Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down

ĐẶT VẤN ĐỀ Nền y học đại phát điều trị nhiều bệnh, nâng cao chất lượng sức khỏe người Nhưng bên cạnh cịn nhiều bệnh nan y chưa tìm phương pháp chữa trị, bệnh di truyền tốn khó giải y học Một bệnh di truyền quan tâm nhiều hội chứng Down ( Down syndrome ) Hội chứng Down hội chứng hay gặp hội chứng có biểu rối loạn nhiễm sắc thể Các hậu hội chứng Down gây cho người lớn : sảy thai, sinh mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển vô sinh Những người mang hội chứng Down trở thành gánh nặng lớn cho gia đình xã hội Hiện y học chưa tìm phương pháp chữa trị hội chứng Down mà hạn chế trẻ mang hội chứng Down phương pháp chẩn đoán trước sinh Phương pháp để phát hội chứng Down phổ biến Việt Nam sử dụng Tripple test siêu âm thai nhi, sau lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể 21 ) Nhưng phương pháp thường cho kết để phát hội chứng Down với độ xác chưa đạt 100% [2] Với phát triển vượt bậc khoa học kỹ thuật nay, kỹ thuật PCR áp dụng rộng rãi y học đại Kỹ thuật PCR Kary Mullis tìm giúp nghiên cứu DNA nói riêng, sinh học phân tử nói chung đạt thành tựu đáng kinh ngạc Nhờ phản ứng này, đoạn DNA vùng gene khuếch đại lên nhiều lần trình tự nucleotide hai đầu đoạn DNA biết Dựa vào trình tự đó, cặp oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, oligo tạo liên kết bổ sung với sợi đơn Chúng sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA in vitro nhờ enzyme DNA polymerase Đặc biệt phản ứng PCR đòi hỏi lượng DNA làm khuôn ban đầu nhỏ (khoảng 10-3 µg) Điều đặc biệt quan trọng có ý nghĩa việc phát mẫu DNA chẩn đốn nhiễm khuẩn y học, xác định tội phạm gây án kỹ thuật hình sự, mà DNA thu từ mẫu thường Hiện tìm nhiều gene nằm nhiễm sắc thể 21 có liên quan đến hội chứng Down, có gene quan trọng gene SOD1 ( Superoxide Dismutase hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ) gene SOD -1 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1 Enzym SOD -1 nằm bào tương tế bào Eukaryota, có chức chống oxi hóa cách chuyển O2- thành H2O2 , sau enzym Catalase Glutathione peroxidase (GPx) chuyển H2O2 thành O2 H2O Người mắc hội chứng Down có thêm nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 tổng hợp nhiều bình thường (gấp 1,5 lần), lượng sản phẩm chuyển hóa tăng theo Thơng thường hầu hết mơ tăng enzyme SOD-1 thường kéo theo enzyme Catalase GPx tăng theo tương ứng Nhưng tế bào thần kinh khơng có tăng theo enzyme trên, dẫn đến dư thừa lượng H2O2 tế bào thần kinh, dẫn đến thối hóa phá hủy tế bào thần kinh Tạo biểu lâm sàng hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp (dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao độ tuổi trung niên [16,17] Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “ Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down ” với mục tiêu : Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối bà mẹ mang thai Tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khn, chu trình nhiệt ) với gene SOD1 bệnh nhân mang hội chứng Down với bệnh nhân chứng CHƢƠNG I : TỔNG QUAN 1.Bệnh sử hội chứng Down : 1.1.Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down : Hội chứng Down hay gặp hội chứng có biểu rối loạn NST trẻ sơ sinh sống Năm 1846 , Seguin lần mơ tả đặc điểm hình thái bệnh với tên gọi “ Furfuraceuos Indocy ” Năm 1866 , John Langdon Down mô tả số bệnh nhân chậm trí tuệ với dấu hiệu hình thái đặc trưng : mặt tròn , khe mắt xếch , nếp quạt , hình ảnh bất thường nếp gấp lòng bàn tay giảm trương lực , … Năm 1959 , Lejenue cộng phát bệnh nhân mắc hội chứng Down có 47 NST thừa NST số 21 [2] 1.2.Nguyên nhân hội chứng Down : Khoảng 92% trường hợp mắc hội chứng Down thể tam nhiễm NST số 21 : 47,XX,+21 47,XY,+21 Thể tam nhiễm 21 xảy rối loạn phân ly cặp NST 21 trình tạo giao tử, karyotype bố mẹ trường hợp bình thường Khoảng 1% trường hợp này, người ta quan sát thấy thể khảm với dòng thể tam nhiễm 21 hai bố mẹ rối loạn cấu trúc NST khác ( không liên quan đến NST 21 ) NST [2] Khoảng 2-3% trường hợp thể khảm với dòng tế bào : dòng tế bào chứa 46 NST dòng tế bào chứa 47 NST, thừa NST số 21 : 46,XX/47,XY,+21 46,XY/47,XX,+21 thể khảm xảy rối loạn phân ly cặp NST 21 trình phân cắt hợp tử Kết tạo nên dòng tế bào thể tam nhiễm 21 bên cạnh dịng tế bào bình thường, dịng tế bào monosomi 21 bị loại bỏ [2] Khoảng 4-5% trường hợp thể chuyển đoạn, trẻ mắc hội chứng Down thể có 46 NST với NST số 21 NST số 21 thứ chuyển đoạn với NST tâm đầu khác NST ( hay gặp NST số 13,14 15 thuộc nhóm D số 21.22 thuộc nhóm G ) Về triệu chứng lâm sàng không khác so với hội chứng Down thể tam nhiễm 21 thuần, bệnh có tính chất gia đình Bố mẹ đứa trẻ mắc hội chứng Down chuyển đoạn người bình thường mang NST chuyển đoạn cân NST 21 với NST số 13,14,15 (nhóm D) NST số 21,22 ( nhóm G) [2] Bảng : Khả tạo giao tử hợp tử ngƣời mang NST chuyển đoạn NST số 14 NST số 21 [2] Người NST mang chuyển đoạn Thụ tinh Giao tử (+14,21) Hợp tử Kiểu hình - 14,21 +14;21 14,14,21,21 (1) 14t(14;21),21 (2) 14 t(14;21), 21 (3) 14,14,21 (4) 14, 14t(14;21), 21 (5) - t(14;21) - t(14;21)21 14,t(14;21),21 +14,21 - 14 - 14 t(14;21) +14;21 - 21 - 14, t(14;21) 14,21,21 +14;21 -0 (6) 14,14t(14;21),21,21 (7) 14,21 (8) (1): Bình thường (2): Lành mang NST chuyển đoạn (3): Hội chứng Down chuyển đoạn (4): Monosomi NST số 21, chết phôi thai (5): Thể tam nhiễm NST 14, thường chết phôi thai (6): Monosomi NST số 14, chết phôi thai (7): Thể tam nhiễm kép NST 14,21, chết phôi thai (8): Monosomi kép NST 14,21, chết phôi thai Cơ chế di truyền hội chứng Down chuyển đoạn t(21q;22q) tương tự trường hợp hội chứng Down chuyển đoạn t(14q;21q) [2] 1.3.Tỷ lệ mắc bệnh : Hội chứng Down gặp khoảng 1/700-1/800 trẻ sơ sinh Tần số khơng có khác biệt chủng tộc tầng lớp xã hội giới Theo nghiên cứu gần , tỷ lệ trẻ sơ sinh mắc hội chứng Down tỷ lệ với tuổi người mẹ [2]: Ước tính tỷ lệ bị hội chứng Down (Cơng trình nghiên cứu tiểu bang New York)[15] Tuổi người mẹ Tỷ lệ ước tính 20 1/1925 25 1/1205 30 1/885 33 1/590 35 1/365 36 1/285 38 1/175 40 1/110 45 1/32 49 1/12 Ngoài ra, tuổi người bố ảnh hưởng tới tần số sinh mắc hội chứng Down [2] 1.4.Triệu chứng lâm sàng : Hội chứng Down có biểu điển hình dễ nhận biết : Đầu nhỏ , ngắn , mặt tròn , gốc mũi tẹt , khe mắt xếch , nếp quạt , hẹp , vòm cung cao , lưỡi to dày hay nứt nẻ , thường thè ngồi làm cho miệng khơng đóng kín ( nửa mở )[2] Tai nhỏ , có biến dạng , vị trí thấp [2] Cổ ngắn , gáy phẳng rộng [2] Bàn tay rộng , ngón ngắn [2] Chậm phát triển trí tuệ , số IQ trung bình khoảng 30-50 Giảm trương lực nhão dây chằng [2] Nếp vân da bàn tay : nếp ngang lịng bàn tay, gặp bàn tay Chạc ba trục vị trí cao thường gặp vị trí t” Tần số hoa vân mô út tăng[ 2] Thường gặp dị tật tim, tần số xếp theo thứ tự thơng liên thất , thơng liên nhĩ , cịn ống động mạch Dị tật tiêu hoá : chủ yếu hẹp tá tràng , khơng hậu mơn phình to đại tràng ( Megacolon ) [2] 1.5.Tiên lƣợng : Người mắc hội chứng Down thường bị chết sớm tật tim tật ống tiêu hoá, thường bị nhiễm khuẩn, thường dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu Trước khoảng 50% chết vòng năm đầu, số sống sót đến tuổi trưởng thành Hiện điều kiện xã hội, chăm sóc y tế cải thiện nên bệnh nhân Down sống đến giai đoạn trưởng thành nhiều hơn, có số bệnh nhân nữ sinh Nam mắc hội chứng Down vơ sinh [15,17] 1.6.Chẩn đốn hội chứng Down : Hội chứng Down chưa có khả chữa Vì vậy, nên chẩn đoán trước sinh nhằm hạn chế sinh đứa trẻ mắc hội chứng Down 1.6.1.Đối tƣợng cần chẩn đoán trƣớc sinh : + Tuổi cặp vợ chồng, tuổi vợ ( ≥ 35 tuổi ) + Các cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp đẻ dị tật, đặc biệt đẻ mắc hội chứng Down + Vợ hay chồng người mang NST chuyển đoạn cân : 45,XX(XY),t(Dq;21q) 45,XX(XY),t(21q;Gq) + Vợ chồng có tiếp xúc với tác nhân gây đột biến : chất phóng xạ , hố chất , …[2] 1.6.2.Các phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh : + Xét nghiệm sàng lọc ( Triple test ) huyết mẹ :  AFP: Alpha feto protein  HCG: Human chorionic gonadotropin  uE3: Unconjugated estriol (Estriol không liên hợp) Nếu người mẹ mang thai mắc hội chứng Down αFP uE3 giảm, βHCG tăng + Siêu âm thai : tuần thứ 11 , 21 31 thai nhi Siêu âm thai chẩn đốn hội chứng Down dựa vào dấu hiệu như: khoảng sáng sau gáy ≥ 3mm tháng đầu, ngắn xương cánh tay, xương đùi kèm theo dị tật tim, đa ối,… + Sinh thiết tua rau để phân tích NST.Sinh thiết tua rau sử dụng phương pháp gây tỷ lệ sảy thai cao ( 2-3%) [2] + Nuôi cấy tế bào ối để phân tích NST Hiện nước ta, phương pháp chẩn đốn sau để xác định xác thai nhi có mắc hội chứng Down hay khơng Tế bào ối sau nuôi cấy xác định karyotype phương pháp nhuộm băng G để chẩn đoán trisome 21 Trong năm gần đây, kỹ thuật PCR có thành tựu lớn y học giúp người chẩn đốn nhiều bệnh di truyền thông qua việc phân lập khuếch đại gene gây bệnh, việc chẩn đoán hội chứng Down Chúng ta xác định nhiều gene NST 21 gây nên hội chứng Down : APP ( Amyloid beta A4 precusor protein ), DYRK ( Dual-specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A), IFNAR ( Interferon, Alpha, Beta, and Omega, Receptor ), DSCR1( Down Syndrome Critical Regional Gene 1),… có gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1) Chúng ta tiến hành chọc ối bà mẹ mang thai ( thời gian chọc ối tốt khoảng thai 16-19 tuần tuổiphương pháp chọc ối kinh điển ), sau tế bào ối đem ni cấy, tách chiết DNA thực phản ứng PCR để xác định gene đặc hiệu, sau đánh giá kết sau so sánh với mẫu bình thường để đánh giá kết Trong tương lai, kỹ thuật PCR đánh giá phương pháp chủ yếu để chẩn đốn trước sinh hội chứng Down [16] 2.Tình hình nghiên cứu hội chứng Down : 2.1.Trên giới : Trên giới có