Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein a20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thu Thủy NGHIÊN CỨU VAI TRÕ ĐIỀU HỒ CỦA GEN MÃ HỐ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SỐT Q TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA Chun ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 94 20 20 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Thị Xuân – Viện nghiên cứu hệ gen Người hướng dẫn khoa học 2: TS Hoàng Văn Tổng – Học viện quân y Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Protein A20 protein kích thích yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor α-induced protein - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm điều hòa ngược hoạt động sinh lý tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn phosphoryl hóa số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB (nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells) tín hiệu STAT (signal transducer and activator of transcription) Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột biến gen A20 làm thay đổi chức sinh học protein A20 nguyên nhân gây loại bệnh lý bệnh tự miễn, viêm nhiễm ung thư Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu tình trạng suy nhược, mắc bệnh tự miễn, viêm toàn quan, phận thể khơng sống sót q tuần tuổi Ở người, bất hoạt gen A20 ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn ung thư loại bệnh ung thư máu Tuy nhiên ảnh hưởng protein A20 đến chế bệnh sinh bệnh chưa tìm hiểu đầy đủ Tế bào tua (TBT) tế bào trình diện kháng nguyên chun nghiệp cho tế bào lympho, có vai trị quan trọng hệ thống miễn dịch Chỉ có TBT có khả kích thích hình thành phản ứng miễn dịch tế bào lympho T trạng thái khơng hoạt động TBT đóng góp vào chức tế bào lympho B giúp trì trí nhớ miễn dịch tế bào TBT sản xuất cytokine yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B Các tế bào tua có mặt hầu hết quan lympho lách hạch bạch huyết, biểu mô da, ống tiêu hóa ống hơ hấp, chúng dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh TBT chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dịng lympho có nguồn gốc từ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC phân chia thành hai tập hợp CD8+DC CD11b+DC có mức độ biểu loại thụ thể toll-like (toll-like receptor - TLR) khác nhau, đóng vai trị khác khả tương tác với mầm bệnh Một số nghiên cứu trước tế bào tua protein A20 có khả ức chế khả sản xuất số cytokine Tuy nhiên đến nay, chưa có cơng bố khoa học vai trò, chế phân tử gen A20 điều hòa chức sinh lý TBT phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh trùng ảnh hưởng protein A20 đến hoạt động apoptosis TBT bị kích thích số cytokine Do đó, thí nghiệm tiến hành để nghiên cứu vai trị điều hồ protein A20 TBT kích hoạt số kháng nguyên profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) số cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trị điều hồ gen mã hố protein A20 chế phân tử tham gia kiểm sốt q trình sinh lý tế bào tua” Mục tiêu nghiên cứu luận án Đánh giá vai trị gen A20 điều hồ chức sinh lý gồm trưởng thành, tiết cytokine, di cư apoptosis TBT Đánh giá ảnh hưởng gen A20 điều hịa tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 STAT3 liên quan đến trình sinh lý TBT Các nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu vai trị gen A20 việc điều hoà chức sinh lý TBT: 1.1 Biệt hóa TBT FLT3 để thu tập hợp TBT pDC, CD8+DC CD11b+DC Xử lý nhóm TBT với profilin, quan sát so sánh chức trưởng thành, di cư, tiết cytokine apoptosis nhóm TBT bất hoạt A20 nhóm khơng bất hoạt 1.2 Biệt hóa TBT GM-CSF để thu nhóm tế bào CD11b+DC Phơi nhiễm nhóm TBT với LPS để quan sát vai trò protein A20 chức sinh lý Nghiên cứu vai trò gen A20 điều hịa q trình sinh lý thơng qua số dịng tín hiệu phân tử liên quan TBT, bao gồm photphoryl hóa IκB-α, STAT1 STAT3 CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Protein A20 Protein A20 (hay gọi TNFAIP3 - tumor necrosis factor a-induced protein - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) protein ức chế phản ứng viêm chống lại tác nhân gây viêm Protien A20 có chiều dài 790 acid amin khối lượng phân tử 89,6 kDa Protein A20 đóng vai trị chất điều hồ phản ứng miễn dịch trung gian thơng qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB) Protein A20 mã hóa gen A20, gen đặt tên theo số cDNA, xác định gen cảm ứng với TNF tế bào nội mô Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm exon intron Trong đó, exon 1, đầu 5’ exon đầu 3’ exon khơng mã hố protein Độ dài mRNA 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến 2439 Các nghiên cứu trước chức protein A20 A20 ngăn chặn phản ứng viêm thông qua ức chế tín hiệu phân tử NF-κB Nghiên cứu in vivo vai trò protein A20 cho thấy chuột bị knock-out A20 mẫn cảm với TNF, chết sớm viêm đa quan nghiêm trọng chứng suy nhược tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn cộng sinh Protein A20 có vai trị quan trọng điều hồ hệ thống miễn dịch thông qua tác động đến tế bào miễn dịch khác TBT, tế bào B, tế bào T đại thực bào Vì vậy, bất hoạt gen A20 chiến lược để nâng cao hiệu phòng điều trị bệnh dựa TBT bệnh ung thư bệnh truyền nhiễm Trên thực tế, TBT thiếu hụt protein A20 tạo đáp ứng miễn dịch kháng thể đặc biệt tốt so với TBT kiểu hoang dại Gen A20 locus nhạy cảm bệnh lý tự miễn, bao gồm: viêm khớp dạng thấp, viêm khớp tự phát, ban đỏ lupus, viêm đại tràng, bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đường tuýp I, bệnh đa xơ cứng Hiểu rõ chế hoạt động quy định gen A20 tạo sở cho phát triển phương pháp trị liệu kháng viêm Nhiều nghiên cứu giới A20 protein điều hòa ngược hoạt động biệt hóa tế TBT thơng qua tín hiệu phân tử NF-кB, STATs Sự gắn kết thụ thể toll-like receptors TLRs bề mặt tế bào với phối tử đặc hiệu chúng bao gồm kháng nguyên xuất phát từ vi khuẩn, cytokine gây viêm, yếu tố phóng xạ… kích hoạt tín hiệu phân tử Bất thường di truyền gen A20 xảy bệnh nhân ung thư máu đột biến gen đoạn gen bất hoạt gen 1.2 Tế bào tua (TBT) Tế bào tua (Dendritic cells - TBT) tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (antigen-presenting cells - APCs) để tạo phản ứng miễn dịch Các TBT kết hợp truyền thông tin từ môi trường bên đến tế bào hệ thống miễn dịch TBT không quan trọng việc tạo phản ứng miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch tập nhiễm mà điều chỉnh loại đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T Gần đây, y học đại áp dụng phương pháp trị liệu miễn dịch dựa TBT để chống lại ung thư bệnh truyền nhiễm Các TBT dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh TBT có mặt quan lympho như: lách hạch bạch