Thông tin tài liệu
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc gen A20 protein A20 Hình 1.2 Vai trò protein A20 tế bào miễn dịch Hình 1.3 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB đường tín hiệu TNFR1 10 Hình 1.4 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB đường hiệu IL1R/TLR4 11 Hình 1.5 Tế bào tua chuột phân lập từ lách 17 Hình 1.6 Vịng đời tế bào tua 18 Hình 1.7 Tế bào tua chức điều hịa miễn dịch 20 Hình 1.8 Sự biệt hóa đa dạng tế bào tua 23 Hình 1.9 TLR điều hoà hoạt động hệ thống miễn dịch 29 Hình 2.1 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ - tế bào tua biệt hóa FLT3 phơi nhiễm với profilin 38 Hình 2.2 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ hai - tế bào tua biệt hóa GM-CSF phơi nhiễm với LPS 39 Hình 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 46 Hình 3.1 Kết biểu protein A20 sau đưa A20-siRNA vào tế bào tua 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào CD8+DC phơi nhiễm profilin 53 Hình 3.3 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành CD11bDC phơi nhiễm profilin 55 Hình 3.4 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào pDC phơi nhiễm profilin 57 Hình 3.5 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD8+DC phơi nhiễm profilin 60 Hình 3.6 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD11bDC phơi nhiễm profilin 61 Hình 3.7 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào pDC phơi nhiễm profilin 64 Hình 3.8 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD11b+DC phơi nhiễm với LPS 66 Hình 3.9 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm tế bào tua biệt hố FLT3 phơi nhiễm profilin 68 Hình 3.10 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm tế bào CD11b+DC biệt hoá GM-CSF phơi nhiễm LPS 70 Hình 3.11 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis thông qua số lượng tế bào CD11b+DC dương tính với marker Annexin V âm tính với 7-AAD 73 Hình 3.12 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis thông qua tỷ lệ tế bào CD11b+DC dương tính với marker Caspase-3 75 Hình 3.13 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm profilin 77 Hình 3.14 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào pDC phơi nhiễm profilin 79 Hình 3.15 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm LPS 82 Hình 3.16 Ảnh hưởng protein A20 lên biểu marker trưởng thành tế bào pDC thông qua đường tín hiệu IκB-α STAT1 84 Hình 3.17 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 87 Hình 3.18 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 89 Hình 3.19 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD11b+DC thông qua đường tín hiệu STAT1 91 Hình 3.20 Ảnh hưởng protein A20 di chuyển tế bào CD11bDC thơng qua đường tín hiệu STAT1 92 Hình 4.1 Hình dot blot tế bào tua nhuộm kháng thể FITC-Annexin V PE-CD11c 124 Hình 4.2 Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang 125 Hình 4.3 Hình dot blot TBT nhuộm kháng thể FITC-CD11c PE-CD86/ MHC II/ CD40 126 Hình 4.4 Nồng độ TNF-α dịch huyền phù CD11bDC xác định ELISA 128 Hình 4.5 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ 130 Hình 4.6 Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ 131 Hình 4.7 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 132 Hình 4.8 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 133 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Protein A20 1.1.1 Khái niệm lịch sử nghiên cứu protein A20 1.1.2 Cấu trúc gen A20 protein A20 1.1.3 Vai trò protein A20 điều hòa số loại tế bào miễn dịch 1.1.2.1 Vai trò protein A20 tế bào T 1.1.2.2 Vai trò protein A20 tế bào B 1.1.2.3 Vai trò protein A20 tế bào tua 1.1.4 Vai trò protein A20 chết theo chương trình apoptosis 1.1.5 Cơ chế điều hoà hoạt động protein A20 1.1.6 Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hồ A20 1.1.6.1 Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB 1.1.6.2 Protein A20 điều hồ tín hiệu STATs 11 1.1.7 Vai trò protein A20 số bệnh tự miễn ung thư 13 1.1.8 Tình hình nghiên cứu protein A20 giới Việt Nam 14 1.2 Tế bào tua 16 1.2.1 Khái niệm lịch sử phát tế bào tua 16 1.2.2 Đặc điểm sinh học tế bào tua 16 1.2.3 Chức tế bào tua 19 1.2.4 Phân loại tế bào tua 20 1.2.5 Các trình sinh lý tế bào tua 22 1.2.5.1 Sự biệt hoá tế bào tua 22 1.2.5.2 Sự trưởng thành tế bào tua 23 1.2.5.3 Sự di cư tế bào tua 24 1.2.5.4 Sự thực bào tế bào tua 25 1.2.5.5 Sự tiết cytokine tế bào tua 26 1.2.5.6 Sự chết theo chương trình tế bào tua 26 1.2.6 Một số thụ thể Toll - like receptors kích hoạt hoạt động tế bào tua 29 Kháng nguyên Lipopolysaccharide 30 Kháng nguyên Profilin từ Toxoplasma gondii 30 1.2.7 Một số nghiên cứu ứng dụng tế bào tua điều trị ung thư 31 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Vật liệu nguyên liệu 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Các hoá chất 34 2.2 Thiết bị nghiên cứu 35 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu 40 2.4.1 Phương pháp ni cấy biệt hố tế bào tua 40 2.4.2 Phương pháp đưa phân tử siRNA vào tế bào tua 41 2.4.3 Kỹ thuật Western blot đo mức độ biểu protein 41 2.4.4 Kỹ thuật ELISA đo nồng độ cytokine tiết tế bào tua 44 2.4.5 Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry analysis) 47 2.4.6 Phương pháp xác định di cư tế bào (transwell migration assay) 48 2.4.7 Phương pháp phân tích số liệu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 50 3.1 Vai trị protein A20 điều hồ chức sinh lý tế bào tua 50 3.1.1 Kết bất hoạt gen A20 tế bào tua 50 3.1.2 Vai trò protein A20 điều hòa trưởng thành tế bào tua 51 3.1.3 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào tua 59 3.1.3.1 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào tua biệt hóa tế bào tua FLT3 59 3.1.3.2 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào tua biệt hóa tế bào tua GM-CSF 65 3.1.4 Vai trò protein A20 di cư tế bào tua 67 3.1.4.1 Vai trò protein A20 di cư tế bào tua biệt hóa tế bào tua FLT3 67 3.1.4.2 Vai trò protein A20 di cư tế bào tua phơi niễm với GM-CSF phơi nhiễm LPS 69 3.1.5 Vai trị protein A20 đối q trình apoptosis tế bào tua 70 3.2 Nghiên cứu số tín hiệu phân tử liên quan đến trình sinh lý tế bào tua vai trị điều hòa protein A20 76 3.2.1 Protein A20 điều hòa phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào tua nhóm CD11b+DC phơi nhiễm với profilin 77 3.2.2 Protein A20 điều hịa phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào tua pDC phơi nhiễm với profilin 79 3.2.3 Protein A20 điều hịa phosphoryl hóa STAT1 STAT3 tế bào tua nhóm CD11b+DC xử lý với LPS 81 3.2.4 Vai trò protein A20 số chức sinh lý tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 83 3.2.4.1 Vai trò protein A20 trưởng thành tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 84 Bảng 3.12 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 phơi nhiễm profilin 84 3.2.4.2 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 86 3.2.4.3.Vai trò protein A20 di chuyển tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 89 3.2.5 Vai trò protein A20 chức tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 90 3.2.5.1 Vai trò protein A20 trình sản xuất cytokine tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 90 3.2.5.2 Vai trò protein A20 điều hoà di chuyển tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 92 BÀN LUẬN 94 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 PHỤ LỤC 125 Phụ lục 1: Kết nuôi cấy tế bào tua 125 Phụ lục 1.1 Khả sống sót biệt hóa tế bào tua sau ni cấy 125 Phụ lục 1.2 Hình ảnh tế bào tua sau nuôi cấy 125 Phụ lục 1.3 Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm Lipopolysaccharide 127 Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α tế bào tua 129 Phụ lục 3: Ảnh hưởng số cytokine trình apoptosis tế bào CD11b+DC 131 Phụ lục 3.1 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ 131 Phụ lục 3.2 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ 132 Phụ lục 4: Vai trò điều hòa IL-10 phosphoryl hóa STAT1 STAT3 tế bào tua 133 Phụ lục 4.1 Vai trò điều hồ IL-10 phosphoryl hố STAT1 133 Phụ lục 4.2 Vai trị điều hồ IL-10 phosphoryl hoá STAT3 134 MỞ ĐẦU Protein A20 protein kích thích yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor α-induced protein - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm điều hòa ngược hoạt động sinh lý tế bào miễn dịch, thơng qua việc ngăn chặn phosphoryl hóa số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB tín hiệu STAT (signal transducer and activator of transcription) Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột biến gen A20 làm thay đổi chức sinh học protein A20 nguyên nhân gây loại bệnh lý bệnh tự miễn, viêm nhiễm ung thư Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu tình trạng suy nhược, mắc bệnh tự miễn, viêm toàn quan, phận thể khơng sống sót q tuần tuổi Ở người, bất hoạt gen A20 ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn ung thư loại bệnh ung thư máu Tuy nhiên ảnh hưởng protein A20 đến chế bệnh sinh bệnh chưa tìm hiểu đầy đủ Tế bào tua (TBT) tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho tế bào lympho, có vai trị quan trọng hệ thống miễn dịch Chỉ có TBT có khả kích thích hình thành phản ứng miễn dịch tế bào lympho T trạng thái khơng hoạt động TBT đóng góp vào chức tế bào lympho B giúp trì trí nhớ miễn dịch tế bào TBT sản xuất cytokine yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B Các tế bào tua có mặt hầu hết quan lympho lách hạch bạch huyết, biểu mơ da, ống tiêu hóa ống hơ hấp, chúng dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh TBT chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dịng lympho có nguồn gốc từ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC phân chia thành hai tập hợp CD8+DC CD11b+DC có mức độ biểu loại thụ thể tolllike (toll-like receptor - TLR) khác nhau, đóng vai trị khác khả tương tác với mầm bệnh Một số nghiên cứu trước tế bào tua protein A20 có khả ức chế khả sản xuất số cytokine Tuy nhiên đến nay, chưa có cơng bố khoa học vai trò, chế phân tử gen A20 điều hòa chức sinh lý TBT phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh trùng ảnh hưởng protein A20 đến hoạt động apoptosis TBT bị kích thích số cytokine Do đó, thí nghiệm tiến hành để nghiên cứu vai trị điều hồ protein A20 TBT kích hoạt số kháng nguyên profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) số cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trị điều hồ gen mã hoá protein A20 chế phân tử tham gia kiểm sốt q trình sinh lý tế bào tua” Luận án thực với mục tiêu sau: Đánh giá vai trò gen A20 việc điều hoà bốn chức sinh lý gồm trưởng thành, tiết cytokine, di cư trình apoptosis tế bào tua Đánh giá ảnh hưởng gen A20 việc điều hịa ba tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 STAT3 liên quan đến trình sinh lý tế bào tua CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Protein A20 1.1.1 Khái niệm lịch sử nghiên cứu protein A20 Protein A20 (hay gọi TNFAIP3 - tumor necrosis factor alphainduced protein - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) protein ức chế phản ứng viêm chống lại tác nhân gây viêm Protein A20 có chiều dài 790 axit amin khối lượng phân tử 89,6 kDa Protein đóng vai trị chất điều hoà phản ứng miễn dịch trung gian thơng qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB) [1] Các nghiên cứu ban đầu cho thấy, A20 