nhiều nghiên cứu hội chứng Down Trước , nước tiên tiến áp dụng chủ yếu để chẩn đoán hội chứng Down phương pháp điểm huyết Rất nhiều nghiên cứu đưa nhằm ngày hoàn thiện phương pháp Tại Châu Âu, Anh Quốc xem nước đầu nghiên cứu xét nghiệm tầm soát hội chứng Down từ khởi thủy Trước Integrated test đời, Double test, sau Triple test xét nghiệm ưa chuộng Châu Âu Tại Pháp, hội nghị chẩn đoán tiền sản 2002, 10 DNA khuôn (mỗi mẫu dã tách chiết được) Nước cất vừa đủ 4,9 Tổng số 10 Ghi chú: DNA khuôn ban đầu ghi mang tính chất ước lượng, đảm bảo thể tích mẫu chạy PCR 10 µl, tuỳ thuộc vào nồng độ DNA thu mà ta cho tương ứng (kèm theo thay đổi lượng nước để đảm bảo thể tích mẫu chạy PCR 10 µl) Sao cho lượng DNA cho vào phản ứng PCR tương đương Cụ thể xem bảng 10 Trộn đều, cho vào máy PCR chạy với chu trình nhiệt sau: Bảng 7: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gene SOD -1 Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 940C phút 940C 30 giây 550C 30 giây 720C 30 giây 720C phút 40C 35 Vô (nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng) 42  Sau chạy PCR, điện di kiểm tra: – Trên gel Agarose 1,5% – Hiệu điện điện di 110 V (dòng chiều) – Cường độ 500 mA – Thời gian 20 phút – Dung dịch đệm điện di TAE 1X – Dùng marker để xác định kích thước băng DNA sau PCR CHƢƠNG III : KẾT QUẢ Kết đo mật độ quang học dịch DNA tách chiết từ tế bào ối : Chúng tơi sử dụng quy trình cũ ( trình bày phần 2.1.2 ) để tách chiết mẫu tế bào ối số Mẫu số 3, tách chiết DNA theo quy trình thay đổi ( trình bày phần 2.1.3 ) Sau đem mẫu DNA thu đo mật độ quang mẫu DNA thu bước sóng 260 nm/280 nm, thể tích đo 100 µl, độ pha lỗng 50 lần Kết trình bày bảng : Bảng : Mật độ quang học dung dịch DNA tách chiết Mẫu Nồng độ DNA Độ tinh ( µg/ml ) (OD260/OD280) 87 Ghi Mẫu tế bào ối bình thường, chưa thay 0,9667 đổi quy trình 43 98 Mẫu tế bào ối bình thường, chưa thay 0,9635 đổi quy trình 137 Mẫu tế bào ối bình thường, thay đổi 0,9831 quy trình 120 Mẫu tế bào ối bình thường, thay đổi 0,9756 quy trình 124 0,9818 Mẫu tế bào ối nghi bệnh, thay đổi quy trình Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ tế bào ối trƣớc sau thay đổi quy trình : Chúng đem mẫu DNA thu sau tách chiết điện di DNA tổng số : Thể tích điện di: 11 µl/ giếng, hiệu điện 110 V (nguồn chiều), cường độ dòng: 500 mA, thời gian: 30 phút, gel Agarose 0,8% (gel bổ sung Ethidium bromide trước lúc đổ thạch) Kết trình bày hình : 44 Hình : Hình ảnh điện di DNA tổng số mẫu DNA tách chiết ( số thứ tự giếng tương ứng với số thứ tự mẫu ) Giếng 1,2,3,4 : DNA tách chiết từ tế bào ối nuối cấy bình thường Giếng : DNA tách chiết từ tế bào ối nuối cấy bị hội chứng Down Nhận xét : hình ảnh điện di cho thấy - Các band sáng gọn, vệt sáng phía sau mờ chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, DNA khơng bị đứt gãy tạp chất - Độ đậm band sau sáng so với band trước chứng tỏ band sau có nồng độ DNA cao hơn, điều phù hợp với kết đo mật độ quang Từ kết thấy DNA tách chiết hồn tồn đủ điều kiện để làm DNA khn cho phản ứng PCR Kết chạy PCR cho GAPDH với DNA khn mẫu 3,4,5: Tổng thể tích chạy PCR 10 µl/ mẫu Trong nồng độ mồi thể tích thành phần cho phản ứng nhau, thể tích DNA cho vào tất mẫu Các điều