Luận văn xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn kappaphycus alvarezii bằng phương pháp kết hợp enzym với axit

9 LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, nhiều loài rong biển đƣợc sử dụng để nghiên cứu lĩnh vực nông nghiệp nhằm phát triển dạng phân bón Trong đó, rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm thành phần chủ yếu κcarrageenan, thủy phân đƣa dạng oligo ( κ-oligo carrageenan) tác động tích cực đến sinh trƣởng thực vật [1,2,3], ngồi rong sụn Kappaphycus alvarezii cịn có chứa khoáng chất vi lƣợng: niken, cabon, kẽm, đồng, sắt ; khoáng đa lƣợng nhƣ natri, canxi [4] đáp ứng tốt cho nhu cầu sinh trƣởng, phát triển cho trồng Rong sụn Kappaphycus alvarezii chứa hàm lƣợng carrageenan cao (40% trọng lƣợng chất khô) Carrageenan ngày đƣợc ứng dụng phổ biển nhiều lĩnh vực khác [4], [5], [6], [7] Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy việc thủy phân carrageenan đƣa dạng oligo carrageenan xu hƣớng cần thiết Bởi lẽ, oligo carrageenan loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng vi-rút, chất chống oxy hóa, chất điều hòa miễn dịch, chống viêm chống khối u [8,9] nhiều ứng dụng thực phẩm nhƣ làm tăng khả nhũ hóa thuốc, tăng khả tạo độ dẻo dai cho thực phẩm Đặc biệt oligo carrageenan cịn thúc đẩy q trình quang hợp, kích thích sinh trƣởng thực vật [1,10] đƣợc nghiên cứu làm phân bón có hiệu rõ rệt [11,12,13] Oligo carrageenan đƣợc đƣợc thủy phân nhiều phƣơng pháp khác ( vật lí [14,15], hóa học [16,17,18], sinh học [19,20,21]) Trong phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp thủy phân xúc tác axit có số lợi quan trọng nhƣ tốc độ phản ứng nhanh, giá rẻ dễ dàng có sẵn; nhƣợc điểm q trình tách sản phẩm dịch thủy phân khó khăn Nhiều nghiên cứu gần cho thấy việc sử dụng enzym để thu carrrageenan có nhiều ƣu điểm carrrageenan thu đƣợc dễ dàng tinh chế Bởi vì, trình thủy phân enzym làm suy yếu mô rong biển bào mòn thành tế bào thân rong, giúp cho trình chiết đƣợc triệt để dễ dàng Tuy nhiên, Tan Lee, (2014) [22] cho thấy κ-carrageenan không dễ dàng bị thủy phân enzym liên kết κ-carrageenan nƣớc tạo 10 liên kết chắn chống lại thủy phân enzym dẫn đến hiệu suất thủy phân không cao Vì sử dụng axit H3PO4 nhƣ chất xúc tác trình thủy phân carrageenan nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii Nhằm đƣa quy trình thủy phân phù hợp để tạo hiệu suất thủy phân cao sử dụng sản phẩm (oligo carrageenan) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii làm phân bón nơng nghiệp Vì thực đề tài ― Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử đặc trƣng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn Kappaphycus alvarezii phƣơng pháp kết hợp enzym với axit ‖ cần thiết, góp phần mở hƣớng phát triển cho ngành nông nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp phân bón nƣớc ta Mục tiêu luận văn Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử đặc trƣng cấu trúc oligo carrageenan thu đƣợc phƣơng pháp thủy phân enzym kết hợp axit (enzym Viscozyme L axit H3PO4 0,15M) điều kiện khác (ảnh hƣởng enzym, thời gian xử lí enzym, thời gian thủy phân), từ đƣa quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng nông nghiệp Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu luận văn bao gồm: - Khảo sát hiệu suất thủy phân điều kiện thủy phân khác - Đƣa điều kiện thủy phân đạt hiệu suất thủy phân thích hợp Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình đặc trƣng cấu trúc carrageenan dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau trình thủy phân 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN Rong sụn thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), phân lớp: Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus, lồi: alvarezii, lồi Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty lồi có sản lƣợng lớn [23] Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc trồng phổ biến với mục đích làm thức ăn nhƣ nguồn cung cấp carrageenan cho ngành cơng nghiệp Lồi đƣợc nuôi thành công Philippines kể từ năm 1970 đƣợc giới thiệu 20 quốc gia cho mục đích ni trồng thủy sản Gần đây, K alvarezii thu hút ý đáng kể khơng nhƣ nguồn cung cấp