Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu quả thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo đại học nông lâm thành phố hồ chí minh

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu quả thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo đại học nông lâm thành phố hồ chí minh Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu quả thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo đại học nông lâm thành phố hồ chí minh Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu quả thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo đại học nông lâm thành phố hồ chí minh

Đồn Thị Phương Thùy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 3-10 93 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hiệu thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris Linn Link) Study on the effects of extraction conditions on the extraction efficiency of cordycepin from Cordycep militaris Linn Link Đoàn Thị Phương Thùy1*, Trần Thị Ngọc Ánh1, Nguyễn Thị Mai 1 Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ, Email: thuydoan@hcmuaf.edu.vn THÔNG TIN DOI:10.46223/HCMCOUJS tech.vi.13.1.795.2018 Ngày nhận: 15/05/2018 Ngày nhận lại: 07/06/2018 Duyệt đăng: 10/07/2018 Từ khóa: Cordyceps militaris, Cordycepin, thể, tách chiết TÓM TẮT Nhộng Trùng Thảo (Cordyceps militaris Linn Link) nấm có nhiều hoạt chất có giá trị dược liệu cao Trong số đó, cordycepin thành phần quan trọng định chất lượng giá trị dược học Nhộng Trùng Thảo (NTT) Trong nghiên cứu này, thực thí nghiệm để tìm hiểu ảnh hưởng yếu tố loại dung môi, tỉ lệ dung mơi, thời gian ủ có đánh sóng siêu âm, độ pH dung môi, nhiệt độ ủ đến hiệu suất tách chiết hoạt chất cordycepin lượt tách chiết cordycepin từ thể nấm NTT Kết thí nghiệm cho thấy, tách chiết hoạt chất cordycepin từ thể nấm NTT đạt hiệu cao dung môi ethanol: nước, 2:1 (v/v); pH 7; ủ nhiệt độ 55C có kết hợp đánh sóng siêu âm lần, lần phút; vortex phút nghỉ phút hai lần đánh sóng ABSTRACT Keywords: Cordyceps militaris, Cordycepin, extraction, fruiting bodies Cordyceps militaris Linn Link is a fungus with high content of bioactive substances Cordycepin is an important ingredient that determines the medicinal quality of Cordyceps sp In this report, we studied the effects of solvents (type of solvents and solvent: water ratio), temperature, pH, incubation time with ultrasonication and number of extraction round on the extraction effiency of cordycepin from Cordyceps militaris fruiting bodies Our results showed that, highest extraction efficiency achieved when using ethanol: water, 2:1 (v/v) as the extraction solvent; pH of the solvent should be at 7; the optimal incubation temperature was at 55C Furthermore, the samples should be ultrasonicated for minutes with pulses of minutes, vortex for and mins rest between pulses 94 Đồn Thị Phương Thùy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 3-10 Mở đầu Nhộng Trùng Thảo (NTT) (Cordyceps militaris) thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota), nhóm Nấm dược liệu có giá trị kinh tế cao sử dụng hàng ngàn năm qua y học cổ truyền nhiều nước châu Á Những năm gần đây, khoa học đại công bố nhiều nghiên cứu thành phần dược chất NTT giá trị dược học chế tác động chất mức độ phân tử, tế bào lâm sàng (Paterson & Russell, 2008; Tuli, Sharma, Sandhu, & Kashyap, 2013) Trong thành phần dược chất NTT, cordycepin (Hình 1) dược chất quan trọng định giá trị dược học NTT, hàm lượng cordycepin tiêu tiên để đánh giá chất lượng NTT (Das Shonkor, Masuda, Sakurai, & Sakakibara, 2010; Duong & Le, 2015; Yoo et al., 2004) Hình Cấu trúc hóa học phân tử cordycepin Trong phần lớn nghiên cứu, cordycepin tách chiết dung môi ethanol: nước, 1:1 (v/v); nước nóng (Duong & Le, 2015; Zhang, Wang, Dong, Xu, & Wang, 2011); methanol 100%; methanol: nước, 1:1 (v/v) (Huang, Li, Chen, Wang, & Zhou, 2009; Reis et al., 2013) với hỗ trợ yếu tố nhiệt độ, thời gian tách chiết quy trình Tuy nhiên chưa có báo cáo phân tích, so sánh ảnh hưởng, vai trị yếu tố tách chiết đến hiệu tách chiết cordycepin Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực thí nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng dung mơi thường sử dụng chiết xuất hợp chất hữu có dược tính ethanol, methanol, isopropanol n-butanol điều kiện có kết hợp khơng kết hợp với nước đến hiệu suất tách chiết cordycepin Đồng thời thí nghiệm ảnh hưởng thời gian ủ có đánh sóng siêu âm, độ pH, nhiệt độ ủ dung