Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN7607 2007 Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7607 2007 THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒ[.]
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7607 : 2007 THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN – PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PROTEIN Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products – Protein based methods Lời nói đầu TCVN 7607:2007 hồn tồn tương đương với ISO 21572:2004 đính kỹ thuật 1:2005; TCVN 7607:2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen thực để sàng lọc, nhận dạng định lượng sinh vật biến đổi gen sản phẩm chúng chất biết Để phát thành phần nguồn gốc biến đổi gen, nguyên tắc phương pháp dựa vào protein để: - Lấy mẫu đại diện chất nền; - Tách chiết protein; - Phát và/hoặc định lượng protein đặc thù có nguồn gốc sinh vật biến đổi gen nghiên cứu; Khi phương pháp đánh giá có hiệu lực chấp nhận, chúng đưa vào phụ lục tiêu chuẩn THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN – PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PROTEIN Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products – Protein based methods Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung tiêu chí thực phương pháp phát và/hoặc định lượng protein đặc thù chiết từ thực vật biến đổi gen có chất cụ thể Các hướng dẫn chung đề cập đến phương pháp dựa kháng thể diện Các phương pháp khác mô tả Phụ lục A phát protein Các tiêu chí tương tự đưa tiêu chuẩn thường áp dụng Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi ISO 21568, Foodstuffs – Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products – Sampling (Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Lấy mẫu) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Các thuật ngữ chung 3.1.1 Mẫu (Sample) Một nhiều đơn vị mẫu lấy từ quần thể dùng để cung cấp thông tin sản phẩm [ISO 3534-1:1993] 3.1.2 Mẫu phòng thử nghiệm (laboratory sample) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Mẫu dùng để kiểm tra thử nghiệm phòng thử nghiệm 3.1.3 Mẫu thử (phần mẫu thử) (test sample) (test portion) Mẫu chuẩn bị để thử nghiệm phân tích, tồn khối lượng sử dụng lần để phân tích thử nghiệm [ISO 3534-1:1993] 3.1.4 Chất (matrix) Tất thành phần có chất phân tích mẫu Mỗi chất có tên riêng để phân loại 3.1.5 Biến tính protein (denaturation of proteins) Việc xử lý hóa chất (sinh học) và/hoặc phương pháp vật lý để phá hủy biến đổi cấu trúc chất phân tích Sự biến tính làm biến đổi cấu trúc, chức năng, đặc tính enzym kháng nguyên protein 3.2 Thuật ngữ liên quan đến kháng thể 3.2.1 Kháng thể (antibody) Protein (globulin miễn dịch) tế báo bạch huyết B (tế báo lympho) sinh tiết phản ứng với phân tử coi ngoại lai (kháng nguyên) Mỗi kháng thể có khả liên kết với kháng nguyên định 3.2.2 Kháng nguyên (antigen) Chất hệ thống miễn dịch coi ngoại lai tạo phản ứng miễn dịch 3.2.3 Dịng vơ tính (clone) Quần thể tế bào giống hệt chiết từ tế bào đơn dòng 3.2.4 Phản ứng chéo (cross-reactivity) Sự liên kết kháng thể với chất chất phân tích ban đầu cần quan tâm 3.2.5 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) Kháng thể tạo từ dịng vơ tính lai đơn kết hợp với yếu tố định kháng nguyên 3.2.6 Kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) Kháng