid precursors tryptamine and loganin Plant Cell Tissue Organ Cult 68:265–270 [59] Lee CWT, Shuler ML (1991) Different shake flask closures alter gas phase composition and ajmalicine production in Catharanthus roseus cell suspensions Biotechnol Technol 5:173–178 [60] Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S (2003) Studies on Production of Ajmalicine in Shake Flasks by Multiple Shoot Cultures of Catharanthus roseus Biotechnol Prog 19:1071–1075 [61] Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana Plant J 16(6):735-743 [62] Mishra MR, Srivastava RK, Akhtar N (2018) Enhanced Alkaloid Production from Cell Culture System of Catharanthus roseus in Combined Effect of Nutrient Salts, Sucrose and Plant Growth Regulators J Biotech Biomedical Sci 1(4):14-34 [63] Sreevidya N, Mehrotra S (2003) Spectrophotometric method for estimation of alkaloids precipitable with Dragendorff's reagent in plant materials Journal of AOAC international 86(6):1124-1127 [64] Fatemeh KA, Abdolreza B (2013) The effect of hormonal composition, type of explant and light condition on callus production in Periwinkle (Catharanthus roseus L.) Plant Tissue Cult Biotechnol 23(1):107-13 [65] Haq R, Naz S, Aslam F, Manzoor F (2013) Comparison of in vitro response of micropropagation and callogenesis of medicinal plant, Vinca rosea L J Agric Res 51(1):9-17 60 [66] Soleimani F, Zarghami R, Ebrahimzadeh M (2013) Effects of 2,4-D and kinetin concentrations on vinblastine and vincristine alkaloid contents in callus of periwinkle (Catharanthus roseus) Int J AgriSci 3(10):759-765 [67] Verma AK, Singh RR, Singh S (2012) Improved alkaloid content in callus culture of Catharanthus roseus Bot Serbica 36(2):123-30 [68] Negi RS (2011) Fast in-vitro callus induction in Catharanthus roseus - A medicinally important plant used in cancer therapy Res J Pharm Biol Chem Sci 2(4):597-603 [69] Kalidass C, Ramasamy MV, Daniel A (2010) Effect of auxin and cytokinin on vincristine production by callus cultures of Catharanthus roseus L (apocynaceae) Tropical and Subtropical Agroecosystems 12:283-288 [70] George EF, Sherrington PD (2008) Plant Propagation by Tissue Culture, Fourth edition Ltd England [71] Skoog F, Miller CO (1957) Chemical control of growth and bud formation in tobacco segment and callus cultured in vitro J Bot 35: 782-790 [72] Faisal M, Anis M (2003) Rapid mass propagation of Tylophora indica Merrill via leaf callus culture Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 125–129 [72] Shahzad A, Ahmad N and Anis M (2006) An improved method of organogenesis from cotyledon callus of Acacia sinuata (Lour.) Merr using thidiazuron J Plant Biotech 8(1): 15-19 [73] Faisal M, Ahmad N, Anis M (2006) Plant regeneration via organogenesis in callus cultures of Ruta graveolens L Phytomorphology 56:183–187 [74] Maity S, Ray S, Banerjee N (2005) The role of plant growth regulators on direct and indirect plant regeneration from various organs of Leucaena leucocephala Acta Physiologiae Plantarum 27: 473-480 [75] Choi H, Kim S, Son J, et al (2000) Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in suspension culture of Taxus chinensis Enzyme Microb Tech 27: 593–598 [75] Sidhu Y (2010) In vitro micropropagation of medicinal plants by tissue culture Plymouth Student Sci 4(1):432-49 [76] Staniszewska I, Krolicka A, Malinski E, et al (2003) Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L Enzyme Microb Tech 33: 565–568 61 [77] Ten Hoopen HJG, Vinke JL, Moreno PRH, et al (2002) Influence of temperature on growth and ajmalicine production by Catharantus roseus suspension cultures Enzyme Microb Tech 30:56–65 [78] Ramani S, Chelliah J (2007) UV-B-induced signaling events leading to enhancedproduction of catharanthine in Catharanthus roseus cell suspension cultures BMC Plant Biol 7: 61 [79] Tassoni A, Durante L, Ferri M (2012) Combined elicitation of methyl-jasmonate and red light on stilbene and anthocyanin biosynthesis J Plant Physiol 169: 775–781 [80] Bùi Văn Lệ Nguyễn Ngọc Hồng (2006) Ảnh hƣởng chất điều hòa tăng trƣởng thực vật đƣờng saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus Tạp chí phát triển KH&CN 9(6): 59-66 [81] Nguyễn Văn Vinh (2010) Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dừa cạn (Catharanthus roceus L.) điều kiện ni cấy in vitro Tạp chí phát triển KH&CN 48(1): 87-95 [82] Zhang Y, Zhong J (1997) Hyperproduction of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng cells Enzyme Microb Tech 21:59–63 [83] Coste A, Vlase L, Halmagyi A, et al (2011) Effects of plant growth regulators and elicitors on production of secondary metabolites in shoot cultures of Hypericum hirsutum and Hypericum maculatum Plant CellTissue Organ Culture (PCTOC) 106: 279–88 [84] Han J, Zhong J (2003) Effects of oxygen partial pressure on cell growth and ginsenoside and polysaccharide production in high density cell cultures of Panax notoginseng Enzyme Microb Tech 32:498–503 [85] Gamborg OLC, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res 50: 151–158 [86] Hockin NL, Mock T, Mulholland F, et al (2012) The response of diatom central carbon metabolism to nitrogen starvation is different from that of green algae and higher plants Plant Physiol 158: 299–312 [87] Chandler SF, Dodds JH (1983) The effect of phosphate, nitrogen and sucrose on the production of phenolics and solasodine in callus cultures of Solanum laciniatum Plant Cell Rep 2: 205–208 62 [88] Pawar KD, Thengane SR (2009) Influence of hormones and medium components on expression of dipyranocoumarins in cell suspension cultures of Calophyllum inophyllum L Process Biochem 44: 916–922 [89] Nagella P, Murthy HN (2010) Establishment of cell suspension cultures of Withania somnifera for the production of withanolide A Bioresource Technol, 101, 6735–9 [90] Ho H, Liang K, Lin W, et al (2010) Regulation and improvement of triterpene formation in plant cultured cells of Eriobotrya japonica Lindl J Biosci Bioeng 110: 588–592 [91] Yahia A, Kevers C, Gaspar T, Chénieux JC, Rideau M, Crèche J (2005) Cytokinins and ethylene Catharanthus roseus suspension cells Biotechnol Bioeng 89(3):367-371 63 ... NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN “NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.) CỦA VIỆT... kiện nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn Cụm tế bào dừa cạn kích thƣớc x mm2 phát triển tốt môi trƣờng CT3 đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng lỏng CT4 để tạo tế bào huyền phù Nuôi cấy tế bào huyền phù. .. triển tế bào dừa cạn 50 Hình 3.13 Ảnh hƣởng ánh sáng đến phát triển tế bào huyền phù dừa cạn A tế bào nuôi tối; B tế bào ni ngồi ánh sáng 50 Hình 3.14 Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02