protein bảo vệ tế bào khỏi trình apoptosis TNF gây Đến nay, A20 công nhận rộng rãi protein kháng viêm, khơng chất ức chế đường tín hiệu NF-κB phụ thuộc TNF, mà cịn ức chế kích hoạt NF-κB để đáp ứng với Interleukin (IL-1), CD40 tín hiệu thơng qua thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors - PRRs) kích hoạt thụ thể kháng nguyên tế bào T tế bào B [2] Nghiên cứu in vivo vai trò protein A20 sinh lý mơ nghiên cứu mơ hình chuột thiếu hụt A20 [3] Chuột bị bất hoạt gen A20 biểu mẫn cảm với TNF, chết sớm viêm đa quan nghiêm trọng suy nhược thể tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn bội nhiễm [4] Ngoài ra, protein A20 chứng minh có vai trị điều hịa dịng tín hiệu tế bào khác, đường tín hiệu Wnt, đường điều hòa interferon (interferon regulatory factor - IRF) phản ứng tự miễn [5-7] 1.1.2 Cấu trúc gen A20 protein A20 Protein A20 mã hóa gen A20, gen đặt tên theo số cDNA, xác định gen cảm ứng với TNF tế bào nội mô [8] Gen A20 nằm vị trí 6q23.3 vai dài nhiễm sắc thể số (forward strand) (Hình 1.1.A) Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm exon intron (Hình 1.1.B) Trong đó, exon 1, đầu 5’ exon đầu 3’ exon không mã hoá protein Độ dài 121 92 L Yin, Z Fang, N J Shen, Y H Qiu, A J Li, and Y J Zhang, Downregulation of A20 increases the cytotoxicity of IFN-gamma in hepatocellular carcinoma cells, Drug Des Devel Ther, 2017, 11, 2841-2850 93 D D Bannerman and S E Goldblum, Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2003, 284 (6), L899-914 94 J Xaus, M Comalada, A F Valledor, J Lloberas, F Lopez-Soriano, J M Argiles, C Bogdan, and A Celada, LPS induces apoptosis in macrophages mostly through the autocrine production of TNF-alpha, Blood, 2000, 95 (12), 3823-3831 95 N T Xuan, E Shumilina, E Gulbins, S Gu, F Gotz, and F Lang, Triggering of dendritic cell apoptosis by xanthohumol, Mol Nutr Food Res, 2010, 54 Suppl 2, S214-224 96 K McArthur and B T Kile, Apoptotic Caspases: Multiple or Mistaken Identities?, Trends Cell Biol, 2018, 28 (6), 475-493 97 N T Xuan, P T Trang, N Van Phong, N L Toan, D M Trung, N D Bac, V L Nguyen, N H Hoang, and N Van Hai, Klotho sensitive regulation of dendritic cell functions by vitamin E, Biol Res, 2016, 49 (1), 45, PMID: 27881156 98 H J de Heer, H Hammad, T Soullie, D Hijdra, N Vos, M A Willart, H C Hoogsteden, and B N Lambrecht, Essential role of lung plasmacytoid dendritic cells in preventing asthmatic reactions to harmless inhaled antigen, J Exp Med, 2004, 200 (1), 89-98 99 Y Wang, D R McGivern, L Cheng, G Li, S M Lemon, J Niu, L Su, and N J Reszka-Blanco, Ribavirin Contributes to Hepatitis C Virus Suppression by Augmenting pDC Activation and Type IFN Production, PLoS One, 2015, 10 (8), e0135232 100 D N Hart, Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response, Blood, 1997, 90 (9), 3245-3287 101 M Kool, G van Loo, W Waelput, S De Prijck, F Muskens, M Sze, J van Praet, F Branco-Madeira, S Janssens, B Reizis, D Elewaut, R Beyaert, H Hammad, and B N Lambrecht, The ubiquitin-editing protein A20 prevents 122 dendritic cell activation, recognition of apoptotic cells, and systemic autoimmunity, Immunity, 2011, 35 (1), 82-96 102 R M Salazar Gonzalez, H Shehata, M J O'Connell, Y Yang, M E Moreno-Fernandez, C A Chougnet, and J Aliberti, Toxoplasma gondiiderived profilin triggers human toll-like receptor 5-dependent cytokine production, J Innate Immun, 2014, (5), 685-694 103 A G Schneider, D S Abi Abdallah, B A Butcher, and E Y Denkers, Toxoplasma gondii triggers phosphorylation and nuclear translocation of dendritic cell STAT1 while simultaneously blocking IFNgamma-induced STAT1 transcriptional activity, PLoS One, 2013, (3), e60215 104 N Matzner, I M Zemtsova, T X Nguyen, M Duszenko, E Shumilina, and F Lang, Ion