thể tạo từ vài dịng vơ tính tế bào bạch huyết 3.2.7 Tính đặc hiệu kháng thể (specificity of an antibody) Khả kháng thể để liên kết đặc hiệu với yếu tố định kháng nguyên không liên kết với cấu trúc tương tự khác kháng nguyên khác 3.3 Thuật ngữ liên quan đến kỹ thuật 3.3.1 Chất cộng hợp (conjugate) Chất tạo việc gắn kết hai nhiều chất với CHÚ THÍCH Các kháng thể cộng hợp với chất phát huỳnh quang (ví dụ, hạt màu), chất đánh dấu đồng vị phóng xạ, với enzym thường sử dụng phép thử miễn dịch 3.3.2 Lai protein (Western blotting) Chuyển kháng nguyên (nghĩa protein có liên quan), sau tách điện di, sang bề mặt liên kết Kháng nguyên quan sát kháng thể đánh dấu đồng vị phóng xạ đặc trưng kháng thể cộng hợp với enzym 3.3.3 Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA – enzyme linked immunosorbent assay) Phép thử ống nghiệm (vitro) dựa kết hợp kháng thể có gắn enzym với chất để tạo sản phẩm có màu Tùy thuộc vào áp dụng mà phép phân tích sử dụng cho mục đích định tính định lượng 3.3.4 Bộ thử (test kit) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Một gồm hóa chất, vật liệu hướng dẫn sử dụng, đóng gói chung dùng cho phép đo vitro để phát chất cần phân tích định 3.3.5 Dạng que nhúng (dip stick format) Dùng để định tính nhanh, bao gồm dải nằm ngang mà kháng thể chất phân tích phủ lên bề mặt rắn 3.4 Thuật ngữ liên quan đến kiểm soát 3.4.1 Mẫu chuẩn (reference material) Vật liệu chất có hay nhiều giá trị tính chất xác định đủ đồng tốt để hiệu chuẩn thiết bị, đánh giá phương pháp đo để ấn định giá trị vật liệu 3.4.2 Chuẩn (standard) Vật đo, phương tiện đo, mẫu chuẩn hệ thống đo để định nghĩa, thể hiện, trì tái tạo đơn vị hay nhiều giá trị đại lượng để dùng làm làm chuẩn để chuẩn bị đặc tính biết 3.5 Thuật ngữ liên quan đến xác nhận hiệu lực 3.5.1 Độ xác (accuracy) Mức độ gần kết thử nghiệm giá trị quy chiếu chấp nhận CHÚ THÍCH Khi áp dụng thuật ngữ độ xác cho kết thử bao gồm kết hợp thành phần ngẫu nhiên với sai số hệ thống phần sai lệch [ISO 3534-1:1993] 3.5.2 Độ chụm (precision) Mức độ gần kết thử nghiệm độc lập nhận điều kiện quy định CHÚ THÍCH Độ chụm phụ thuộc vào phân bố sai số ngẫu nhiên không liên quan tới giá trị thực giá trị xác định CHÚ THÍCH Thước đo độ chụm thường thể độ phân tán tính tốn độ lệch chuẩn kết thử nghiệm Độ chụm thấp độ lệch chuẩn lớn CHÚ THÍCH “Các kết thử nghiệm độc lập” có nghĩa kết nhận theo cách không bị ảnh hưởng kết trước đối tượng thử tương tự Thước đo định lượng độ chụm phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện quy định Điều kiện lặp lại điều kiện tái lập tập hợp cụ thể điều kiện bắt buộc [ISO 3534-1:1993] 3.5.3 Độ sai lệch (bias) Ước tính sai lệch hệ thống (thích hợp), sai lệch kết đo so với kết thực mẫu xác định 3.5.4 Độ nhạy (sensitivity) Khả ghi thay đổi nhỏ nồng độ chất vật liệu thử Trong trường hợp này, độ nhạy thường lượng nhỏ nồng độ chất phân tích mà nhận biết từ mẫu 3.5.5 Tính đặc trưng (specificity) Đặc tính phương pháp để phản ánh cách đặc điểm hay chất cần phân tích định nghĩa tiêu chuẩn Codex 3.5.6 Giới hạn phát (LOD) (limit of detection) (LOD) Lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu chất phân tích mẫu thử phát không cần thiết phải định lượng, chứng minh thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác [1] [2] 3.5.7 Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) (LOQ) (Qui trình phân tích) nồng độ nhỏ hay lượng chất phân tích nhỏ mẫu thử mà định lượng với mức chấp nhận độ chụm độ xác, chứng minh LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp theo TCVN 6910 ISO 5725 [2], [3] 3.5.8 Khoảng áp dụng (khoảng định lượng/tuyến tính/ khoảng biến động) (applicability range (range of quantification/linearity/dynamic range) 3.5.9 Giới hạn lặp lại [tái lập] [repeatability (reproducibility) limit] Giá trị mà độ lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm nhận điều kiện lặp lại (hoặc tái lập) nhỏ giá trị với xác suất 95 % CHÚ THÍCH Ký hiệu r [R] [ISO 3534-1] Khi kiểm tra hai kết thử đơn lẻ thu điều kiện lặp lại [tái lập] phép so sánh phải thực với giới hạn lặp lại [tái lập] r [R] = 2,8 s r [sR] 3.5.10 Độ tái lập (reproducibility) Độ chụm điều kiện tái lập [ISO 3534-1:1993] 3.5.11 Điều kiện tái lập (reproducibility conditions) Điều kiện mà kết thử nghiệm nhận phương pháp, mẫu thử giống hệt phòng thử nghiệm khác nhau, với người thao tác khác nhau, sử dụng thiết bị khác [ISO 3534-1:1993] 3.5.12 Độ lặp lại (repeatability) Độ chụm điều kiện lặp lại [ISO 3534-1:1993] 3.5.13 Điều kiện lặp lại (repeatability conditions) Điều kiện mà kết thử nghiệm độc lập nhận với phương pháp, mẫu thử giống hệt nhau, phòng thí nghiệm, người thao tác, sử dụng thiết bi, khoảng thời gian ngắn [ISO 3534-1:1993] 3.5.14 Độ lệch chuẩn lặp lại [tái lập] [repeatability (reproducibility) standard deviation] Độ lệch chuẩn kết thử nghiệm nhận điều kiện lặp lại [tái lập] CHÚ THÍCH Đây thước đo phân tán phân bố kết thử nghiệm điều kiện lặp lại [tái lập] Tương tự, “phương sai lặp lại” “hệ số biến thiên lặp lại” [tái lập] xác định sử dụng làm phép đo phân tán kết thử nghiệm điều kiện lặp lại [tái lập] 3.5.15 Độ thu hồi (recovery) Khả đo thu hồi lượng biết chất phân tích từ mẫu pha trộn dải định lượng Nguyên tắc Protein đích chiết theo qui trình mơ tả cho chất cụ thể kháng thể đặc hiệu dùng để phát đo nồng độ protein mẫu Thuốc thử Trong suốt q trình phân tích sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước khử ion nước tinh lọc có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác Các loại thuốc thử khác, kháng thể, chất cộng hợp, chất, dung dịch hãm dung dịch đệm đặc trưng phương pháp Cần tham khảo phương pháp loại thuốc thử đặc trưng liên quan protein chuẩn mẫu chuẩn, kháng thể phủ lên bề mặt rắn dạng tự do, thuốc thử kiểm chứng mẫu thử Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ qui định A.5 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Lấy mẫu Việc lấy mẫu qui định chi tiết ISO 21568 Cách tiến hành 8.1 Khái quát Các điều kiện bảo quản hạn sử dụng kháng thể, chất liên kết, mẫu, v.v… theo qui định nhà sản xuất Để sử dụng tiêu chuẩn này, cần tuân thủ yêu cầu chung đảm bảo chất lượng phịng thử nghiệm (ví dụ: liên quan đến hiệu chuẩn thiết bị, xác định kép, phép thử trắng, sử dụng mẫu chuẩn, dựng đường chuẩn v.v…) Cần làm dụng cụ tiếp xúc trực tiếp với mẫu để tránh nhiễm bẩn Sử dụng dụng cụ phịng thử nghiệm thích hợp, có khả liên kết protein thấp (ví dụ: ống polypropylen) để ngăn ngừa hấp thụ protein suốt trình thử nghiệm 8.