huyết, biểu mô da, ống tiêu hóa, hơ hấp dịch kẽ hầu hết quan nhu mơ Đặc điểm hình thái quan trọng TBT diện lớp màng trải từ thân tế bào chính, tương tự tua (dendrites) nơ-ron nên đặt tên dendritic cells, bắt nguồn từ chữ “Dendron” tiếng Hy Lạp, nghĩa TBT chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dịng lympho có nguồn gốc từ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC phân chia thành hai tập hợp CD8+DC CD11b+DC có mức độ biểu loại thụ thể TLR khác nhau, đóng vai trị khác khả tương tác với mầm bệnh TBT có hai chức trình diện kháng ngun điều hồ miễn dịch Các q trình sinh lý TBT đóng vai trị quan trọng hoạt động hệ thống miễn dịch, bao gồm biệt hoá, trưởng thành, di cư, thực bào, tiết cytokine apoptosis Có nhiều loại tín hiệu phân tử tham gia kích hoạt TBT như: PI3K, MAPK, NF-кB STAT Trong đó, NF-кB STAT có liên quan chặt chẽ đến hoạt động viêm bệnh tự miễn ung thư Hiện nay, y học người ta nghiên cứu ứng dụng loại thuốc ức chế NF-кB STAT để phục vụ điều trị loại bệnh mãn tính ác tính, gen A20 tham gia điều hịa hoạt động, mức độ thục biệt hóa tế bào thơng qua hoạt động tín hiệu phân tử NF-кB STAT Trên giới, liệu pháp vắc xin TBT thử nghiệm điều trị cho nhiều bệnh nhân ung thư hắc tố, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận Ở Việt Nam, phịng thí nghiệm tế bào gốc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia HCM triển khai nghiên cứu sử dụng liệu pháp TBT điều trị ung thư vú Tuy nhiên, bước thử nghiệm PTN, chưa thể áp dụng vào thực tế chữa bệnh bệnh nhân Những tiến đáng kể hiểu biết sinh học TBT mở đường cho phát triển phác đồ điều trị bệnh y học Vì vậy, hy vọng liệu pháp điều trị ung thư hiệu CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Tế bào tua phân lập nuôi cấy từ tế bào tủy xương chuột BALB/c Chuột BALB/c cung cấp công ty Taconic Farms (Hudson, New York, USA) Chuột ni theo quy trình thí nghiệm, thực theo luật pháp Việt Nam động vật phê duyệt Hội đồng đạo đức Viện nghiên cứu hệ gen Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tế bào tủy xương chuột BALB/c sử dụng hóc mơn sinh trưởng GM-CSF để biệt hóa thành tế bào CD11b+DC FLT3 để biệt hóa thành quần thể tế bào tua CD8+DC, CD11b+DC pDC tùy thuộc mục đích thí nghiệm Các TBT ni cấy điều kiện phịng thí nghiệm tiêu chuẩn Viện nghiên cứu hệ gen 2.2 Các hố chất Hóa chất sử dụng nghiên cứu bao gồm TRIzol™ Plus RNA Purification Kit; Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent; IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-α, INF- γ Mouse ELISA Kit; kháng thể mouse IgG isotype control, anti-mouse CD11c, anti-mouse CD86, anti-mouse CD40 anti-mouse I-A/I-E hóa chất đạt tiêu chuẩn quốc tế cung cấp hãng có uy tín như: Thermo, Sigma, Invitrogen, Gibco,… 2.3 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm tủ an tồn sinh học cấp 2, kính hiển vi huỳnh quang, máy phân tích tế bào học dịng chảy Flow cytometry, dụng cụ Western blot, máy đọc ELISA thiết bị chuyên dụng khác Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Quân Y 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu  Ni cấy biệt hố TBT: Tế bào tủy xương phân lập từ xương khớp đùi chuột BALB/c Sử dụng hóc mơn GM-CSF (35 ng/ml) vào ngày thứ thứ để biệt hoá thành CD11b+DC (hoặc ngày thứ bổ sung FLT3 (200 ng/ml) để biệt hoá thành loại TBT  