kiện phản ứng đồng tất mẫu, kết PCR phụ thuộc vào chất lượng DNA tách chiết Sau chạy PCR, điện di kiểm tra gel agarose 1,5%, điện 110 V, cường độ 500 mA, thời gian 20 phút, thể tích 10 µl/ giếng Bảng : Bảng ghi mẫu chạy PCR với cặp mồi GAPDH Giếng Mẫu Ghi Mẫu tế bào ối bình thường 45 Mẫu tế bào ối bình thường Mẫu tế bào ối nghi bệnh Marker 100 bp M 400 300 200 100 Hình : Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi GAPDH với khuôn DNA mẫu tách chiết Nhận xét : Nhìn hình ảnh điện di cho thấy mẫu chạy PCR có sản phẩm Đậm độ sáng band tương đương Chứng tỏ mẫu DNA tách chiết có chất lượng tốt đảm bảo cho phản ứng PCR khơng có khác biệt lượng DNA sử dụng phản ứng Kết chạy điện di exon gene SOD-1 với DNA mẫu 3, : Tổng thể tích chạy PCR 10 µl/ mẫu Trong nồng độ mồi thành phần cho vào phản ứng nhau, lượng DNA cho vào mẫu tương đương nồng độ Các điều kiện phản ứng đồng tất mẫu, kết PCR phụ thuộc vào lượng gene SOD-1 có DNA khn tách chiết đựơc Sau chạy PCR, điện di kiểm tra gel Agarose 1,5%, điện 100 V, cường độ 500mA, thời gian 15 phút, thể tích 10 µl/ giếng Kết trình bày bảng 10 hình : Bảng 10 : Bảng ghi mẫu chạy PCR với primer gene SOD-1 lần 46 Giếng Mẫu Thể tích DNA mẫu ban đầu để chạy PCR ( µl ) Ghi 1,5 Mẫu tế bào ối bình thường 1,5 Mẫu tế bào ối bình thường 1,5 Mẫu tế bào ối nghi bệnh M 100 bp M Hình : Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng exon gene SOD-1 lần Nhận xét : 47 - Hình ảnh điện di cho ta thấy : band số có độ sáng tương đương nhau, band số có độ sáng kích thước band hẳn band số - Nhưng thấy độ sáng band số chưa đạt yêu cầu nên tiếp tục tiến hành điện di sản phẩm PCR lần với thể tích DNA mẫu tăng lên để cho độ sáng band vừa đủ độ sáng band không sáng để so sánh nhận định kết Quy trình kết trình bày bảng 11 hình : Bảng 11 : Bảng ghi mẫu chạy PCR với primer gene SOD-1 lần Giếng Mẫu Thể tích DNA mẫu ban đầu để chạy PCR ( µl ) Ghi Mẫu tế bào ối bình thường Mẫu tế bào ối bình thường Mẫu tế bào ối nghi bệnh M 100 bp M M 48 Hình : Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng exon gene SOD-1 lần Nhận xét : - Hình ảnh điện di cho ta thấy : band số có độ sáng tương đương nhau, band số có độ sáng kích thước band hẳn band số - Lúc độ sáng band 3, đạt yêu cầu Như vậy, từ kết điện di sản phẩm PCR exon gene SOD-1 đến kết luận chung sau: band sản phẩm PCR gene SOD-1 mẫu mẫu DNA tách chiết từ tế bào ối có rối loạn NST gây hội chứng Down có kích thước đậm độ sáng lớn so với band mẫu sản phẩm PCR gene SOD-1 mẫu DNA tách từ tế bào ối khơng có rối loạn NST Chứng tỏ lượng sản phẩm PCR hay luợng gene đích ban đầu mẫu nhiều so với mẫu CHƢƠNG IV : BÀN LUẬN Về kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối ni cấy hóa chất tự pha : Tách chiết DNA từ tế bào ối theo quy trình hóa chất tự pha nói Chương có số ưu điểm như: độ xác cao, làm nhiều mẫu 49 lúc, chi phí khơng cao So với số biện pháp tách chiết tham khảo bước làm tủa protein, phương pháp có ưu điểm phương pháp tủa protein muối vì: Tủa protein hỗn hợp phenol, chloroform, isoamyl nên DNA thu lẫn muối dùng CH3COONa 3M với tỷ lệ 1/10 thể tích dịch DNA thu được, cộng với 2,5 lần thể tích cồn 100% cho thêm vào để tủa DNA, nên DNA lẫn muối thấp Còn phương