channels modulating mouse dendritic cell functions, J Immunol, 2008, 181 (10), 6803-6809 105 J Simpson, K Miles, M Trub, R MacMahon, and M Gray, Plasmacytoid Dendritic Cells Respond Directly to Apoptotic Cells by Secreting Immune Regulatory IL-10 or IFN-alpha, Front Immunol, 2016, 7, 590, PMID: 28018356 106 Z Q Wang, A S Bapat, R J Rayanade, A S Dagtas, and M K Hoffmann, Interleukin-10 induces macrophage apoptosis and expression of CD16 (FcgammaRIII) whose engagement blocks the cell death programme and facilitates differentiation, Immunology, 2001, 102 (3), 331-337 107 G Migliorati, I Nicoletti, M C Pagliacci, L D'Adamio, and C Riccardi, Interleukin-2 induces apoptosis in mouse thymocytes, Cell Immunol, 1993, 146 (1), 52-61 108 K Matsuoka, J Koreth, H T Kim, G Bascug, S McDonough, Y Kawano, K Murase, C Cutler, V T Ho, E P Alyea, P Armand, B R Blazar, J H Antin, R J Soiffer, and J Ritz, Low-dose interleukin-2 therapy restores regulatory T cell homeostasis in patients with chronic graft-versus-host disease, Sci Transl Med, 2013, (179), 179ra143 109 A D Guerrero, M B Dong, Y Zhao, A Lau-Kilby, and K V Tarbell, Interleukin-2-mediated inhibition of dendritic cell development correlates 123 with decreased CD135 expression and increased monocyte/macrophage precursors, Immunology, 2014, 143 (4), 640-650 110 A Cerezo, A C Martinez, A Gonzalez, J Gomez, and A Rebollo, IL-2 deprivation triggers apoptosis which is mediated by c-Jun N-terminal kinase activation and prevented by Bcl-2, Cell Death Differ, 1999, (1), 87-94 111 S Zhao, J Feng, Q Wang, L Tian, Y Zhang, and H Li, hnRNP K plays a protective role in TNF-alpha-induced apoptosis in podocytes, Biosci Rep, 2018, 38 (3), PMID: 29724888 112 Y Chen, Z Zou, Z Wu, Z Zhao, X Luo, C Xie, and Y Liang, TNF-alphainduced programmed cell death in the pathogenesis of acquired aplastic anemia, Expert Rev Hematol, 2015, (4), 515-526 113 L Zheng, W Wang, J Ni, X Mao, D Song, T Liu, J Wei, and H Zhou, Role of autophagy in tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis of osteoblast cells, J Investig Med, 2017, 65 (6), 1014-1020 114 G Kak, M Raza, and B K Tiwari, Interferon-gamma (IFN-gamma): Exploring its implications in infectious diseases, Biomol Concepts, 2018, (1), 64-79 115 J Li, Y Zhang, L Chen, X Lu, Z Li, Y Xue, and Y Q Guan, Cervical Cancer HeLa Cell Autocrine Apoptosis Induced by Coimmobilized IFNgamma plus TNF-alpha Biomaterials, ACS Appl Mater Interfaces, 2018, 10 (10), 8451-8464 116 H L Xia, C J Li, X F Hou, H Zhang, Z H Wu, and J Wang, Interferongamma affects leukemia cell apoptosis through regulating Fas/FasL signaling pathway, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21 (9), 2244-2248 117 V Calo, M Migliavacca, V Bazan, M Macaluso, M Buscemi, N Gebbia, and A Russo, STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis, J Cell Physiol, 2003, 197 (2), 157-168 118 C L Manthey, S W Wang, S D Kinney, and Z Yao, SB202190, a selective inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase, is a powerful regulator of LPS-induced mRNAs in monocytes, J Leukoc Biol, 1998, 64 (3), 409-417 124 119 J C Fischer, V Otten, M Kober, C Drees, M Rosenbaum, M Schmickl, S Heidegger, R Beyaert, G van Loo, X C Li, C Peschel, M SchmidtSupprian, T Haas, S Spoerl, and H Poeck, A20 Restrains Thymic Regulatory T Cell Development, J Immunol, 2017, 199 (7), 2356-2365 120 A Polykratis, A Martens, R O Eren, Y Shirasaki, M Yamagishi, Y Yamaguchi, S Uemura, M Miura, B Holzmann, G Kollias, M Armaka, G van Loo, and M Pasparakis, A20 prevents inflammasome-dependent arthritis by inhibiting macrophage necroptosis through its ZnF7 ubiquitin-binding domain, Nat Cell Biol, 2019, 21 (6), 731-742 121 J H Yen, W Kong, and D Ganea, IFN-beta