Phương pháp đưa phân tử siRNA đặc hiệu gen đích A20 vào TBT nhằm bất hoạt gen A20  Kỹ thuật Western blot đánh giá phosphoryl hoá phân tử tín hiệu κBα, STAT-1 (727), p-STAT-3 dựa vào việc phát phức hợp kháng thể đặc hiệu - protein gắng màng  Kỹ thuật ELISA đo nồng độ cytokine IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α IFN-γ tiết TBT nhóm chứng nhóm bất hoạt A20 so sánh khác biệt nhóm  Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) đo biểu marker trưởng thành MHC II, CD86 CD40 phân tích trình apoptosis thơng qua Annexin V, 7-AAD Caspase-3  Phương pháp xác định di cư tế bào để xác định tỉ lệ TBT di cư so sánh nhóm bất hoạt A20 nhóm chứng  Phân tích số liệu CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu vai trò gen A20 việc điều hoà chức sinh lý TBT 3.1.1 Kết bất hoạt gen A20 TBT Sau bất hoạt gen A20 TBT, tiến hành kiểm tra so sánh mức độ biểu protein A20 tế bào bất hoạt tế bào nhóm chứng Western blot, kết hình 3.1 Hình 3.1 Kết biểu protein A20 sau đưa A20-siRNA vào tế bào tua Kết hình ảnh Western blot cho thấy sau đưa phân tử A20-siRNA vào TBT, biểu protein A20 bị bất hoạt gần hồn tồn so với nhóm chứng (control siRNA) Các băng chứng (GAPDH) bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng giếng Kết khẳng định sau đưa A20-siRNA vào TBT, biểu protein A20 bị bất hoạt 3.1.2 Vai trò protein A20 trƣởng thành TBT Kết cho thấy protein A20 có vai trị ức chế sản xuất cytokine IL-6 TNF-α nhóm tế bào CD11b+DC Hình 3.4 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine pDC phơi nhiễm profilin Protein A20 ức chế tiết cytokine IL-6, IL-12p40, TNF-α IFN-γ xử lý với profilin Bằng chứng A20 ức chế phản ứng viêm pDC phần phản ứng viêm CD11b+DC Điều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu gần nhóm Cohen cộng công bố cytokine IL-12p40 IFN-γ không sản xuất CD11b+DC nhiễm T gondii 3.1.3.2 Vai trò protein A20 tiết cytokine TBT biệt hóa TBT GM-CSF kích hoạt LPS Hình 3.5 Ảnh hưởng A20 lên tiết cytokine CD11b+DC phơi nhiễm LPS 11 Bất hoạt A20 CD11b+DC dẫn đến việc sản xuất IL-10 TNF-α tăng cường so với nhóm chứng khơng bất hoạt, khơng ảnh hưởng tới tiết IL-6 Kết quán với nghiên cứu trước IL-6 không liên quan đến vai trị điều hồ gen A20 TBT mức độ huyết chuột chí cịn thấp chuột thiếu A20 TBT so với chuột nhóm chứng Ở nhóm thí nghiệm thứ hai này, bất hoạt A20 TBT dẫn đến việc sản xuất IL-10 TNF-α tăng cường so với nhóm chứng khơng bất hoạt, không ảnh hưởng tới tiết IL-6 Tuy nhiên, nhóm thí nghiệm thứ nhất, phơi nhiễm với profilin nhóm CD11b+DC bất hoạt gen A20 làm tăng tiết IL-6 TNF-α Như vậy, sử dụng kháng nguyên khác để kích thích trưởng thành dẫn đến khả tiết cytokine khác hay nói dẫn đến biểu trưởng thành khác 3.1.4 Vai trò protein A20 di cư TBT 3.1.4.1 Vai trò protein A20 di cư tế TBT biệt hóa TBT FLT3 xử lý profilin Hình 3.6 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm TBT biệt hố FLT3 phơi nhiễm profilin Khi thiếu hụt gen A20, việc di chuyển tế bào pDC tăng cường so với không bất hoạt, cho thấy việc di chuyển tế 12 bào pDC bị ức chế diện gen A20 Trong đó, hoạt động di chuyển CD8+DC CD11+DC không bị ức chế A20 Kết phù hợp với báo cáo trước protein A20 tham gia điều hòa việc di chuyển tế bào Khi nghiên cứu biểu A20 ung thư biểu mô tế bào gan HCC, nhóm Chen H cộng biểu protein A20 