pháp tủa protein NaCl bão hòa (5M), DNA thu lẫn muối nhiều thể tích NaCl đưa vào chiếm khoảng gần 1/2 lượng dịch sau xử lý với proteinase K, nên DNA thu lẫn muối nhiều Việc DNA lẫn muối làm ảnh hưởng tới thí nghiệm tiếp sau như: điện di, PCR, đơn giản gây sai số đo mật độ quang Bên cạnh cịn có số khuyết điểm như: Mất nhiều thời gian phải để mẫu qua đêm bước tủa DNA, sử dụng phenol nên không tốt cho sức khỏe, độ tinh DNA chưa cao Nhưng kỹ thuật có nhiều ưu điểm : sử dụng hóa chất tự pha nên giá thành rẻ, phù hợp với điều kiện Việt Nam, tiến hành nhiều mẫu lúc, lượng DNA thu sau tách chiết cao,… Đánh giá thử nghiệm thay chúng tơi thấy có nhiều điểm đáng ý Đầu tiên việc thay bước 1.2, thay sử dụng máy ly tâm thường ly tâm 3500 vòng/ph x 10 thành ly tâm máy ly tâm có tay văng, ly tâm 5000 vịng/ph nhiệt độ 40C ( ly tâm ống nghiệm nằm song song với mặt đất nên lượng mẫu tập trung đáy nhiều hiệu sau ly tâm thu cao hơn, đồng thời ly tâm nhiệt độ 40C giúp DNA không bị đứt gãy bảo quản tốt ) bước 3.4 thay ly tâm với vận tốc 10.000 vịng/phút chuyển thành 13.000 vịng/phút chúng tơi thấy lượng dịch để hút nhiều hơn, Chúng tơi tính đến việc tăng vận tốc ly tâm khiến 50 DNA dễ bị đứt gãy, với vận tốc ly tâm thay đổi quy trình nằm giới hạn cho phép để DNA không bị đứt gãy thực tế đánh giá kết DNA thu qua đo mật độ quang, điện di DNA tổng số : hình ảnh điện di DNA tổng số cho thấy band sáng gọn, vệt sáng phía sau mờ chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, DNA khơng bị đứt gãy Vì quy trình tách chiết đạt yêu cầu để tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Về sản phẩm PCR gene GAPDH : Gene GAPDH gene mã hóa tổng hợp enzym GAPDH, nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, vị trí 12p13, chiều dài khoảng 300kb Đây gene thể tất loại tế bào thể, không phụ thuộc vào loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc tế bào Do gene dùng gene nội chuẩn để đánh giá chất lượng DNA tách chiết so sánh lượng DNA mẫu sử dụng phản ứng PCR Kết khuếch đại gene GAPDH thể hình ảnh điện di cho thấy band có đậm độ sáng tương đương Từ đó, kết luận DNA mẫu tách chiết có chất lượng tốt đảm bảo cho phản ứng PCR tiếp theo, đồng thời khơng có khác biệt nồng độ DNA mẫu tham gia phản ứng PCR Về sản phẩm PCR exon gene SOD-1 : 51 Gene SOD-1 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 21, với exon theo thứ tự từ đến có chiều dài khác Là gene quy định tổng hợp enzym SOD-1, có liên quan tới hội chứng Down trình bày phần chương I Người mắc hội chứng Down có nhiễm sắc thể số 21, gấp 1,5 lần so với người bình thường (có nhiễm sắc thể số 21) Lượng gene SOD-1 kéo theo tăng gấp 1,5 lần Với hàm lượng DNA tổng số số NST 21 mẫu tế bào ối Down nhiều mẫu bình thường khoảng 1,5 lần Ở phần 4.2.2 chương I trình bày, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Trong điều kiện đồng mẫu tổng thể tích chạy PCR, nồng độ đệm MgCl2, dNTP, Taq polymerase, nồng độ cặp mồi, nồng độ chất lượng DNA tổng số tách chiết từ tế bào ối, chu trình nhiệt số chu kỳ phản ứng Thì lượng sản phẩm phản ứng PCR theo thời gian phụ thuộc vào số lượng vùng gene đích ban đầu Quay trở lại phần động học phản ứng PCR Ở giai đoạn phản ứng có DNA khuôn số lượng lớn cặp mồi Do vậy, tốc độ phản ứng hay lượng sản phẩm tạo phụ thuộc vào số lượng khuôn ban đầu Số lượng khuôn nhiều cho sản phẩm nhiều Và giai đoạn đến sớm Khi lượng gene đích đạt tới mức độ lượng sản phẩm tăng lên theo cấp số nhân Giai đoạn phụ thuộc vào số chu kỳ phản ứng Đến giai đoạn phản ứng đạt độ bão hịa tốc độ phản ứng giảm dần đồ thị động học chuyển dần đường nằm ngang Như vậy, dừng phản ứng trước giai đoạn bão hòa lượng sản phẩm PCR mẫu DNA tế bào ối Down nhiều so với mẫu DNA tế bào ối khơng có rối loạn NST 52 Qua kết PCR exon gene SOD-1 ta thấy tài liệu nghiên cứu đưa : - Giếng : DNA mẫu tế bào ối phụ nữ mang thai bình thường nên màu vạch tương ứng với - Giếng : DNA mẫu tế bào ối phụ nữ mang thai chẩn đoán có nguy mắc hội chứng Down cao, thai nhi có nguy cao bị triosome 21 Do NST thai nhi mang NST số 21 nên lượng gene SOD-1 tế bào thai nhi nhiều tế bào bình thường Vì vạch mẫu đậm hẳn so với mẫu bình thường ( hình ) Tất giếng lấy lượng DNA Chúng thử kiểm tra độ lặp lại kết PCR cách nâng cao lượng DNA mẫu vào giếng lượng DNA giếng Kết thu : giếng ( mẫu không mang bệnh ) vạch tương ứng nhau, giếng ( mẫu bệnh ) vạch đậm hẳn giếng ( hình ) So sánh với lần chạy PCR trước ta thấy tăng lượng DNA mẫu vạch sáng ( so sánh hình ), điều chứng tỏ tăng lượng DNA kết PCR cho vạch sáng hơn, có nghĩa với thai nhi mắc hội chứng Down ( triosome 21 ) có lượng gene SOD-1 nhiều thai nhi bình thường chạy PCR gene SOD-1 cho vạch sáng bình thường, nhận định tài liệu đưa ban đầu 53 Mục tiêu đề tài tìm lượng DNA khn chu trình nhiệt thích hợp đảm bảo cho gene cần tìm biểu tốt Qua thử nghiệm đánh giá kết thu Chúng tơi tìm nồng độ DNA chu trình nhiệt phù hợp Cụ thể sau: – Nồng độ DNA: khoảng 400 µg/ml – Chu trình nhiệt: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 940C phút 940C 30 giây 550C 30 giây 72 C 30 giây 720C phút 40C 35 Vô (nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng) Đây phương pháp để chẩn đoán hội chứng Down thai nhi cách xác tính ổn định độ xác kỹ thuật PCR cao Phương pháp chẩn đoán hội chứng Down thai nhi cách phân tích gene SOD-1 từ tế bào ối bà mẹ mang thai phương pháp Việt Nam Chúng tơi nghiên cứu đề tài hy vọng tìm thêm phương pháp giúp chẩn đoán hội chứng Down thai nhi, phương pháp đại, áp dụng kỹ thuật PCR so với phương pháp phổ biến Việt Nam lập karyotype để xác định nhiễm sắc thể Và giúp việc chẩn đốn hội chứng Down trẻ sơ sinh sớm xác hơn, để gia đình xã hội bớt gánh nặng vật chất tinh thần hội chứng Down gây 54 CHƢƠNG V : KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, đưa số kết luận sau : Kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối ni cấy hóa chất tự pha theo quy trình thay đổi ( vận tốc ly tâm điều kiện ly tâm ) phù hợp lượng DNA thu nhiều chất lượng DNA không thay đổi Ưu điểm kỹ thuật giá thành rẻ, áp dụng rộng rãi số nhược điểm nhiều thời gian so với Kit cần người có trình độ chun mơn tay nghề Việc tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khn, chu trình nhiệt ) cho kết phân tích exon gene SOD-1 rõ ràng, dễ dàng Phân tích so sánh mẫu bình thường mẫu bệnh lý góp phần phát triển kỹ thuật phân tích gene để phục vụ chẩn đoán trước sinh hội chứng Down dễ dàng 55 56