inhibits dendritic cell migration through STAT-1-mediated transcriptional suppression of CCR7 and matrix metalloproteinase 9, J Immunol, 2010, 184 (7), 3478-3486 122 R Forster, A C Davalos-Misslitz, and A Rot, CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance, Nat Rev Immunol, 2008, (5), 362-371 123 H Jaeschke and B L Woolbright, Role of heme oxygenase in TNF/TNF receptor-mediated apoptosis after hepatic ischemia/reperfusion in rats Shock 39: 380-388, 2013, Shock, 2013, 40 (1), 75-76 125 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết nuôi cấy tế bào tua Phụ lục 1.1 Khả sống sót biệt hóa tế bào tua sau ni cấy Các tế bào tua có nguồn gốc từ tế bào tủy xương chuột BALB/c, chuột cung cấp công ty Taconic Farms (Hudson, Mỹ), nuôi điều kiện sạch, khơng nhiễm khuẩn, sử dụng hóc-mơn sinh trưởng GM-CSF vịng ngày Sau ni cấy, TBT nhuộm kháng thể FITC-Annexin V PE-CD11c vịng Hình 4.1 phần trăm số tế bào dương tính với marker CD11c Annexin V xác định kỹ thuật Flow cytometry Hình 4.1 Hình dot blot tế bào tua nhuộm kháng thể FITCAnnexin V PE-CD11c Hình 4.1 cho thấy 92% số tế bào tập trung vùng Q4, tức dương tính với marker CD11c gần khơng có tế bào dương tính với marker Annexin V, chứng tỏ đại đa số tế bào tủy xương biệt hóa thành TBT sống sót phát triển Phụ lục 1.2 Hình ảnh tế bào tua sau nuôi cấy Sử dụng DAPI, FITC anti-mouse NF-κB antibody PE anti-mouse beta actin antibody để quan sát hình dạng cấu trúc tế bào DAPI (4′,6-diamidino-2phenylindole) thuốc nhuộm chuyên biệt cho ADN DAPI hình thành nên phức hợp huỳnh quang cách gắn vào khe nhỏ trình tự ADN giàu A-T Phức hợp hấp thụ ánh sáng cực tím sau phát ánh sáng huỳnh quang màu 126 xanh da trời, cường độ cực đại 461 nm Do chất sử dụng để nhuộm nhân tế bào cho nhân sơ nhân chuẩn DAPI sử dụng để nhuộm ADN nhiều kỹ thuật khác flow cytometry, nhuộm nhiễm sắc thể, hiển thị định lượng ADN lĩnh vực hóa mơ hóa sinh Bên cạnh đó, kháng thể NFκB sử dụng để nhuộm tế bào chất kháng thể beta actin (P.E) để quan sát khung xương tế bào Các tế bào tua sau nhuộm thuốc nhuộm DAPI, kháng thể NF-κB, kháng thể beta actin để quan sát bắt màu nhân, tế bào chất thành tế bào soi kính hiển vi huỳnh quang thu hình ảnh sau: (A) (B) (C) (D) Hình 4.2 Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang (A) nhuộm với DAPI (B) nhuộm với kháng thể FITC NF-κB (C) nhuộm với kháng thể PE beta actin (D) nhuộm đồng thời loại Hình 4.2 hình ảnh thu từ kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm TBT với DAPI (để quan sát nhân tế bào), kháng thể NF-κB (để quan sát 127 mật độ protein tế bào), kháng thể beta actin (để quan sát thành tế bào) Qua quan sát hình dáng TBT kết cho thấy TBT việc ni cấy biệt hố thành cơng Phụ lục 1.3 Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm Lipopolysaccharide Như biết, LPS thụ thể kích hoạt TLR4 tế bào miễn dịch Một số nghiên cứu LPS ảnh hưởng đến khả trưởng thành, di cư hấp thu kháng nguyên TBT Sự gắn kết phối tử thụ thể TLR4 tế bào kích hoạt tín hiệu phân tử hoạt động làm tăng biểu marker bề mặt, tăng tiết số cytokine viêm [74] Khả tiết cytokine gây viêm tế bào liên quan trực tiếp đến hoạt động miễn dịch thể, từ điều hịa q trình trả lời miễn dịch trả lời đối kháng dị ứng, thể tiếp xúc với yếu tố gây bệnh tác nhân khác từ môi trường sống [44, 47] Trong thí nghiệm này, LPS sử dụng yếu tố kích hoạt trưởng thành TBT Để đánh giá mức độ trưởng thành TBT, tiến hành khảo sát marker bề mặt bao gồm CD86, CD40 MHC II nhóm TBT nhóm chứng nhóm phơi nhiễm LPS sau 24 Các TBT sau ni cấy biệt hố GM-CSF, nhuộm kháng thể FITC-CD11c PE-CD86/ MHC II/ CD40 vòng giờ, tiến hành đồng thời nhóm chứng nhóm kích thích trưởng thành LPS để khác biệt Phần trăm số tế bào dương tính với marker CD11c CD86/MHC II/ CD40 sử dụng kỹ thuật Flow cytometry trình bày hình 4.3 Marker CD11c+ CD86+ Nhóm chứng Nhóm phơi nhiễm LPS 128 CD11c+ MHC II+ CD11c+ CD40+ Hình 4.3 Hình dot blot TBT nhuộm kháng thể FITC-CD11c PE-CD86/ MHC II/ CD40 Trong hình ảnh dot blot 4.3, trục tung CD11c, trục hoành CD 86, MHC II CD40 theo thứ tự hình từ xuống Kết cho thấy trước phơi nhiễm LPS TBT chưa trưởng thành biểu marker bề mặt MHC II, CD86 CD40 (mật độ tế bào rải rác vùng Q3, Q4, tập trung vùng Q2) Tuy nhiên nhóm TBT phơi nhiễm với LPS tế bào tập trung chủ yếu vùng Q2, tức dương tính với marker bề mặt nói Như vậy, so với nhóm chứng nhóm phơi nhiễm LPS ln có tỉ lệ phần trăm biểu marker bề mặt cao đáng kể bao gồm CD86, CD40 MHC II Điều cho thấy phơi nhiễm LPS làm kích thích trưởng thành nhóm TBT dương tính với marker CD11c+ 129 Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α tế bào tua Trong nghiên cứu này, tế bào tua xử lý trước LPS IL-10 (200 ng/ml) Sau 24 giờ, thu hoạch dịch huyền phù cho thí nghiệm xác định nồng độ TNF-α kỹ thuật ELISA Hình 4.4 Nồng độ TNF-α dịch huyền phù CD11b+DC xác định ELISA Nồng độ TNF-a dịch huyền phù tế bào tua xác định kỹ thuật ELISA (n = 5) *(p < 0.05) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 (phân tích kết hàm ANOVA) Kết Hình 4.4 cho thấy nồng độ TNF-α thu nhiều môi trường nuôi cấy tế bào với IL-10 Thông thường, kích hoạt TBT kháng nguyên LPS làm tăng tiết loại cytokine viêm từ ức chế chết apoptosis tế bào Ngược lại, tế bào chết hoại tử, khả giải phóng loại cytokine viêm giảm vật chất di truyền nhân tế bào bị thối hóa [123] Trong thí nghiệm phân tích khả tiết TNF-α dịch huyền phù TBT kỹ thuật ELISA, TBT xử lý trước LPS, sau xử lý tiếp IL10 (200 ng/ml) cuối thu hoạch dịch huyền phù cho thí nghiệm xác định nồng độ TNF-α kỹ thuật ELISA Khi kích thích tế bào CD11b+DC LPS, nồng độ TNF-α dịch huyền phù TBT tăng mạnh từ 1,5 lên 570 (pg/ml), tăng lên thành 874 (pg/ml) nhóm vừa kích thích LPS sau phơi nhiễm với IL-10 (200ng/ml) Thơng thường, kích hoạt TBT kháng ngun LPS làm tăng tiết loại cytokine viêm cytokine kháng viêm, từ ức chế chết apoptosis tế bào Ngược lại, tế bào chết hoại tử, khả giải phóng loại cytokine viêm 130 giảm vật chất di truyền nhân tế bào bị thối hóa Trong thí nghiệm phân tích khả tiết TNF-α TBT dịch huyền phù tế bào kỹ thuật ELISA, nồng độ TNF-α thu nhiều môi trường nuôi cấy tế bào IL-10 cho thấy phosphoryl hóa STAT1 dẫn tới làm tăng phiên mã gen TNF-α nhân tế bào Chính thế, suy đốn IL-10 làm chết apoptosis TBT liên quan đến tín hiệu apoptosis TNF/TNF receptor/STAT1 131 Phụ lục 3: Ảnh hưởng số cytokine trình apoptosis tế bào CD11b+DC Phụ lục 3.1 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ Hình 4.5 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ *(p < 0,05) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 (phân tích kết hàm ANOVA) Khi phân tích phần trăm số lượng tế bào dương tính với kháng thể Annexin V âm tính với 7-AAD, kết so với nhóm tế bào đối chứng có nhóm tế bào xử lý IL-10 nồng độ 200 ng/ml làm tăng số lượng tế bào dương tính với Annexin V cách rõ ràng (tăng 25%) Trong đó, nhóm TBT xử lý với cytokine cịn lại khơng ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ tế bào chết apoptosis, bao gồm nhóm xử lý IL-10 nồng độ thấp (20 ng/ml), nhóm xử lý TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml), IL-2 (30 ng/ml) với kết thu 21,3%; 20,6%; 19,2% 23,9% Như vậy, IL-10 nồng độ cao (200 ng/ml) làm tăng cường q trình apoptosis, cịn loại cytokine khác TNF-a, IFN-g, IL-2 với nồng độ nghiên cứu (TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml), IL-2 (30 ng/ml) không 132 Phụ lục 3.2 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ Hình 5.6 Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ A Hình biểu đồ biểu hoạt