tăng lên mơ dịng tế bào HCC Tăng biểu protein A20 có tương quan nghịch với kích thước khối u, giai đoạn phát triển, hình thành huyết khối khối u, xâm lấn di ung thư 3.1.4.2 Vai trò protein A20 di cư TBT biệt hóa GM-CSF kích hoạt LPS Hình 3.7 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm CD11b+DC biệt hoá GM-CSF phơi nhiễm LPS Ở nhóm CD11b+DC, bất hoạt A20 làm tăng cường khả di chuyển xử lý với LPS Tuy nhiên, kết khơng hồn tồn khớp với thí nghiệm trước tiến hành phơi nhiễm với profilin Điều lần khẳng định kích thích trưởng thành kháng nguyên khác dẫn đến biểu trưởng thành khác 3.1.5 Vai trò protein A20 đối trình apoptosis TBT 13 Hình 3.8 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis thơng qua số lượng tế bào phản ứng dương tính với marker Annexin V Sau phơi nhiễm với LPS số cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ, so với nhóm tế bào đối chứng, nhóm bất hoạt A20 khác biệt phần trăm số tế bào phản ứng dương tính với kháng thể Annexin V âm tính với 7-AAD Tương tự vậy, phân tích apoptosis tỉ lệ tế bào dương tính với Caspase-3, kết khơng có khác biệt nhóm bất hoạt A20 nhóm chứng Như vậy, thí nghiệm protein A20 khơng tác động đến q trình apoptosis TBT Tuy nhiên số nghiên cứu khác, nhóm T Das nhóm Z Jin, A20 đóng vai trị ức chế qua trình apoptosis nhiều loại tế bào miễn dịch Về vai trò số cytokine q trình apoptosis, thơng qua hai phương pháp khảo sát phần trăm tế bào dương tính với Annexin V, âm tính với 7-AAD phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3, kết cho thấy so với nhóm tế bào đối chứng nhóm tế bào xử lý TNF- (10 ng/ml), INF- (10 ng/ml) IL-2 (30 ng/ml) khác biệt rõ ràng phần trăm tế bào chết apoptosis Trong IL-10 nồng độ 20 ng/ml 200 ng/ml làm tăng cường trình apoptosis Điều IL-10 thúc đẩy q trình apoptosis TBT, cịn cytokine khác TNF-, INF-, 14 IL-2 khơng làm tăng cường trình Kết phù hợp với nghiên cứu trước cytokine kháng viêm IL-10 tham gia cảm ứng trình apoptosis số loại tế bào khác bao gồm TBT đại thực bào Khi sử dụng LPS làm đối chứng, kết cho thấy A20 khơng ảnh hưởng đến apoptosis CD11b+DC Chính thế, không nghiên cứu ảnh hưởng protein A20 đến apoptosis loại TBT phơi nhiễm với profilin 3.2 Nghiên cứu số tín hiệu phân tử liên quan đến trình sinh lý TBT dƣới vai trò điều hòa protein A20 3.2.1 Protein A20 điều hịa phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 STAT3 TBT nhóm CD11b+DC phơi nhiễm với profilin Hình 3.9 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm profilin (n=5) Sau bị xử lý với TgPRF thời điểm 30, 60, 120 phút, nhóm tế bào CD11b+DC bất hoạt gen A20 có tăng cường phosphoryl hóa IκB-α so với nhóm chứng (khơng bất hoạt A20), không đạt ý nghĩa thống kê 15 Đối với tín hiệu STAT1, bất hoạt gen A20 có tăng cường phosphoryl hóa STAT1 so với nhóm chứng khơng bất hoạt Ngồi quan sát thấy mức độ tăng cường phosphoryl hoá tăng theo thời gian xử lý từ 30, 60 phút giảm thời điểm 120 phút Như protein A20 ức chế phosphoryl hoá phân tử tín hiệu STAT1 Tuy nhiên, biểu phân tử tín hiệu STAT3 khơng khác biệt đáng kể nhóm tế bào xử lý A20-siRNA nhóm chứng không bất hoạt Điều nghĩa protein A20 vai trị điều hồ q trình phosphoryl hố phân tử protein STAT3 3.2.2 Protein A20 điều hòa phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 STAT3 TBT nhóm pDC phơi nhiễm