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu Khi thu mẫu đại diện, xem qui trình chuẩn bị mẫu cụ thể phụ lục A Nghiền mẫu theo qui định trước lấy phần mẫu thử, cần Bột/bột mì có đặc tính trương nở cần phải lấy gấp đơi thể tích dung dịch chiết Các mẫu phòng thử nghiệm chứa hàm lượng chất béo cao khó đồng cần phải chiết lượng mẫu thử lớn Nếu thích hợp, xem hướng dẫn phụ lục A Cân lượng thích hợp mẫu phân tích đại diện để thiết lập phần mẫu thử Cho dung dịch chiết vào đồng hóa trộn 8.3 Tách chiết Sử dụng qui trình tách chiết thích hợp chất Các điều kiện thích hợp cho qui trình tách chiết/pha loãng phần mẫu thử, chất kiểm chứng mẫu chuẩn nêu phụ lục A Cẩn thận sử dụng qui trình tách chiết thích hợp chất cần, bổ sung chất cộng hợp dung dịch đệm đặc biệt để giúp cho trình tách chiết protein (ví dụ: bổ sung chất cộng hợp tanin phân tích sơcơla đen) 8.4 Chuẩn bị đường chuẩn Để dựng đường chuẩn, khuyến cáo sử dụng mẫu chuẩn mẫu chuẩn đánh giá phù hợp chất 8.5 Qui trình phân tích Tùy theo qui trình chọn Phụ lục A tiêu chuẩn này, mà chọn số lượng hàng giếng/phép thử/v.v… loạt dung dịch mẫu thử cần phân tích kể phép thử trắng, chất đối chứng, chất chuẩn, chất kiểm soát bổ sung dung dịch mẫu thử, dung dịch chuẩn v.v… tối thiểu cần thực hai lần song song, pha loãng cách để phân tích Tùy theo phương pháp chọn, trộn nhẹ phản ứng xảy nhiệt độ thời gian định Nếu cần, kết thúc phản ứng theo phương pháp mô tả Phụ lục Sự ổn định tín hiệu sau thay đổi Đọc kết thời điểm qui định phụ lục Diễn giải biểu thị kết 9.1 Khái quát Các thông số cần diễn giải dao động phụ thuộc vào phép thử định tính, bán định lượng định lượng Đối với phép thử định lượng, hệ số biến thiên giá trị mật độ quang phát sinh từ phép đo lặp lại dung dịch mẫu thử, nhìn chung, không vượt 15 % Hệ số biến thiên nồng độ tính tốn từ phép đo lặp lại dung dịch mẫu thử, nhìn chung, không vượt 20 % Nếu giới hạn % hệ số biến thiên bị vượt quá, phép phân tích cần thực lại dung dịch mẫu thử chuẩn bị Trong trường hợp này, để thiết lập hệ số biến thiên, cần tiến hành ba phép xác định (ví dụ: giá trị từ giếng thử) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Khơng thể khẳng định khơng có mặt sinh vật biến đổi gen mẫu cần phân tích Các kết âm tính báo cáo “khơng có giới hạn phát hiện”, “nhỏ giới hạn phát hiện” Các kết dương tính thấp giá trị giới hạn định lượng phải báo cáo dương tính giới hạn phát giới hạn định lượng 9.2 Phân tích định lượng bán định lượng Các thông số sau đánh giá: liệu thô (các giá trị số liên tục) dung dịch mẫu thử, mẫu thử trắng, mẫu chuẩn chuẩn phân tích mẫu đối chứng âm, % hệ số biến thiên phép thử kép, % hệ số biến thiên chất chuẩn % hệ số biến thiên mẫu kiểm chứng Tất kết cuối phải báo cáo bao gồm độ không đảm bảo đo mà trước thiết lập Các kết định lượng khơng báo cáo phép ngoại suy mức cao mức thấp phép đo chuẩn hiệu chuẩn 9.3 Phân tích định tính Đối với phép thử định tính, bao gồm tất ứng dụng, thông số tương ứng mô tả phụ lục Các kết phải báo cáo phát thấy không phát thấy kể giới hạn phát 10 Các thơng số đặc trưng ảnh hưởng đến kết 10.1 Khái quát Các chuẩn thực liệt kê phương pháp phụ lục A loạt yêu cầu cần thực thiết lập cho phương pháp trình xây dựng, đánh giá hiệu lực sử dụng phương pháp Các thông số xây dựng cho phương pháp dùng để đảm bảo số liệu phương pháp đáng tin cậy có ổn định cao Mỗi lần thực phương pháp, đánh giá so sánh số liệu phương pháp với chuẩn tính phương