carrageenans cịn nguồn protein có giá trị thực tiễn y học Vào năm 1993, Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống tiến hành nuôi trồng thử nghiệm rong sụn vùng ven biển Việt Nam (Khánh Hòa, Ninh Thuận…) Rong sụn tƣơi thƣờng có màu xanh đỏ nâu màu xanh rong có hai loại sắc tố phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) chlorophyll Rong sụn thuộc loài đơn trụ bao gồm phần: Phần lõi: gồm tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến Xung quanh có từ ÷ hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình trịn hay hình đa giác, suốt, vách mỏng chứa chất dinh dƣỡng Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ xếp khít nhau, hình trịn hay hình bầu dục, khơng suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khơ, đóng vai trò bảo vệ lớp bên [24] 12 Thành phần rong sụn carrageenan Hàm lƣợng carrageenan chiếm đến 40% trọng lƣợng khơ rong sụn Thành phần hóa học rong sụn nguyên liệu trình bày Bảng 1.1 Bảng 1.1 Thành phần hóa học rong sụn [25] Tên thành phần hóa học % (khối lƣợng) Protein 2,4 Cellulose 4,0 Ẩm 19,4 Tro tổng 20,0 Carrageenan 40,0 Thành phần khác 14,2 1.2 TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 1.2.1 Giới thiệu chung carrageenan Tên carrageenan có nguồn gốc từ loài rong biển Chondrus crispus đƣợc gọi Carrageen Moss Ailen Moss Anh, Carraigin Ireland Carraigin đƣợc sử dụng Ireland từ 400 năm sau công nguyên dƣới dạng gelatin làm thuốc nhà để chữa ho cảm lạnh Carrageenan đƣợc sử dụng nhiều ứng dụng thƣơng mại nhƣ chất tạo gel, làm đặc ổn định, đặc biệt thực phẩm sản phẩm nƣớc sốt Ngoài chức này, carrageenan đƣợc sử dụng y học thực nghiệm, dƣợc phẩm công thức, mỹ phẩm ứng dụng công nghiệp Từ kỷ 19, rong biển đỏ Chondrus crispus đƣợc sử dụng công nghiệp bia Năm 1930 Mỹ bắt đầu sản xuất carrageenan thƣơng mại chuyển từ bột rong biển khô sang carrageenan tinh chế [26] Sau chiến tranh giới thứ hai, việc đáp ứng lƣợng carrageenan ngày tăng cao Do đó, 13 vào đầu năm 1950 Q trình phân đoạn chiết xuất carrageenan thô đời [27] Carrageenan thành phần thành tế bào tảo đỏ hay Rhodophyta, polysaccharide có chứa đơn vị galactose lặp lại 3,6-anhydrogalactose hai loại sulfat khơng sulfat hóa [28] Trong số đó, κ-carrageenan chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thƣờng đƣợc sử dụng cho ứng dụng rộng rãi khoa học thực phẩm, công nghệ dƣợc phẩm nông nghiệp [29] Trong cấu tạo carrageenan gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) cịn LGalactose chiếm lƣợng nhỏ Do đó, carrageenan tạo thành chủ yếu mạch poly D-Galactose bị sulfat hố có phân tử lƣợng 500 ÷ 700kDalton [30] Hình 1.1 Cấu trúc hóa học carrageenan Carrageenan polysaccharide dị thể galactose –galactan Ngồi mạch polysaccharide cịn có nhóm sulfat đƣợc gắn vào carrageenan vị trí số lƣợng khác Vì vậy, carrageenan khơng polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc định mà galactan sulfat Mỗi galactan sulfat dạng riêng carrageenan có ký hiệu riêng Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [31] 1.2.2 Cấu trúc carrageenan Bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân phát carrageenan có nhiều dạng cấu trúc hố học khác Dựa vào cấu trúc hố học, ngƣời ta phân carrageenan thành loại nhƣ sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta xi Các loại khác mức độ sulfat hố, vị trí sulfat hoá, mức độ dehydrat hoá chuỗi polysacharid Khối lƣợng phân tử đại phân tử 14 carrageenan khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu trình chiết [32], [33], [34], [35] Về carrageenan chia thành loại chính: κ-car, ι -car, λ -car Trong đó, κ-car chiếm thị phần lớn (80%) Mu Nu chất ban đầu tổng hợp nên kappa iota, việc chuyển đổi enzym dekinkase có rong biển hay q trình sản xuất dùng xúc tác để loại nhóm sulfat [30] * κ-carrageenan: loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ D- galactose-4-sulfat (GalS) 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình 1.2) Cấu trúc phân tử κ-car vịng xoắn kép bậc III Hình 1.2 Cấu trúc κ-carrageenan *ι -carrageenan : loại car có số lƣợng gốc sulfat nằm trung gian số lƣợng gốc sulfat κ-car λ -car (Hình 1.3) Khi tạo gel, khối gel ι -car có tính đàn hồi