với profilin Hình 3.10 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào pDC phơi nhiễm profilin (n=5) Kết hình ảnh Western blot cho thấy sau xử lý với TgPRF, nhóm pDC bất hoạt A20 có tăng cường phosphoryl hóa 16 IκB-α so với pDC nhóm chứng Kết khẳng định A20 ức chế biểu tín hiệu IκB-α tế bào pDC Tương tự vậy, bất hoạt gen A20, biểu phân tử p-STAT1 cao so với nhóm chứng control siRNA Kết khẳng định A20 ức chế biểu tín hiệu STAT1 tế bào pDC Các băng đối chứng (GAPDH) bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng giếng Tuy nhiên, biểu phân tử tín hiệu STAT3 sau tế bào pDC xử lý với TgPRF không thay đổi tế bào xử lý A20-siRNA so với nhóm chứng khơng bất hoạt A20 Như vậy, A20 không ức chế biểu tín hiệu STAT3 tế bào pDC phơi nhiễm trưởng thành profilin 3.2.3 Protein A20 điều hòa phosphoryl hóa STAT1 STAT3 TBT nhóm CD11b+DC xử lý với LPS Hình 3.11 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm LPS (n=5) 17 Kích thích LPS dẫn đến việc tạo STAT1 bị phosphoryl hóa So với tế bào nhóm chứng, bất hoạt gen A20 rõ ràng tăng cường biểu STAT1 bị phosphoryl hóa Các băng chứng (GAPDH) bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng giếng Kết protein A20 điều hòa âm đường STAT1 TBT Tuy nhiên, sau kích hoạt LPS, biểu STAT3 tương tự hai kiểu gen bất hoạt A20 không bất hoạt Kết protein A20 không ảnh hưởng đến đường tín hiệu STAT3 TBT nhóm CD11b+DC xử lý với LPS Cho đến nay, có cơng bố vai trị điều hịa âm protein A20 tín hiệu NF-κB, nhiên có nhóm nghiên cứu tập trung đánh giá vai trò protein A20 việc điều chỉnh chức TBT thơng qua dịng tín hiệu STATs STATs họ protein phiên mã nội bào điều hoà nhiều chức khác tế bào như: tăng sinh, chết theo chương trình biệt hoá Sự kiểm soát nhân tố thường gặp khối u nguyên phát làm tăng cường khả sống sót khối u ức chế miễn dịch Các nghiên cứu bất hoạt gen STAT cho thấy protein STAT có liên quan đến chức hệ miễn dịch đóng vai trị quan trọng việc trì khả miễn dịch giám sát khối u Chuột thiếu hụt gen STAT1 xuất khối u tự phát nhanh so với nhóm đối chứng Đột biến gen STAT1 người dẫn tới giảm khả chống chịu với bệnh nhiễm trùng Kết nghiên cứu protein A20 ức chế phosphoryl hoá STAT1 tế bào pDC xử lý phơi nhiễm với profilin tế bào CD11b+DC phơi nhiễm LPS/profilin Tuy nhiên, khơng ảnh hưởng đến phosphoryl hố STAT3 Kết 18 trùng khớp với số nghiên cứu gần đây, protein A20 chứng minh điều hoà đường STAT1 số loại tế bào bao gồm tế bào tuỷ xương myeloid hay tế bào ung thư biểu mơ gan HCC Có nhiều nghiên cứu mối tương quan protein A20 tín hiệu STAT1 Từ năm 1998, Manthey cộng bạch cầu đơn nhân, biểu gen A20 quy định dịng tín hiệu STAT1 sau nhóm nghiên cứu De Wilde báo cáo tác dụng ức chế tín hiệu STAT1 gen A20 tế bào myeloid 3.2.4 Vai trò protein A20 số chức sinh lý tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 3.2.4.1 Vai trò protein A20 trưởng thành tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 Hình 3.12 Ảnh hưởng A20 lên biểu marker trưởng thành pDC thông qua đường tín hiệu IκB-α STAT1 19 Vai trò ức chế protein A20 trưởng thành tế bào thông qua biểu MHC II tế bào pDC bị giảm có fludarabine chất ức chế IKK Trong đó, biểu CD40 tế bào pDC bị giảm đáng kể có chất ức chế IKK 3.2.4.2 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 Hình 3.13 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 Chất ức chế IKK có vai trị ức chế hồn tồn tăng cường giải phóng cytokine IL-6, IL-12p40, TNF-α IFN-γ tế bào pDC bị bất hoạt A20 Trong fludarabine ức chế tiết TNF-α tế bào pDC bị bất hoạt A20 3.2.4.3 Vai trò protein A20 di chuyển tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α STAT1 20 Hình 3.14 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 Sự tăng cường di chuyển tế bào pDC bị bất hoạt A20 bị loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào thêm chất ức chế IKK không thay đổi có fludarabine Vai trị tín hiệu NF-κB đặc biệt quan trọng điều hòa hoạt động tế bào pDC bị bất hoạt gen A20 phơi nhiễm với TgPRF nghiên cứu chất ức chế IKK đảo ngược hoàn toàn thay đổi biểu dấu hiệu trưởng thành, sản phẩm cytokine khả di chuyển, fludarabine loại bỏ phần biểu tăng cường MHC II tiết cytokine TNF-α Protein A20 chứng minh chất ức chế hoạt động tế bào qua trung gian tín hiệu NF-κB tiếp xúc với kháng nguyên khác Gần số loại tế bào, gen A20 biết có tác dụng ức chế kích hoạt STAT1, giúp ngăn ngừa tử vong nhiễm T gondii chuột Dựa kết đạt được, kết luận protein A20 ức chế trưởng thành tế bào pDC thơng qua tín hiệu NF-κB ức chế phần phản ứng viêm thơng qua tín hiệu STAT1 Tác dụng A20 tế bào pDC ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch nhiễm T gondii 3.2.5 Vai trò protein A20 chức tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 21 3.2.5.1 Vai trò protein A20 trình sản xuất cytokine tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 Hình 3.15 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine CD11b+DC thông qua đường tín hiệu STAT1 Sau kích thích LPS, tiết cytokine nhóm bất hoạt gen A20 tăng cường so với nhóm chứng khơng bất hoạt Đáng ý là, tác dụng ức chế gen A20 TNF-α IL-10 bị giảm đáng kể fludarabine thêm vào môi trường nuôi cấy Bằng chứng tác dụng protein A20 việc giải phóng cytokine nhạy cảm với đường tín hiệu STAT1 3.2.5.2 Vai trị protein A20 điều hoà di chuyển tế bào CD11b+DC kích hoạt GM-CSF xử lý với LPS Hình 3.16 Ảnh hưởng protein A20 di chuyển CD11b+DC thơng qua đường tín hiệu STAT1 Sau xử lý LPS, di cư TBT tăng cường Đáng ý khả di chuyển tăng thêm sau 22 bất hoạt A20 Tuy nhiên, việc ức chế tín hiệu STAT1 cách sử dụng fludarabine khơng ảnh hưởng đến việc di chuyển TBT bất hoạt A20, cho thấy việc di chuyển TBT phụ thuộc vào diện protein A20 độc lập với tín hiệu STAT1 Kích hoạt STAT1 theo sau hoạt động hóa học TBT Sự di chuyển hiệu TBT sang hạch bạch huyết điều kiện tiên cho vai trò điều chỉnh chức tế bào lympho T CCL21 phối tử CCR7, biểu cách cấu thành tế bào nội mô bạch huyết ngoại biên tế bào stroma hạch bạch huyết, gợi hiệu ứng chúng để bắt TBT trưởng thành Nghiên cứu vai trò protein A20 điều chỉnh tiêu cực khả di chuyển CCL21 độc lập với đường STAT1 TBT, cho thấy việc di chuyển TBT nhạy cảm A20 phụ thuộc vào đường truyền tín hiệu khác thay STAT1 Tóm lại, vai trị điều hịa gen A20 đến nhóm TBT khác Đối với nhóm TBT dịng tuỷ CD11b+DC, phơi nhiễm LPS, protein A20 không gây ảnh hưởng đến trình apoptosis ức chế sản xuất cytokine có liên quan đến yếu tố phiên mã STAT1, đồng thời protein A20 ức chế di chuyển TBT CCR7 điều khiển độc lập với dịng tín hiệu STAT Những kết dự kiến liên quan đến phản ứng viêm bệnh liên quan đến STAT1 Đối với TBT dòng lympho pDC sau phơi