Luận văn tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega 6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp

1 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 1.1.1 Giới thiệu lipid 1.1.2 Giới thiệu MUFAs PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) 1.1.3 Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9 1.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 13 1.2.1 Định nghĩa 13 1.2.2 Sinh thái học VKTQH 14 1.2.3 Ứng dụng VKTQH 14 1.2.4 Khả sinh tổng hợp axit béo không no VKTQH 17 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU 19 1.3.1 Các phƣơng pháp tách chiết dầu 19 1.3.2 Các phƣơng pháp làm giàu 23 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 25 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt nam 27 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29 2.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 29 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1 Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo hỗn hợp axit béo dạng methyl ester 30 2.3.2 Tối ƣu thông số trình tách chiết TFA 31 2.3.3 Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, dầu vi khuẩn tía phƣơng pháp tạo phức với ure 32 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích thành phần axit béo dầu 33 2.3.5 Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan 34 2.3.6 Phƣơng pháp xác định số axit 34 2.3.7 Phƣơng pháp xác định số iot 35 2.3.8 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng urê 35 2.3.9 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng dầu sinh học 36 2.3.10 Phƣơng pháp xác định vi sinh vật dầu sinh học 37 2.3.11 Phƣơng pháp xử lý thống kê 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3 38 3.2 TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH 39 3.2.1 Kết xác định ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng 39 3.2.2 Kết xác định ảnh hƣởng chất xúc tác 40 3.2.3 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi (khối lƣợng/ thể tích) 41 3.2.4 Kết xác định ảnh hƣởng thời gian phản ứng 42 3.2.5 Kết xác định ảnh hƣởng điều kiện khuấy trộn 43 3.3 TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ 44 3.3.1 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trình làm giàu hỗn hợp axit béo 44 3.3.2 Kết xác định ảnh hƣởng tỷ lệ TFA: urê: methanol trình làm giàu hỗn hợp axit béo 47 3.3.3 Kết xác định ảnh hƣởng nhiệt độ kết tinh trình làm giàu hỗn hợp axit béo 48 3.3.4 Kết nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi omega-6, 7, việc tạo phức lần với urê 49 3.4 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, TỪ SINH KHỐI VKTQH 50 3.5 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, TÁCH CHIẾT ĐƢỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU 54 3.5.1 Kết xác định tiêu cảm quan, hóa lý 54 3.5.2 Kết xác định thành phần axit béo 55 3.5.3 Kết xác định dƣ lƣợng urê, kim loại nặng 55 3.5.4 Kết tiêu vi sinh vật có dầu sinh học omega-6, 7, 56 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN MỞ ĐẦU Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (thực phẩm chức năng) giàu omega-3, 6, 7, đƣợc chứng minh có vai trị quan trọng việc giảm nguy mắc bệnh tim mạch, giảm cân, tiêu hóa, giữ ẩm cho da, tóc móng tay, giảm đau dây thần kinh, đái tháo đƣờng Omega-3, 6, có nhiều loại dầu động, thực vật nhƣ dầu oliu, dầu đậu nành, dầu hạt hƣớng dƣơng, dầu cá thu, cá hồi, cá basa Tuy nhiên, omega-7 lại khan giới động vật thực vật Chúng chủ yếu đƣợc chiết xuất từ hắc mai biển dầu macadamia Hiện loài vi tảo biển lồi vi khuẩn sinh dầu nguồn nguyên liệu thay cho việc sản xuất axit béo khơng no Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) nhóm vi sinh vật quang tự dƣỡng, phân bố rộng rãi tự nhiên có nhiều ứng dụng số lĩnh vực nhƣ: sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao, sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc, gia cầm nuôi trồng thuỷ sản, xử lý nƣớc thải, sản xuất phân bón sinh học Thành phần axit béo VKTQH không lƣu huỳnh chứa hàm lƣợng axit béo khơng bão hịa nối đơi (monounsaturated fatty acid - MUFAs) đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) (dạng omega-3, 6, đặc biệt omega-7) cao Hàm lƣợng lipit VKTQH (chiếm khoảng 20 - 40% sinh khối khô – SKK) thấp so với vi tảo Tuy nhiên, công nghệ nuôi trồng chúng lại đơn giản nhiều so với vi tảo nhƣ khơng địi hỏi mơi trƣờng ni nghiêm ngặt để sản xuất axit béo Thành phần axit béo Rhodobacter sphaeroides có nhiều C16 - C18, thích hợp cho sản xuất diesel sinh học Ngoài ra, thành phần axit béo từ R sphaeroides chủ yếu bao gồm axit béo khơng bão hịa, đƣợc sử dụng làm thực phẩm bổ sung vào thức ăn cho ngƣời nhƣ omega-6, 7, Trong đó, axit vaccenic (C18:1, omega-7) chiếm 60% so với axit béo tổng số - total fatty acid - TFA nguồn axit béo omega-7 có vai trị quan trọng việc trì sức khỏe da màng tế bào ngƣời Ngoài ra, hàm lƣợng omega-7 (C18: 1, omega-7) loài thuộc chi Rhodovulum đạt đến 60 - 80% so với TFA Hai chủng VKTQH Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 R sphaeroides VTN.2 đƣợc phân lập Việt Nam có đặc điểm: sinh trƣởng mạnh (với mật độ quang đo bƣớc sóng 660nm - ∆OD660 >1,2); lipit tổng số cao (đạt đến 20% SKK) hàm lƣợng omega-6, 7, cao (chiếm 80% so với TFA) có tiềm sử dụng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu omega-6, 7, Tuy nhiên, hàm lƣợng axit béo nhƣ hiệu suất trình tách chiết axit béo từ sinh khối VKTQH lại phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trƣờng nuôi điều kiện tách chiết Hiện chƣa có nghiên cứu tách chiết omega đối tƣợng VKTQH Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực luận văn với tiêu đề “Tối ưu hóa điều kiện tách chiết làm giàu axit béo không no omega-6, 7, từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” Luận văn đƣợc thực với mục tiêu nội dung nghiên cứu nhƣ sau:  Với mục tiêu: Có đƣợc điều kiện thích hợp cho tách chiết axit béo tổng số (TFA) từ sinh khối khô VKTQH làm giàu axit béo không no omega-6, 7, phƣơng pháp tạo phức với urê  Nội dung nghiên cứu đề tài: - Tối ƣu điều kiện phản ứng tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH; - Tối ƣu điều kiện làm giàu omega-6, 7, từ TFA thu đƣợc phƣơng pháp tạo phức với urê; - Xây dựng quy trình tách chiết làm giàu axit béo khơng no omega-6, 7, từ sinh khối khô VKTQH; - Phân tích đánh giá chất lƣợng dầu sinh học omega-6, 7, tách chiết đƣợc CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 1.1.1 Giới thiệu lipid Lipid hợp chất hữu tự nhiên phổ biến tế bào thể sống Lipid thực phẩm đƣợc cung cấp từ động vật thực vật Lipid có nguồn gốc thực vật nhƣ bơ thực vật, dầu tinh luyện, shortening, đậu nành, đậu lạc, vừng Lipid có nguồn gốc động vật nhƣ: trứng, thịt, cá, thuỷ sản Các lipid có nguồn gốc động vật gọi mỡ, lipid có nguồn gốc thực vật gọi dầu Chúng có thành phần hoá học cấu tạo khác nhƣng có tính chất chung khơng hồ tan nƣớc mà hồ tan dung mơi hữu nhƣ: ether, cloroform, n-hexan, benzen… Lipid hợp phần cấu tạo quan trọng màng sinh học tế bào, nguồn cung cấp lƣợng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp vitamin A, D, E, F K cho thể sống [1] Trong thực phẩm, lipid có nhiều loại nhƣ: phospholipid, triglycerid, cholesterol, glycolipid, lipoprotein sáp với nhóm là: lipid đơn giản cấu tạo bao gồm hydro (H), carbon (C), oxy (O) lipid phức tạp có tạo phức ngồi C, H, O cịn có thành phần khác nhƣ P, S Những hợp chất thuộc lipid tồn tự nhiên đa dạng nhƣ: hydrocacbon bậc cao, ancohol, aldehyde, axit béo sản phẩm thứ cấp chúng nhƣ glycerid, sáp, phospholipid, glucolipid, sulfolipid [1] Lipid có nhiều dạng cấu trúc khác Tuy nhiên, thƣờng có chung nguyên tắc cấu trúc phân tử lipid bao gồm hai phần: phần đuôi mạch hydrocarbon kị nƣớc, phần tổ hợp nhóm chất ƣa nƣớc (gọi đầu phân cực) Cấu trúc đa dạng lipid đƣợc bắt nguồn từ axit béo khác tham gia vào thành phần Cho đến nay, nhà khoa học phát đƣợc 500 axit béo khác mức độ đặc điểm phân nhánh mạch hydrocacbon, số lƣợng vị trí nối đơi mạch, vị trí số lƣợng nhóm chức, độ dài mạch hydrocacbon… Các axit béo có mặt thành phần lipid thực vật, động vật cạn thƣờng có từ 16 đến 20 nguyên tử cacbon phân tử Trong sinh vật biển thành phần lipid đa phần chứa axit béo mạch dài từ 20 đến 26, chí đến 30 nguyên tử carbon [1] Axit béo đƣợc chia thành axit béo bão hịa axit béo khơng bão hịa Các axit béo khơng bão hịa gồm axit béo khơng bão hồ đơn (monounsaturated fatty acid - MUFAs) có nối đơi phân tử axit béo khơng bão hồ đa nối đơi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) có nối đơi phân tử 1.1.2 Giới thiệu MUFAs PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) Các axit béo khơng bão hồ MUFA PUFA đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực dinh dƣỡng dƣợc phẩm Đây axit béo không thay thể ngƣời tự tổng hợp đƣợc mà phải lấy từ thức ăn bên ngồi [2] MUFAs PUFAs có vai trò sinh học chủ yếu Đầu tiên tham gia vào điều hoà trao đổi lipid, vận chuyển hƣớng tới mô Thứ hai tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Ngoài ra, số PUFAs cịn đóng vai trị chất cho việc tổng hợp phân tử có hoạt tính sinh học nhƣ prostaglandin, thromboxan leukotrien [3] Các PUFAs đƣợc chia làm nhóm omega-3 omega-6 Ngồi ra, cịn có omega-7, [4] Tên gọi omega dựa vào liên kết đôi vị trí carbon Mạch hydrocarbon có đầu: đầu nhóm methyl đầu nhóm cacboxyl Chúng đƣợc phân loại theo vị trí liên kết đơi tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl Để vị trí nối đơi mạch cacbon đƣợc tính từ đầu methyl ngƣời ta sử dụng ký hiệu “n” “ω” Các liên kết đôi MUFA, PUFAs đƣợc tính từ gốc carboxyl đƣợc ký hiệu “Δ” Những nhóm omega-6, omega-7 hay omega-9 có liên kết đơi tƣơng ứng vị trí cacbon số 6, hay [2] Các axit béo omega-6 họ axit béo không no đa nối đơi, chúng có nối đơi C=C vị trí carbon thứ tính từ đầu methyl chuỗi axit béo Công thức chung omega-6 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)y COOH Các axit béo họ omega-6 axit linoleic (AL) (C18:2, n6); axit gamma linoleic (GLA) (C18:3, n-6); axit eicosadienoic (C20:2, n-6); axit dihomo gamma-linoleic (DGLA) (C20:3, n-6); axit arachidonic (C20:4, n-6); axit docosadienoic (C22:2, n-6) axit docosapetaenoic (DPA) (C22:5, n-6) [5] Các axit béo omega-7 thuộc họ axit béo khơng no có nối đơi đa nối đơi Chúng có nối đơi C=C vị trí carbon thứ tính từ đầu methyl chuỗi axit béo Công thức chung omega-7 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)nCOOH Các axit béo họ omega-7 axit palmitoleic (C16:1, n-7); axit vaccenic (C18:1, n-7), axit paulinic (C20:1, n-7) axit có nối đơi axit rumenic (C18:2n-7) [6] Các axit béo omega-9 thuộc họ axit béo không no nối đôi đa nối đơi Chúng có nối đơi C=C vị trí carbon thứ tính từ đầu methyl chuỗi axit béo Công thức chung omega-9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)nCOOH Các axit béo axit oleic (C18:1, n9); axit elaidic (C18:1, n-9); axit gondoic (C20:1, n-9); axit mead (C20:3, n9); axit erucic (C22:1, n-9) axit nervonic (C24:1, n-9) [6] 1.1.3 Vai trò omega-6, 7, sức