môi hiệu suất tách chiết hoạt chất cordycepin lượt tách chiết thực đánh giá Vật liệu phương pháp 2.1 Ảnh hưởng loại dung môi đến hiệu tách chiết cordycepin Trong thí nghiệm này, hiệu tách chiết cordycepin dung mơi tách chiết có độ phân cực khác đánh giá Các dung môi sử dụng gồm nước, ethanol, methanol, isopropanol n-butanol Để thực thí nghiệm, 100mg bột thể (Cordyceps militaris giống NBRC 9787, Nhật Bản nuôi cấy AP Biotech, Việt Nam) ly trích 3ml dung mơi Các mẫu ly trích ủ phút dung mơi nhiệt độ phịng, sau thực đánh sóng siêu Đồn Thị Phương Thùy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 3-10 95 âm bể rửa siêu âm (Elma S10H, Đức) lần lần phút, mẫu vortex phút nghỉ phút lần đánh sóng Mẫu ly trích sau vortex phút ly tâm 3500g 10 phút để thu nhận dịch cho phân tích đánh giá hàm lượng cordycepin phương pháp Digital Enhanced - Thin Layer Chromatography (DE-TLC) (Abou-Donia, Darwish, Toaima, Shawky, & Takla, 2014; Johnsson, Träff, Sundén, & Ellervik, 2007) 2.2 Ảnh hưởng thời gian đánh sóng siêu âm đến hiệu tách chiết cordycepin 100mg bột sinh khối thể nấm ủ phút 3ml dung môi ethanol: nước, 2:1 (v/v) Hiệu tách chiết cordycepin khảo sát thời gian đánh sóng siêu âm 0, 1, 3, phút Để tránh làm ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử cordycepin, nghiệm thức đánh sóng phút, việc đánh sóng thực theo nhiều đợt, đợt phút, mẫu vortex phút nghỉ phút lần đánh sóng Mẫu ly trích sau vortex phút ly tâm 3500g 10 phút để thu nhận dịch cho phân tích đánh giá hàm lượng cordycepin phương pháp DE-TLC (Abou-Donia et al., 2014; Johnsson et al., 2007) 2.3 Ảnh hưởng pH dung môi đến hiệu tách chiết cordycepin 100mg bột sinh khối thể nấm ủ phút nhiệt độ phòng 3ml dung mơi ethanol: nước, 2:1 (v/v) có pH 3, 5, 7, 10 (pH dung môi tách chiết điều chỉnh 1N HCl 1N NaOH) Sau đó, mẫu ly trích đặt bể rửa siêu âm thực đánh sóng lần lần phút, vortex phút nghỉ phút lần đánh sóng Mẫu ly trích sau vortex phút ly tâm 3500g 10 phút để thu nhận dịch cho phân tích đánh giá hàm lượng cordycepin phương pháp DE-TLC (Abou-Donia et al., 2014; Johnsson et al., 2007) 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ly trích đến hiệu tách chiết cordycepin 100mg bột sinh khối thể nấm ủ phút 3ml dung mơi ly trích ethanol: nước, 2:1 (v/v) Sau đó, mẫu ly trích đặt bể rửa siêu âm nhiệt độ 35, 45, 55, 65C thực đánh sóng lần lần phút, vortex phút nghỉ phút lần đánh sóng Mẫu ly trích sau vortex phút ly tâm 3500g 10 phút để thu nhận dịch cho phân tích đánh giá hàm lượng cordycepin phương pháp DE-TLC (Abou-Donia et al., 2014; Johnsson et al., 2007) 2.5 Ảnh hưởng số lượt ly trích đến hiệu tách chiết cordycepin 100mg bột sinh khối thể nấm ủ phút 3ml dung môi ethanol: nước, 2:1 (v/v) Sau đó, mẫu ly trích đặt bể rửa siêu âm thực đánh sóng lần lần phút nghỉ phút lần đánh sóng 96 Đồn Thị Phương Thùy cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 3-10 Mẫu ly trích sau vortex phút ly tâm 3500g 10 phút để thu nhận dịch cho phân tích đánh giá hàm lượng cordycepin phương pháp DE-TLC (Abou-Donia et al., 2014; Johnsson et al., 2007) Mẫu ly trích lặp lại với quy trình, lượng cordycepin thu nhận từ lượt ly trích ghi nhận Hiệu thu nhận cordycepin tính dựa tỉ lệ lượng cordycepin thu nhận lượt tổng lượng cordycepin thu nhận qua lượt ly trích 2.6 Phân tích hàm lượng cordycepin phương pháp DE-TLC Cordycepin thu nhận từ mẫu ly trích phân tách sắc ký lớp mỏng (TLC) Trong đó, 20l dịch trích chấm sắc ký TLC Silica 60 F254 (Merck, Đức), phân tách dung môi chloroform: methanol: nước, 65:15:1 (v/v/v) Một l cordycepin chuẩn (Sigma-Alrich) có nồng độ 0.01mg/l chấm sắc ký, lượng cordycepin chuẩn ngồi vai trị giúp xác định vị trí cordycepin sắc ký chất chuẩn (external standard) cho việc định lượng cordycepin nghiệm thức thí nghiệm Vị trí mẫu sắc ký xác định đèn UV có bước sóng 254nm buồng tối Hình ảnh mẫu sắc ký ghi nhận máy ảnh Sony Cybershot 7.2 mega pixels Khoảng cách máy ảnh sắc ký giữ cố định 20cm, máy ảnh cài đặt để tất ảnh chụp tiêu cự Sự khác biệt hàm lượng cordycepin thu nhận từ thí nghiệm phân tích so sánh phần mềm JustTLC (Sweday) dựa thông số mật độ màu diện tích vùng mẫu hình ảnh sắc ký (AbouDonia et al., 2014; Johnsson et al., 2007) 2.7 Phân tích thống kê Tất nghiệm thức thí nghiệm lặp lại ba lần Kết phân tích thống kê phép thử Duncan nhờ chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên 16.0 cho Windows Các số trung bình cột với ký tự khác kèm theo khác biệt có ý nghĩa mức P