nhiễm profilin, protein A20 tham gia cản trở hoạt động thục tiết cytokine di chuyển tế bào pDC thông qua đường tín hiệu NF-κB STAT1 23 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Vai trò gen A20 điều hoà chức sinh lý tế bào tua ⁃ Khi tế bào pDC phơi nhiễm với TgPRF, protein A20 ức chế số trình sinh lý tế bào bao gồm trưởng thành (thông qua biểu MHC II CD40), tiết cytokine (như IL-6, IL-12p40, TNF-α IFN-γ) di chuyển ⁃ Protein A20 ức chế phần tiết cytokine tế bào CD11b+DC (IL-6 TNF-α) phơi nhiễm với TgPRF ⁃ Tuy nhiên, phơi nhiễm với LPS số cytokine (như IL-2, IL-10, TNF-α INF-γ) protein A20 khơng ảnh hưởng đến q trình apoptosis tế bào tua Ảnh hưởng gen A20 số chức sinh lý tế bào thơng qua tín hiệu phân tử NF-κB STAT1 ⁃ Protein A20 cản trở phosphoryl hố phân tử tín hiệu IκB-α STAT1, khơng ảnh hưởng tới đường tín hiệu STAT3 ⁃ A20 ngăn chặn trưởng thành tế bào pDC thông qua NF-κB ức chế phản ứng viêm thơng qua STAT1 vai trị ức chế di cư A20 độc lập với STAT1 Kiến nghị: Mức độ biểu gen A20 liên quan mật thiết đến hoạt động sinh học tế bào miễn dịch nói chung TBT nói riêng thơng qua số tín hiệu phân tử NF-κB STAT1 Biểu bất thường gen A20 tìm thấy nhiều bệnh nhân ung thư, bao gồm dạng ung thư máu Chính vậy, nghiên cứu tập trung vào hướng: Xác định mối liên quan gen A20 với chế bệnh sinh số bệnh ung thư máu để đề xuất 24 hướng điều trị ung thư máu kết hợp với liệu pháp gen đích A20 liệu pháp tế bào đích liên quan đến gen A20 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN  Gen A20 tham gia cản trở hoạt động thục, tiết cytokine di chuyển tế bào pDC phơi nhiễm với kháng nguyên TgPRF thơng qua đường tín hiệu NF-κB STAT1 Tác động gen A20 đến hoạt động sinh học tế bào pDC liên quan đến đáp ứng miễn dịch nhiễm trùng T gondii người động vật  Vai trò cảm ứng chết apoptosis IL-10 TBT liên quan đến hoạt động giải phóng TNF-α thơng qua tín hiệu STAT1 khơng phụ thuộc vào có mặt gen A20 Các cytokine khác IL-2, TNF-α INF-γ không ảnh hưởng tới chết apoptosis tế bào tua DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Pham Ngoc Duy, Nguyen Thu Thuy, Bui Kieu Trang, Nguyen Hoang Giang, Nguyen Thi Hong Van, Nguyen Thi Xuan Regulation of NF-κB- and STAT1-mediated plasmacytoid dendritic cell functions by A20 PLoS ONE, 2019, 14(9): e0222697 Nguyen Thi Xuan, Nguyen Thu Thuy Regulation of inflammatory response by A20 through STAT-1 signalling in dendritic cells Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2019 17(2) 241-247 Nguyễn Thu Thủy, Nguyễn Thị Xuân Vai trị điều hịa q trình apoptosis IL-10 mối liên hệ với tín hiệu STAT-1 tế bào tua Tạp chí Sinh học, 2019 41(1) 109-116 25 ... vai trò điều hồ gen mã hố protein A20 chế phân tử tham gia kiểm sốt q trình sinh lý tế bào tua? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Đánh giá vai trò gen A20 điều hoà chức sinh lý gồm trưởng thành, tiết... giá ảnh hưởng gen A20 điều hịa tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 STAT3 liên quan đến trình sinh lý TBT Các nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu vai trò gen A20 việc điều hoà chức sinh lý TBT: 1.1... trước protein A20 tham gia điều hòa việc di chuyển tế bào Khi nghiên cứu biểu A20 ung thư biểu mô tế bào gan HCC, nhóm Chen H cộng biểu protein A20 tăng lên mơ dịng tế bào HCC Tăng biểu protein A20