khỏe ngƣời Trong khoảng thập kỷ gần đây, axit béo không no nối đôi (MUFAs) đa nối đôi (PUFAs) đƣợc nhà khoa học đặc biệt quan tâm vai trò to lớn chúng mang lại Mặc dù omega-6, có nhiều loại dầu động, thực vật nhƣng omega-7 lại khan giới thực vật động vật Chúng đƣợc chiết xuất chủ yếu từ hắc mai biển dầu macadamia [7] Tác dụng omega-6 [8] Một số nghiên cứu cho thấy uống GLA tháng trở lên làm giảm triệu chứng đau dây thần kinh, ức chế hoạt động khối u dòng tế bào ung thƣ vú giúp giảm huyết áp cao Thiếu omega-6 có khả gây lỗng xƣơng Nghiên cứu cho thấy, phụ nữ 65 tuổi bị loãng xƣơng, đƣợc uống bổ sung omega-6 giảm bị lỗng xƣơng năm so với khơng bổ sung chất Omega-6 cịn có tách dụng làm đẹp da, kích thích mọc tóc, điều tiết trao đổi chất trì hoạt động hệ thống sinh sản Tác dụng omega-7 [9] Sử dụng omega-7 giúp cung cấp dƣỡng chất độ ẩm cần thiết cho da, tóc, chống lại triệu chứng lão hố sớm nhƣ: nếp nhăn, khơ, độ đàn hồi, dấu hiệu lão hoá suy dinh dƣỡng Omega-7 cịn có tác dụng trì mức cholesterol khoẻ mạnh lƣợng đƣờng máu, giúp cho động mạch hoạt động tốt Nghiên cứu gần cho thấy omega-7 có tác dụng bơi trơn màng nhầy, cải thiện nhiều vấn đề viêm loét đƣờng tiêu hố, chống táo bón có lợi cho ngƣời mắc bệnh khô mắt, phụ nữ bị khô âm đạo ni dƣỡng giữ ẩm cho màng nhầy Tác dụng omega-9 [10] Omega-9 có tác dụng giảm cholesterol xấu, giảm nguy mắc bệnh tim mạch, giảm xơ cứng động mạch, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch ổn định lƣợng đƣờng máu Sự tiêu thụ PUFAs đƣợc khuyến cáo mức trung bình khoảng 6% tổng lƣợng khơng vƣợt q 10% Trong đó, nên giảm hàm lƣợng axit béo bão hồ nên trì mức 8-10% tổng lƣợng hấp thụ Để giảm nguy bệnh kinh niên hàm lƣợng PUFAs mạch dài (DHA Docosahexaenoic acid, EPA - Eicosapentaenoic acid, DPA) nên d ng 610 mg ngày đàn ông 430 mg ngày phụ nữ Và tỷ lệ omega-6 với omega-3 PUFA nằm 5:1 3:1 tối ƣu cho ngƣời [8] 1.1.3 Các nguồn cung cấp omega-6, 7, Nguồn cung cấp axit béo omega tự nhiên phong phú đa dạng, nhiều nghiên cứu tách chiết axit béo có nguồn gốc động vật, thực vật đặc biệt vi sinh vật đƣợc nhà khoa học quan tâm vài năm trở lại 1.1.3.1 Từ động, thực vật 10 Nguồn cung cấp omega-6 tự nhiên phong phú, chúng đƣợc tìm thấy hầu hết loại dầu thực vật nhƣ: dầu bắp, dầu hạt vải, dầu hạt nho, dầu mè, dầu đậu nành, dầu hoa hƣớng dƣơng, dầu hoa anh thảo, dầu lý chua đen Omega-6 cịn đƣợc tìm thấy loại gia cầm, trứng gà, mỡ, bơ, lúa mì cứng, ngũ cốc nguyên hạt, bánh mỳ đặc biệt từ Tảo xoắn Spirunila platensis [11] Không giống nhƣ omega khác, nguồn cung cấp omega-7 giới thực vật giới động vật Chúng đƣợc cung cấp từ dầu cá (các loài cá nƣớc lạnh nhƣ cá hồi, cá ngừ, cá mòi, cá thu), số loại dầu động vật thực vật nhƣ macadamia (Macadamia integrifolia), chủ yếu hắc mai biển (Hippophae rhamnoides) lƣợng nhỏ bơ Hai axit béo omega-7 thƣờng gặp tự nhiên axit palmitoleic (C16:1(n-7)) axit vaccenic (C18:1(n-7)) đƣợc phát năm 1928 mỡ động vật bơ [12] Nguồn cung cấp omega-9 dầu oliu, dầu macadamia, hồng hoa, dầu hoa hƣớng dƣơng, bơ, hạnh nhân, hạt điều, óc chó, hạt mắc ca, đậu phộng, hồ đào, hồ trăn, hạt cải đinh hƣơng… [10] Dầu thực vật chứa axit béo khơng bão hồ có mạch carbon  18 (C18:1; C18:2; C18:3) chủ yếu mạch thẳng Trong loại dầu thực vật (dầu lanh, canola đậu tƣơng) chứa PUFAs chủ yếu axit -linolenic (ALA) Các loại dầu khác (dầu bắp, dầu hạt vải, dầu nho) chứa chủ yếu PUFAs omega-6 Các loại axit béo có số carbon  20 22 chủ yếu thu đƣợc từ nguồn cá biển Nguồn cung cấp PUFAs loài cá nhiều mỡ nhƣ: cá trích, cá thu, cá sardine, cá hồi, cá basa saba Dầu cá biển thực tế hỗn hợp phức tạp axit béo có chiều dài mạch carbon mức độ bão hoà khác Do vậy, việc tinh chúng khó khăn địi hỏi chi phí tốn trƣớc sử dụng chúng vào mục đích khác nhƣ nâng cao giá trị sử dụng sản phẩm tạo so với giá trị ban đầu [13] 1.1.3.2 Từ vi sinh vật Clean Technologies and Environmental Policy https://doi.org/10.1007/s10098-020-01966-0 ORIGINAL PAPER Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple non‑sulfur bacteria Thị Yến Hoàng1 · Kuan Shiong Khoo2 · Hà Lại Thị Ngọc3 · Quỳnh Trần Thị Thu1,4 · Tuyên Đỗ Thị1 · Hang Đinh Thị Thu4 · Ha Chu Hoàng1 · Sasikala Chinthalapati5 · Chyi‑How Lay6 · Pau Loke Show2  Received: 11 July 2020 / Accepted: August 2020 © Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature 2020 Abstract  The biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was optimized via response surface methodology (RSM), and the optimal medium components such as waste soybean extract, yeast extract, and ­Mg2+ were determined using “one-singlefactor-at-one-time” approach RSM used a three-factor and central composite rotatable design consisting of 21 experimental runs conducted to optimize the final medium components The optimized conditions were as follows: 2.723 g/L waste soybean extract, 3 g/L yeast extract, and 22 mg/L M ­ g2+ Under optimized conditions of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6, the biomass production was 4.665 ± 0.326 g/L, which was 5.7-folds higher than that under non-optimized conditions Besides that, the total lipid production was 5.7 times higher corresponding to the increase in biomass productivity In addition, there was a change in total fatty acid composition with omega and omega which increased from 55.4 to 62.21 and from 3.4 to 9.41, respectively, while omega decreased from 9.79 to 4.54 and omega could not be detected This exploration of waste soybean under optimized conditions would be a significant impact for the higher biomass production from Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 Graphic abstract Extended author information available on the last page of the article 13 Vol.:(0123456789) T. Y. Hoàng et al Keywords  Rhodovulum sulfidophilum · Vaccenic acid · Validated model · Biomass production · Waste soybean extract Introduction Purple non-sulfur bacteria (PNSB) are a physiological group of bacteria distributed among either alpha or beta-proteobacteria that can carry out photosynthesis in the absence of oxygen production (Imhoff 1989) PNSB are the most diverse and most useful group of bacteria for various biotechnological applications like single-cell protein (SCP), bioactive compounds, and wastewater treatment and especially for functional food formation compounds (Sasikala and Ramana 1995) Functional food rich with unsaturated fatty acids (e.g., omega 3, 6, 7, 9) is beneficial to human health It is proven to be proficient of antioxidant, anti-inflammatory, and immune system modulator, and strengthens the cardiovascular system and mucous membrane tissue regenerator (Innes and Calder 2020; Koyande et al 2019) Many studies have positively correlated essential fatty acids with reduction of cardiovascular morbidity and mortality, infant development, cancer prevention, optimal brain and vision functioning, arthritis, hypertension, diabetes mellitus, and neurological/neuropsychiatric disorders (Kaur et al 2014; Kim et al 2013) PNSB are particularly rich in omega fatty acids also known as vaccenic acid (65–82% of total fatty acids) which has a crucial role in maintaining the health of skin and mucous membranes (Djoussé et al 2012) PNSB phototropic has been explored mainly for the production of bioenergy such as hydrogen and polyhydroxybutyrate (PHBT), along with wastewater treatment (Khatipov et al 1998; Kim et al 2006; Wu et al 2012) Previous study by Kim et al (2013) has shown the feasibility for microbial fatty acid production of photosynthetic bacteria, Rhodobacter sphaeroides KD131 cultivated in a continuous-flow, membrane-coupled bioreactor with lactate as carbon source with a cell productivity of 1.9 g dcw/L/d and fatty acid productivity of 665 mg FA/L/d, respectively The fatty acid produced was around 35% dcw and mainly consisted of vaccenic acid (Kim et al 2013) However, a previous study utilizes synthetic cultivation media which is not very economically viable The bacteria biomass production study can be performed via one-factor-at-a-time approach (OFAT) and response surface methodology (RSM) (Irfan et al 2014; Kong et al 2004) OFAT, also known as a single factor experiment, is a classical method in which only one factor is variable at one time while all others are kept constant This approach has several drawbacks: (i) it is time-consuming; (ii) there is an inability to evaluate the interaction between the variables; (iii) it is costly; and (iv) it is less effective than other methods (Khoo et al 2020; Torres-Acosta et al 2019) RSM is a statistical method which uses the data from experiments to 13 build and to solve multi-variable equations This approach overcomes the disadvantages of the OFAT method and has been applied in different kinds of research including microbiological biomass production In this study, we report the omega fatty acid production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 in a culture medium with waste soybean extract as substrate Based on our previous study, waste soybean extract medium was selected to replace over synthetic cultivation medium, which resulted in rapid biomass growth and highest lipid accumulation specifically unsaturated fatty acid (i.e., omega 6, 7, 9) production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 (Hoang et al 2019) In order to utilize Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for high biomass production, extraction of unsaturated fatty acid and other biotechnology applications, this study focused on the selection of suitable medium components via OFAT for the biomass production and the selected medium composition was further optimized using RSM to achieve the highest biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for various biotechnology applications Materials and methods Type of microorganism strain Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 used throughout this study was isolated from the coastal area of Haiphong, Vietnam and identified as Rhodovulum sulfìdophilum by using morphological and physiological properties and 16S rRNA gene sequence analysis (Hoang et al 2019) It was maintained in DSMZ-27 medium at 4 °C and lyophilized and kept at the Key Laboratory of Gene Technology, Biotechnology Institute, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Cultivation media composition The DSMZ-27 medium (pH 7.0) was used for the cultivation of the bacterium DSMZ-27 medium composed the following components per liter of distilled water: 0.3 g yeast extract; 0.5 mL ethanol; 1 g succinate; 0.5 g acetate; 5 mL ferric citrate from 0.1% (w/v) stock; 0.5 g K ­ H2PO4; 0.4 g ­MgSO4·7H2O; 0.05 g C ­ aCl2·2H2O; 0.4 g N ­ H4Cl; 25 g NaCl; trace element solution SL6; and 1 mL vitamin ­B12 solution (filter sterilized) Trace element solution SL6 contains (­ l−1) 1.8 g ­FeCl2·4H2O; 0.25 g ­CoCl2·6H2O; 0.01 g NiCl·6H2O; 0.01 g ­CuCl2·5H2O, 0.07 g ­MnCl2·4H2O; 0.1 g ­ZnCl2; 0.5 g ­H3BO3; 0.01 g N ­ a2SiO3·5H2O; 0.03 g N ­ a2MoO4·2H2O Vitamin ­B12 solution was added after autoclaving stock solution Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple… and was used as Basal medium The stock solution was prepared by putting 10 g of waste soybean to cloth and tightly sealed, then the stock solution is put into 100 mL distilled water, sterilized at 121 °C for 30 min Primary experiments: selection of medium components for biomass production The bacterium was cultivated in soybean extract concentration ranging from to 5 g/L and added 25 g/L NaCl to evaluate the effect of stock solution concentration on the growth of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 The optimal concentration stock solution was added with carbon and nitrogen sources separately such as malic acid, acetate, yeast extract, and glutamate (2 g/L) to assess the effect of different carbon and nitrogen sources The yeast extract concentration (range from to 5 g/L) and M ­ g2+ (8–22 mg/L) were examined by using OFAT to obtain the highest biomass production For each experiment, the culture was grown in a 13-mL penicillin tube composed of 10 mL of stock solution medium, along with the indicated sources and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L (Hoang et al 2019) Bacterium and culture medium were mixed uniformly by a shaker Response surface methodology procedure for biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 Response surface methodology (RSM) was performed using a three-factor and central composite rotatable design (CCRD) consisting of 21 experimental runs with (­ 23) factorial points, (2 × 3) axial points (i.e., two axial points on the axis of each design variable at a distance of 1.68 from the design center, ­(23)1/3), and replicates at the center points, maximal and minimal factorial points The design variables were the waste soybean extract concentration (g/L; ­X1), the yeast extract concentration (g/L; ­X2), and the ­Mg2+ concentration (mg/L; ­X3) Each variable was coded at five levels − 1.68, − 1, 0, 1, and 1.68 The conversion of real values (Xi) to coded values (xi) was done by using the following equation xi = (Xi – X0)/ΔXi, where X0 is the real value of the independent variable i at the center point and ΔXi is the step change of Xi corresponding to a unit of variation In the present study, X0 and ΔXi were determined in the section of primary experiments The experimental data were fitted to the following second-order polynomial model: Y = 𝛽0 + ∑ i=1 𝛽i Xi + ∑ i=1 𝛽ii Xi2 + ∑ ∑ 𝛽ij Xi Xj i=1 j=2 where Y is the response or dependant variable (∆OD800 of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 culture), β0, βi, βii, and βij are the regression coefficients for the intercept, linear, quadratic, and interactions terms, respectively, and Xi and Xj are the real values of variables For all runs, the biomass production was performed in a 13-mL penicillin tube containing 10 mL of medium and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L Bacterium and medium were mixed uniformly by a shaker After 4 days of anaerobic incubation at a temperature within 30–32 °C and light intensity of 4 lux (tungsten light bulbs), biomass production was estimated either by cell density at ∆OD800 or dried biomass (dcw) The optimal conditions for biomass production (∆OD800) were determined using the JMP 10 software The software was set to have the maximized desirability which was the highest biomass quantity Four experimental replicates were performed at the optimized conditions The experimental and predicted values were compared in order to validate the model Determination