pháp thiết lập Khi giá trị (ví dụ, % hệ số biến thiên phép xác định lặp lại) không thống với yêu cầu phép thử, điều nói lên kết thu khơng điển hình đánh giá chặt chẽ liệu Danh mục yêu cầu phải đầy đủ, thơng số đặc trưng trường hợp định không đáp ứng yêu cầu, số liệu hồn tồn chấp nhận Tuy nhiên, chuẩn khơng đáp ứng, cần phải ghi nhận lại số liệu đánh giá để xác định phân tích kết cần phải điều chỉnh, phải lặp lại mẫu cụ thể loạt mẫu Các định cần phải dựa việc điều chỉnh nhà nghiên cứu giải thích toàn chuẩn 10.2 Các xem xét đặc biệt 10.2.1 Đặc trưng Tính đặc chưng đầy đủ phép thử chất phân tích cụ thể, cần cho chất phân tích (protein) chất cần phân tích Nếu cần, khả phản ứng chéo cần đánh giá chất tương tự (các protein có mặt với trình tự tương tự) Để kiểm tra vắng mặt chất phân tích mẫu khơng chứa sinh vật biến đổi gen phân tích thành phần khơng chứa sinh vật biến đổi gen thành phần chứa sinh vật biến đổi gen độ pha lỗng thích hợp so sánh Điều thường thực trình xây dựng đánh giá phương pháp khơng cần thực q trình phân tích mẫu thơng thường mà trước thực để đánh giá hiệu lực phương pháp Phương pháp phụ lục A liệt kê tất chất cụ thể chất mà khả phản ứng chéo xác định 10.2.2 Hiệu tách chiết Cần đánh giá cẩn thận ảnh hưởng thông số q trình lên mẫu phịng thử nghiệm Để tạo độ nhạy cao cho phép thử miễn dịch, hiệu tách chiết phải cao tốt Hiệu phân tích phụ thuộc vào chất Cần xác định hiệu tách chiết ghi chép chất Quy trình tách chiết phải cho thấy có khả tái lập phương pháp hiệu chuẩn phải tính đến cho trường hợp tách chiết khơng hoàn toàn 10.2.3 Ảnh hưởng chất LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Phạm vi áp dụng định nghĩa rõ ràng xác chất áp dụng cho phép thử miễn dịch định Sử dụng mẫu chuẩn phù hợp với chất để so sánh trực tiếp mẫu chuẩn mẫu thử Tuy nhiên, mẫu cần phân tích so với mẫu chuẩn mà khơng chất phải đánh giá ảnh hưởng chất Ví dụ, chuẩn bị dịch chiết âm tính cho loại mẫu (chất nền) phân tích phương pháp dịch chiết đối chứng dương nồng độ biết Chuẩn bị dãy độ pha loãng kiểm chứng dương tính dịch chiết âm tính so sánh đường cong đáp ứng theo liều lượng tạo nên với đường chuẩn phương pháp Nếu hai đường dây khác tức có ảnh hưởng chất Sử dụng chất mà biểu gần với mẫu thực cần thử nghiệm Đường cong pha loãng với kiểm chứng dương tính biết nồng độ đường chuẩn Hình dạng đường chuẩn khơng thay đổi ảnh hưởng chất 10.2.4 Trạng thái song song/tuyến tính Đối với phép phân tích định lượng, biên độ tuyến tính dự kiến phép thử miễn dịch phải thông báo rõ phần phạm vi áp dụng cho tất loại chất đề cập Số điểm hiệu chuẩn cung cấp phải phản ánh phần tuyến tính đường cong (ví dụ, đường chuẩn khơng tuyến tính phải tạo nhiều điểm chuẩn độ) Nếu đường hiệu chuẩn không “song song” không độ dốc vẽ gần số liệu cần phải phân tích theo thống kê cho phép thử với độ pha loãng so sánh 10.2.5 Giới hạn phát Các kết mức giới hạn phát Trong trường hợp này, báo cáo kết phải nêu giới hạn phát 10.2.6 Các giới hạn định lượng Cần nêu rõ giới hạn định lượng cho phép hiệu chuẩn (hoặc độ pha loãng) Nồng độ dung dịch mẫu thử chưa biết phải nội suy không ngoại suy Kết giới hạn định lượng điểm hiệu chuẩn cao điểm hiệu chuẩn thấp 11 Phương pháp khẳng định Để thiết lập độ tin cậy phép thử, phương pháp khác lai protein, HPLC phân tích tính sử dụng để