tốt khối gel loại carrageenan khác Hình 1.3 Cấu trúc ι –carrageenan 15 *λ -carrageenan: Trong mạch phân tử gồm đơn vị monomer gồm: D- galactose-2-sulfat (1,3) D-Galactose-2-6-disulfat nối xen kẽ với (Hình 1.4) Hình 1.4 Cấu trúc λ -carrageenan Các loại carrageenan có tính đa phân tán, nhƣng chúng khác thành phần sulfat ester gốc quay quang λ -Car có khối lƣợng phân tử cao mạch dài κ-Car Thành phần phân đoạn phụ thuộc vào nhiệt độ chiết loại rong nguyên liệu [30], [35], [36] Sự khác loại carrageenan vị trí số lƣợng nhóm ester sulfat đính vào chuỗi polysacharide, loại có tính chất vật lý hố học đặc trƣng khác 1.2.3 Tính chất lí hóa carrageenan Khả phản ứng hóa học carrageenan phụ thuộc chủ yếu vào nhóm este sulfat Carrageenan anion mạnh so sánh với chất vơ Liên kết cation với cấu trúc đƣờng đơn vị chuỗi polyme xác định thuộc tính vật lý carrageenan Ví dụ: kappa- iotacarrageenan tạo thành gel có ion kali canxi lamdacarrageenan khơng [37] Chức carrageenan ứng dụng khác phụ thuộc phần lớn vào tính chất lƣu biến Carrageenan dạng polyme mạch thẳng, tan nƣớc, thƣờng tạo thành dung dịch nƣớc có độ nhớt cao Độ nhớt phụ thuộc vào nồng độ, nhiệt độ, diện chất hòa tan khác loại carrageenan trọng lƣợng phân tử [38] Độ nhớt tăng tăng nồng độ carrageenan giảm 16 theo nhiệt độ Nếu nhƣ nhiệt độ cao độ pH thấp tốc độ thủy phân car nhanh [39] Trong môi trƣờng kiềm, carrageenan từ nhóm cấu trúc khơng có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhóm cấu trúc có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose [40] Ví dụ: µ-, ν- carrageenan đƣợc xem tiền thân κ- ι- carrageenan Sự hình thành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose tự nhiên đƣợc xúc tác enzym sulphohydrolase [39] 17 Hình 1.5 Q trình chuyển nhóm cấu trúc loại carrageenan [40] 18 1.2.4 Oligo carrageenan ứng dụng 1.2.4.1 Oligo carrageenan Tiến hành thủy phân carrageenan cấu trúc kappa, lamda iota mạch carrageenan bị cắt ngắn thu đƣợc oligo carrageenan Những oligo carrageenan bao gồm khoảng 20 đơn vị galactose sulphat liên kết luân phiên liên kết glycoside β-1,4- α-1,3- với nhóm sulphat vị trí 2, vịng galactose có khơng có đơn vị anhydrogalactose [11] Carrageenan dễ bị axit chất oxy hóa bẻ gãy liên kết Khi thủy phân axít yếu, liên kết glycoside α-l,3- bị phá vỡ, tạo thành mảnh carrabiose Mảnh carrabiose galactose nên gọi galactobiose (Hình 1.6) Hình 1.6 Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành galactobiose Trong trƣờng hợp thuỷ phân axít đậm đặc, lực ion lớn liên kết glycoside α- l,3- bị phá vỡ mà liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ Hình 1.7 Thủy phân carrageenan axit đậm đặc [16] Hình PL1.5 Phổ IR hồng ngoại thủy phân rong sụn H3PO4 0,15M, 700C ủ ngày, thủy phân 60 phút Hình PL1.6 Phổ IR hồng ngoại thủy phân rong sụn enzym Viscozyme L H3PO4 0,15M, 700C, xử lí enzym ngày, thủy phân 60 phút Hình PL1.7 Phổ IR hồng ngoại thủy phân rong sụn enzym Viscozyme L H3PO4 0,15M, 700C, xử lí enzym ngày, thủy phân 60 phút PHỤ LỤC 0.7 y = 0.0044x + 0.0941 R² = 0.9957 Độ hấp thụ Abs 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 140 Hàm lƣợng Glucose (µg/L) Hình PL2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose theo độ hấp thụ đo bƣớc sóng 490nm CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN San, P.T.; Khanh, C.M.; Khanh, H.H.N.; Khoa, T.A.; Hoang, N.; Nhung, L.T.; Trinh, N.T.K.; Nguyen, T.-D k-Oligocarrageenan Promoting Growth of Hybrid Maize: Influence of Molecular Weight Molecules 2020, 25, 3825 ... nghiệp Vì thực đề tài ― Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử đặc trƣng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn Kappaphycus alvarezii phƣơng pháp kết hợp enzym với axit ‖ cần thiết, góp... TRÌNH THỦY PHÂN RONG SỤN KAPPAPHYSUS ALVAREZII BẰNG PHƢƠNG PHÁP ENZYM KẾT HỢP AXIT Từ kết khảo sát trên, quy trình thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii phƣơng pháp enzym Viscozyme L kết hợp axit. .. đặc biệt ngành cơng nghiệp phân bón nƣớc ta Mục tiêu luận văn Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử đặc trƣng cấu trúc oligo carrageenan thu đƣợc phƣơng pháp thủy phân enzym kết hợp axit (enzym