of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 biomass productivity The productivity of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was determined by measuring the cell density at ­OD800 using UV–Vis spectrophotometer and by dry biomass quantity (g/L) (Cai et al 2012; Li et al 1995) Dry biomass (g/L) was determined as follows: after 4 days of incubation, Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 cells were harvested by the centrifugation method at 8000 rpm for 15 min at 4 °C The pellet was re-suspended in 10 mL distilled water and centrifuged again for washing The washed cells were then lyophilized until a constant weight is obtained The dry biomass was used to extract lipids and subjected to further analysis of fatty acid composition Determination of total lipid extraction Lipid extraction was performed using the modified methodology of Bligh and Dyer (1959) 100 g of dry biomass was mixed with 300 mL mixture of dichloromethane and methanol (2:1, v/v) was carried out for 2 h integrated with ultrasonication for cell membrane disruption A further dilution was made with 100 mL of dichloromethane and 100 mL of water After the separation of the two layers, the upper aqueous layer containing methanol, water, and non-lipid compounds was discarded and the lower dichloromethane layer was filtered using a filter paper containing anhydrous sodium sulfate and collected in pre-weighed glass vials This procedure was repeated for the extraction of lipids remaining in the sample Both the organic phases containing the lipid extract was vacuum dried to remove the excess solvent until a constant weight was attained 13 Fatty acid analysis Fatty acid analysis of non-optimized biomass was conducted at Royal Research Laboratories, Secunderabad, India Biomass was methylated, separated, and identified according to the instructions for the Microbial Identification System (Sasser 1990) (Microbial ID; MIDI; version 3 V 6.0-2007; RTSBA6 database; 6850 series II gas chromatograph, Olympus) Fatty acid analysis of the optimized biomass was determined by gas chromatography (GC) and a subsequent ISO draft standard method in Laboratory of Biochemistry, Institute of Natural Products Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology [Animal and Vegetable Fats and Oils—Preparation of Methyl Esters of Fatty Acids; Standard No 5509; ISO: Geneva, Switzerland, 1988] Approximately 10 mg of oil was dissolved in 1 mL of petroleum ether, followed by the addition of 25 µL of 2 M sodium methanolate methanol solution and the mixture was agitated vigorously for 1 min About 20 µL of water was added, and after centrifugation the aqueous phase was removed Then, 20 µL of methyl orange in 0.1 N HCl was added as a pH indicator The mixture was agitated carefully, and different derivatives were analyzed by a Hewlett–Packard Gas Chromatography Instrument Model 5890 Series II/5989 A80 equipped with a 0.25 mm ZB-1 fused-silica capillary column (30mì0.25àm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA) The carrier gas is composed with helium at a flow rate of 1.0 mL/min Statistical analysis The experimental results were analyzed using the SAS 9.1 software (SAS Institute, Cary, NC) In the primary experiments, the selection of suitable medium components was optimized using one-factor-at-a-time (OFAT) and the results Fig. 1  Effect of waste soybean extract concentration on the growth of HPB.6 13 T. Y. Hoàng et al were expressed as mean ± standard deviation One-way analysis of variance (ANOVA) and Duncan’s multiple range test were used to determine the differences among the means P-values (