động caspase-3 ảnh hưởng IL-10 (200 ng/ml) IL-2 TBT trưởng thành B Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10 (n = 5) ** (p < 0,01) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 C Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine TNFα, IFN-γ IL-2 (n = 5) (phân tích kết hàm ANOVA) Kết rằng, so với nhóm tế bào đối chứng nhóm tế bào xử lý TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml) IL-2 (30 ng/ml) có biểu Caspase-3 khơng khác biệt rõ ràng Kết thu tỉ lệ tế bào chết apoptosis tăng 20% xử lý với TNF-a IFN-g, tăng 25% xử lý với IL-2 Tuy nhiên, IL-10 nồng độ 20 ng/ml 200 ng/ml làm tăng biểu Caspase-3, IL-10 nồng độ 200 ng/ml làm tăng tỷ lệ tế bào dương tính với Caspase-3 cao rõ rệt (tăng 31%) Điều IL-10 thúc đẩy trình apoptosis TBT, cytokine khác TNF-a, IFN-g, IL-2 khơng làm tăng cường q trình 133 Phụ lục 4: Vai trò điều hòa IL-10 phosphoryl hóa STAT1 STAT3 tế bào tua Phụ lục 4.1 Vai trị điều hồ IL-10 phosphoryl hoá STAT1 Từ kết Hình 5.5 5.6 khẳng định IL-10 ảnh hưởng đến trình apoptosis TBT phụ thuộc vào nồng độ, cytokine khác IL-2, TNF-a IFN-g khơng Vì vậy, tiếp tục phân tích xem IL-10 có kích hoạt phân tử tín hiệu STAT1 hay khơng Trong thí nghiệm này, biểu hoạt động tín hiệu phân tử STAT1 mơ tả Hình 4.7 A B Hình 4.7 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 Hình ảnh Western blot biểu p-STAT1 TBT xử lý với IL-10 LPS đồng thời IL-10 LPS không xử lý (nhóm chứng) Kết rằng, hoạt hóa TBT kháng nguyên LPS IL-10 làm tăng phosphoryl hóa STAT1 hoạt động tín hiệu tăng lên tế bào xử lý đồng thời với LPS IL-10 Như vậy, IL-10 làm tăng cường phosphoryl hóa STAT1 Kết tương tự với kết nhóm De Wilde thực tế bào tuỷ xương thu kết protein A20 ức chế tín hiệu STAT1 [34] 134 Phụ lục 4.2 Vai trị điều hồ IL-10 phosphoryl hố STAT3 Khi phân tích hoạt động tín hiệu phân tử STAT3 kỹ thuật Western blot TBT phá vỡ dung dich RIPA thu protein tổng số, sau protein điện di để xác định biểu hoạt động tín hiệu STAT3 A B Hình 4.8 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 Hình ảnh Western blot biểu p-STAT1, p-STAT3 TBT xử lý với IL-10 LPS đồng thời IL-10 LPS khơng xử lý (nhóm chứng) Kết Hình 4.8 rằng, hoạt động tín hiệu STAT3 không thay đổi tế bào xử lý với IL-10, tăng cường xử lý với LPS, tăng xử lý cộng gộp LPS IL-10 Kết tương tự với kết nhóm De Wilde thực tế bào tuỷ xương kết luận protein A20 có vai trị ức chế STAT1 khơng ảnh hưởng đến STAT3, điều kiện không kích thích sau kích thích IFN-γ IL-6 [34] Một tín hiệu phân tử liên quan đến trình apoptosis biết đến STAT, tín hiệu kích hoạt thơng qua phosphoryl hóa vùng Cterminal Các nghiên cứu trước chuột thiếu hụt gen STAT1 xuất khối u tự phát nhanh so với nhóm đối chứng [31] Khi phân tích hoạt động tín hiệu phân tử STAT1 STAT3 kỹ thuật Western 135 blot Kết rằng, phosphoryl hóa STAT1 tăng lên hoạt hóa TBT kháng nguyên LPS IL-10 hoạt động tín hiệu tăng tế bào xử lý đồng thời với LPS IL-10 Hoạt động tín hiệu STAT3 khơng thay đổi tế bào xử lý IL-10 Nghiên cứu cho thấy tác dụng IL-10 tác nhân kích hoạt STAT1 sau gây apoptosis TBT Do đó, vai trị điều tiết protein A20 mức độ IL-10 ảnh hưởng đến sống tế bào ... Vai trò protein A20 tế bào T 1.1.2.2 Vai trò protein A20 tế bào B 1.1.2.3 Vai trò protein A20 tế bào tua 1.1.4 Vai trò protein A20 chết theo chương trình apoptosis 1.1.5 Cơ. .. trị điều hồ gen mã hoá protein A20 chế phân tử tham gia kiểm sốt q trình sinh lý tế bào tua” Luận án thực với mục tiêu sau: Đánh giá vai trò gen A20 việc điều hoà bốn chức sinh lý gồm trưởng thành,... tử siRNA vào tế bào tua Phương pháp đưa phân tử siRNA vào tế bào tua nhằm bất hoạt gen A20 để nghiên cứu vai trò, chức gen A20 trình sinh lý tế bào đường truyền tín hiệu phân tử tế bào siRNA
Ngày đăng: 15/01/2023, 14:41
Xem thêm:
