NGHIÊN cứu HOẠT TÍNH SINH học IN VITRO của cây THÂU LĨNH (ALPHONSEA TONKINENSIS a DC ANNONACEAE)

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo Đại Học – Trường Đại học Y Dược Huế tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Ban Chủ nhiệm Khoa, thầy cô cán Khoa Dược quan tâm, giúp đỡ, ủng hộ tạo điều kiện sở vật chất, dụng cụ, trang thiết bị, tài liệu nghiên cứu để em tiến hành thử nghiệm suốt trình thực luận văn Bên cạnh đó, em xin cảm ơn bạn Phan Thị Bích Ngọc bạn nhóm làm đề tài bên cạnh đồng hành, giúp đỡ, trao đổi kiến thức kinh nghiệm suốt trình thực luận văn Em xin cảm ơn quan tâm, động viên to lớn từ gia đình, bạn bè Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Viết Khẩn Người thầy trực tiếp hướng dẫn, ln tận tình bảo, truyền đạt kiến thức bổ ích suốt q trình thực đề tài, người ln khích lệ, truyền cảm hứng để em tâm vượt qua khó khăn thực đề tài cách tốt Mặc dù thân cố gắng để thực đề tài cách hồn chỉnh, thiếu kinh nghiệm kiến thức hạn hẹp nên chắn không tránh khỏi thiếu sót khiếm khuyết Em mong nhận góp ý thầy để luận văn hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thị Oanh Thư LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu kết luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Huế, tháng năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thị Oanh Thư DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AChE Enzyme acetylcholinesterase AD Alzheimer ATCI Acetylthiocholine iodide CH2Cl2 Dichloromethane COX Cyclooxygenase DĐVN Dược điển Việt Nam DMEM Môi trường Dulbecco DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic acid EA Ethyl acetate FBS Huyết thai bò FRAP Phương pháp khử ion sắt III HCl Hydrochloric acid Hep G2 Ung thư gan người (Human heptatocellular carcinoma) HMBC Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết H2O Nước cất 1, lần HSQC Tương tác dị hạt nhân qua liên kết IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) KH2PO4 Potassium dihydrogen phosphate K2HPO4 Potassium hydrogen phosphate MeOH Methanol NaOH Sodium hydroxide NH3 Amoniac NO Nitric oxide NSAIDs Kháng viêm không steroid NT Chất không thử nghiệm (Not test) OD Mật độ quang học SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng SK-LU-1 Ung thư phổi người (Human lung carcinoma) RNS Reactive Nitrogen Species ROS Reactive Oxygen Species SRB Sulforhodamine B STT Số thứ tự TB1 Liriodenine TB2 3-Hydroxy-7,8-dehydro-β-ionone TB3 8-oxopseudopalmatine TB4 N-trans-feruloyltyramine TB5 Pseudopalmatine TB6 Pseudocolumbamine TB7 Stigmasterol TB8 Corydaline TCA Trichloracetic acid WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton C-NMR H-NMR DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Alphonsea Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng đánh giá hoạt tính ức chế AChE 18 Bảng 2.2 Cách pha dung dịch mẫu thử, mẫu đối chứng mẫu trắng 19 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất TB3 chất tham khảo 26 Bảng 3.2 Giá trị IC50 ức chế enzyme AChE dịch chiết loài A tonkinensis 28 Bảng 3.3 Giá trị IC50 ức chế enzyme AChE hợp chất phân lập từ loài A tonkinensis 28 Bảng 3.4 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết lồi A tonkinensis mơ hình trung hịa gốc tự DPPH 29 Bảng 3.5 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ loài A tonkinensis mơ hình trung hịa gốc tự DPPH 29 Bảng 3.6 Hoạt tính gây độc tế bào SK-LU-1 tế bào Hep G2 hợp chất phân lập từ A tonkinensis 30 Bảng 3.7 Hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài A tonkinensis 31 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học số alkaloid phân lập từ chi Alphonsea Hình 1.2 Cơng thức hóa học số steroid phân lập từ chi Alphonsea Hình 1.3 Cơng thức hóa học hai neolignan phân lập từ chi Alphonsea Hình 1.4 Cơng thức hóa học số terpenoid phân lập từ chi Alphonsea Hình 2.1 Hình ảnh thân cây, cành, Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A.DC.) 14 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ A tonkinensis 23 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất TB3 24 Hình 3.3 Cơng thức hóa học tương tác HMBC 8-oxopseudopalmatine 25 Hình 3.4 Sơ đồ chiết xuất dịch chiết hợp chất A tonkinensis 27 Hình 4.1 Khảo sát trình chiết xuất alkaloid sử dụng HCl tartaric acid pH khác 33 Hình 4.2 5,6-dihydrodibenzo[a, g]quinolizinium (C17H14N+) 35 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Alphonsea 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Hoạt tính sinh học 1.1.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư .6 1.1.4.2 Hoạt tính chống oxy hóa 1.1.4.3 Hoạt tính kháng viêm .7 1.1.4.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm .7 1.1.4.5 Hoạt tính kháng kí sinh trùng 1.2 Tổng quan loài Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A.DC.) 1.2.1 Phân loại .8 1.2.2 Đặc điểm thực vật 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Hoạt tính sinh học 1.3 Tổng quan nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) in vitro .9 1.3.1 Acetylcholine (ACh), enzyme acetylcholinesterase giả thuyết vai trò hệ Cholinergic bệnh Alzheimer (AD) .9 1.3.2 Phương pháp nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro 1.4 Tổng quan nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro 10 1.4.1 Tác động gốc tự liên quan đến bệnh tật người 10 1.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro 11 1.5 Tổng quan nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 11 1.5.1 Tổng quan ung thư 11 1.5.2 Phương pháp nghiên cứu gây độc tế bào ung thư in vitro 11 1.6 Tổng quan nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro 12 1.6.1 Tổng quan viêm 12 1.6.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống viêm in vitro 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Hóa chất dung mơi 14 2.3 Trang thiết bị dụng cụ 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp chiết xuất 16 2.4.2 Phương pháp phân lập 16 2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc 17 2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học in vitro 17 2.4.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro 17 2.4.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 18 2.4.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 19 2.4.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 20 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Kết trình chiết xuất phân lập 22 3.1.1 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn 22 3.1.2 Quá trình phân lập phân đoạn 23 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 24 3.2 Kết hoạt tính sinh học 27 3.2.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro 27 3.2.2 Kết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 29 3.2.3 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 30 3.2.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 30 Chương BÀN LUẬN 32 4.1 Về trình chiết xuất, phân lập hợp chất 32 4.1.1 Quá trình chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc 32 4.1.2 Hợp chất phân lập 34 4.2 Về hoạt tính sinh học 35 4.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro 36 4.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro 38 4.2.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 39 4.2.4 Hoạt tính kháng viêm in vitro 40 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, y học có nhiều tiến vượt bậc, bên cạnh đó, tỷ lệ người mắc bệnh mãn tính ung thư, tim mạch, Alzheimer, tiểu đường,… ngày gia tăng có xu hướng trẻ hóa Các thuốc tân dược sản xuất từ hóa chất thơng qua tổng hợp bán tổng hợp sử dụng điều trị cho tác dụng nhanh, hiệu điều trị cao kèm theo tác dụng phụ gây độc thể Từ xưa, nguồn thực vật đóng vai trị quan trọng việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe người Các hợp chất tự nhiên nguồn thành công việc khám phá loại thuốc [35] Liên hệ thực tiễn, Việt Nam có hệ thực vật phát triển phong phú đa dạng với 12000 lồi thực vật có mạch, có 5000 lồi thực vật dùng làm thuốc phân bố rộng khắp nước [7] Đây nguồn tài nguyên tiềm động lực thúc đẩy việc nghiên cứu phát triển hợp chất có hoạt tính sinh học tốt từ dược liệu Mặc dù có nhiều hướng tiếp cận vấn đề nghiên cứu khác trình nghiên cứu thường bắt đầu việc đánh giá số lượng lớn mẫu dược liệu hoạt chất Giai đoạn gọi giai đoạn nghiên cứu sàng lọc Một thuốc đời phải trải qua nhiều giai đoạn, gian nan, tốn nhiều thời gian chi phí Quá trình nghiên cứu sàng lọc loại bỏ mẫu khơng có giá trị thực sự, tuyển chọn mẫu tiềm năng, giúp tiết kiệm thời gian tiền bạc trình nghiên cứu Chi Alphonsea chi nhỏ thuộc họ Na (Annonaceae), phân bố chủ yếu Trung Quốc, khu vực Indo-Malay, Việt Nam, Lào số nước khác Các hợp chất phân lập xác định cấu trúc chi chủ yếu alkaloid, ngồi cịn có nhóm chất steroid, lignan, terpenoid [15] Một số nghiên cứu cho thấy số dịch chiết hay hợp chất phân lập từ loài thuộc chi Alphonsea có hoạt tính sinh học tốt chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm kháng kí sinh trùng [25], [36], [42], [44] Như vậy, thấy Trang web 53 The Plant List (2014), "Alphonsea", truy cập ngày 09-04-2021, trang web http://www.theplantlist.org/ PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Các phổ H-NMR, 13 C-NMR, HMBC, HSQC 8- oxopseudopalmatine (TB3) PHỤ LỤC 2: Kết hoạt tính ức chế enzyme AChE dịch chiết hợp chất có hoạt tính tốt loài Thâu lĩnh A tonkinensis PHỤ LỤC 3: Kết hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hợp chất có hoạt tính tốt lồi Thâu lĩnh A tonkinensis PHỤ LỤC 4: Kết khả ức chế NO hợp chất loài Thâu lĩnh A tonkinensis PHỤ LỤC 5: Kết gây độc tế bào dòng tế bào SK-LU-1 hợp chất loài Thâu lĩnh A tonkinensis PHỤ LỤC 6: Kết gây độc tế bào dòng tế bào Hep G2 hợp chất loài Thâu lĩnh A tonkinensis PHỤ LỤC 1: Các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC 8-oxopseudopalmatine (TB3) Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HMBC Phổ HSQC PHỤ LỤC 2: Kết hoạt tính ức chế enzyme AChE dịch chiết hợp chất có hoạt tính tốt loài Thâu lĩnh A tonkinensis Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Dịch chiết tổng Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc CH2Cl2 Phân đoạn Alc nước Phân đoạn Alc MeOH TB5 TB6 Galantamine \ Nồng độ (μg/mL) 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 50 10 0,4 100 20 0,8 20 0,8 0,16 % ức chế 86,12 35,34 17,03 -2,10 56,67 27,20 10,17 -2,21 75,08 32,27 13,71 -3,95 55,38 27,06 9,05 -2,52 86,64 50,69 24,65 2,68 92,35 71,03 45,84 15,76 91,73 65,46 45,75 16,77 87,79 71,66 58,65 46,61 Phương trình R2 y = 40,487 x – 4,426 0,9291 y = 27,708 x – 3,409 0,9611 y = 36,577x – 5,526 0,9463 y = 27,431 x – 3,861 0,9629 y = 39,766 x +3,326 0,9871 y = 36,479 x + 32,514 0,9941 y = 34,995 x +21,630 0,9952 y = 19,623 x + 61,172 0,9957 Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Dịch chiết tổng Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc CH2Cl2 Phân đoạn Alc nước Phân đoạn Alc MeOH TB5 TB6 Galantamine Nồng độ (μg/mL) 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 50 10 0,4 100 20 0,8 20 0,8 0,16 % ức chế 85,90 34,20 16,48 -2,76 57,57 25,86 11,54 -1,73 74,70 32,63 15,29 -3,60 54,74 28,55 8,65 -3,60 87,23 50,59 25,21 2,88 92,32 71,03 46,82 15,48 91,21 65,25 46,69 17,03 89,10 71,14 57,25 45,47 Phương trình R2 y = 40,586 x – 4,426 0,9250 y = 27,501 x – 2,855 0,9495 y = 35,621x – 3,870 0,9454 y = 27,886 x – 4,449 0,9750 y = 39,766 x +3,689 0,9864 y = 36,420 x + 32,681 0,9922 y = 34,635 x +21,341 0,9940 y = 19,623 x + 61,172 0,9908 Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Dịch chiết tổng Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc CH2Cl2 Phân đoạn Alc nước Phân đoạn Alc MeOH TB5 TB6 Galantamine Nồng độ (μg/mL) 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 100 20 0,8 50 10 0,4 100 20 0,8 20 0,8 0,16 % ức chế 85,80 33,79 15,41 -1,25 57,08 26,36 12,31 -0,94 73,93 32,34 16,62 -3,87 54,13 29,75 10,53 -2,55 86,94 51,08 26,75 3,42 92,99 70,51 46,44 14,32 90,41 66,62 46,24 16,79 89,00 71,71 58,61 45,32 Phương trình R2 y = 39,992 x – 4,616 0,9149 y = 26,921x – 1,904 0,9522 y = 35,642x – 4,1593 0,9515 y = 27,075 x – 2,799 0,9825 y = 39,328 x +4,627 0,9883 y = 37,207 x +31,862 0,9926 y = 34,517 x + 22,172 0,9946 y = 20,619 x + 60,952 0,9952 PHỤ LỤC 3: Kết hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hợp chất có hoạt tính tốt loài Thâu lĩnh A tonkinensis Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc MeOH TB4 Quercetine Nồng độ (μg/mL) 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 12,5 10 7,5 2,5 % ức chế 81,59 62,19 38,90 19,31 2,73 63,63 44,37 28,13 11,45 -5,67 91,11 64,64 41,02 17,76 0,23 75,11 66,48 54,56 38,39 17,46 Phương trình R2 y = 33,319 x + 4,3956 0,9970 y = 28,491 x – 2,8702 0,9992 y = 37,976 x + 1,297 0,9951 y = 83,110 x – 17,233 0,9947 Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc MeOH TB4 Quercetine Nồng độ (μg/mL) 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 12,5 10 7,5 2,5 % ức chế 81,77 61,14 37,22 17,47 1,91 63,16 45,02 28,02 10,21 -4,03 89,27 62,86 40,47 18,41 0,47 76,15 66,71 53,74 39,55 17,47 Phương trình R2 y = 33,874 x + 2,845 0,9950 y = 28,104 x – 2,353 0,9984 y = 36,883 x + 1,839 0,9955 y = 83,595 x – 17,303 0,9942 Lần Tên dịch chiết/ hợp chất Phân đoạn Alc pH9 Phân đoạn Alc MeOH TB4 Quercetine Nồng độ (μg/mL) 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 200 50 12,5 3,125 0,781 12,5 10 7,5 2,5 % ức chế 81,66 60,38 37,22 18,21 1,09 63,41 44,56 28,59 10,83 -5,26 91,43 65,57 41,79 18,95 1,66 74,76 65,07 53,87 37,82 16,95 Phương trình R2 y = 33,770 x + 2,670 0,9967 y = 28,416 x – 2,741 0,9993 y = 37,567 x + 2,672 0,9951 y = 82,686 x – 17,591 0,9943 PHỤ LỤC 4: Kết khả ức chế NO hợp chất loài Thâu lĩnh tonkinensis Tên TB1 TB2 TB3 TB4 TB5 TB6 TB7 TB8 L-NMMA 100 μg/mL 65,54 89,90 82,61 45,29 17,98 2,05 55,53 0,23 92,17 % ức chế nồng độ 20 μg/mL μg/mL 27,54 8,65 86,48 41,65 17,52 5,23 -1,59 -2,05 4,32 -3,41 -1,14 -2,50 23,87 7,97 -2,28 -5,92 80,98 37,55 0,8 μg/mL 2,11 27,08 -3,26 -4,32 -3,87 -5,69 -7,29 -8,42 15,33 A PHỤ LỤC 5: Kết gây độc tế bào dịng tế bào SK-LU-1 hợp chất lồi Thâu lĩnh A tonkinensis Tên TB1 TB2 TB3 TB4 TB5 TB6 TB7 TB8 Ellipticine 100 μg/mL 19,93 89,22 92,71 28,82 19,63 23,34 36,52 27,76 10 μg/mL 91,17 % ức chế nồng độ 20 μg/mL μg/mL -2,89 73,71 12,39 52,48 11,68 9,10 5,68 10,75 16,19 28,76 μg/mL 0,4 μg/mL 80,48 50,22 0,8 μg/mL 8,20 -3,01 0,08 μg/mL 24,98 PHỤ LỤC 6: Kết gây độc tế bào dịng tế bào Hep G2 hợp chất lồi Thâu lĩnh A tonkinensis Tên TB1 TB2 TB3 TB4 TB5 TB6 TB7 TB8 Ellipticine 100 μg/mL 19,18 89,15 96,13 22,26 26,68 19,17 21,66 33,59 10 μg/mL 103,80 % ức chế nồng độ 20 μg/mL μg/mL 10,10 87,57 5,80 57,64 17,64 6,00 -0,86 6,06 12,78 13,00 μg/mL 0,4 μg/mL 86,90 49,17 0,8 μg/mL -1,54 7,00 0,08 μg/mL 22,02 ... Rutaceae, Apaveraceae, Berberidaceae, Fumariaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Annonaceae họ Magnoliaceae Convolvulaceae Chiếm khoảng 25% tất alkaloid tự nhiên biết đến có nhiều hoạt tính sinh. .. chung, nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Alphonsea cịn hạn chế 1.2 Tổng quan loài Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A. DC. ) 1.2.1 Phân loại Alphonsea tonkinensis A. DC có tên Việt Nam Thâu lĩnh hay... Selected Plant Families) cơng bố chi Alphonsea có 38 lồi [53] Trong đó, có lồi phân bố Việt Nam A boniana, A tonkinensis, A gaudichaudiana, A squamosa, A philastreana, A sonlaensis A hainanensis