đo phần mẫu phân tích biết nồng độ Các kết hai phương pháp định tính/ định lượng phải tương đương Việc quan trọng phép thử miễn dịch kháng thể phản ứng chéo với chất phân tích khác có mặt chất 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin sau: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử; - Viện dẫn tiêu chuẩn phương pháp sử dụng nêu rõ phương pháp định tính, định lượng hay bán định lượng; - Giới hạn phát hiện; - Giới hạn định lượng dưới; - Ngày tháng lấy mẫu quy trình lấy mẫu sử dụng (nếu biết); - Ngày nhận mẫu; - Ngày bắt đầu phân tích tài liệu cần thiết khác; - Lượng mẫu sử dụng; - Lượng dung dịch mẫu thử; - Kết đơn vị dùng để báo cáo kết quả; - Bất kỳ điểm đặc biệt thử nghiệm; - Bất kỳ thao tác không qui định phương pháp coi tùy ý mà có ảnh hưởng đến kết LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn PHỤ LỤC A (tham khảo) PHÁT HIỆN ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GIEN (KHÁNG ROUNDUP READY1)) A.1 Giới thiệu Đậu tương (Glycine max) nguồn thực phẩm thức ăn chăn nuôi quan trọng 2) Gần đây, thông qua công nghệ sinh học đại người ta đưa loại gen cp4 epsps vào số giống đậu tương Gen kháng glyphosat lấy từ lồi vi khuẩn Agrobacterium dịng CP4 Protein CP4 EPSPS quy định tạo sức kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Roundup ®1)) Protein CP4 EPSPS tạo phát cách sử dụng kháng thể đặc hiệu A.2 Phạm vi áp dụng Phụ lục qui định phương pháp ELISA để xác định protein CP4 EPSPS có đậu tương Roundup Ready ®1 GTS 40-3-2 thành phần có nguồn gốc từ Phương pháp áp dụng cho mẫu xử lý chưa xử lý, qui trình tiến hành mà protein CP4 EPSPS chưa bị phá hủy Ví dụ, nhiệt độ dùng chế biến thành phần đậu tương ảnh hưởng đến khả phát protein Trong trường hợp phải định lượng, phương pháp áp dụng cho mẫu thực phẩm bao gồm đậu tương sản phẩm mà phát protein Phương pháp kiểm định để phát protein CP4 EPSPS đậu tương xay thành bột (mẫu chuẩn IRMM) dùng để xác định ngồi dải từ 0,5 % đến % (w/w) sử dụng mẫu chuẩn 3) Bộ thử có bán sẵn thị trường 4) dùng để phân tích chất khác có chứa protein nhận dạng nhà sản xuất thử Tóm tắt nghiên cứu cộng tác Hướng dẫn sử dụng, xem [3], [4] A.3 Nguyên tắc Phép thử miễn dịch hấp thụ liên kết enzym kẹp đôi (ELISA) sử dụng để phát protein CP4 EPSPS mơ tả hình A.1 đến A.4: Chú giải Kháng thể đơn dòng Bề mặt phủ Hình A.1 – Bề mặt khay thử phủ kháng thể đơn dòng đặc hiệu Roundup Ready Roungup nhãn hiệu thương mại đăng ký công ty Monsanto Thông tin tạo thuận tiện cho người sử dụng, tổ chức CEN không ấn định phải sử dụng sản phẩm 2) Các thành phần có nguồn gốc từ đậu tương thông thường giàu protein bao gồm: dạng bột, dịch cô đặc, sản phẩm tách dạng sợi 3) Các mẫu chuẩn thích hợp có bán sẵn từ Trung tâm nghiên cứu phối hợp thuộc Ủy ban Châu Âu Viện vật liệu đo lường chuẩn (IRMM) Thông tin tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm 4) Công ty Chẩn đốn chiến lược, Hampshire, Anh Thơng tin tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Chú giải Kháng nguyên Bề mặt phủ Hình A.2 – Khi mẫu thử thêm vào, kháng thể bám vào kháng nguyên Các thành phần không kết bám mẫu rửa Chú giải HRP Kháng thể phát Bề mặt phủ Hình A.3 – Sau rửa, kháng thể đa dòng liên kết với peroxidaza cải ngựa (horseradish peroxidas) (HRP) thêm vào, kháng thể liên kết đặc hiệu với vị trí kháng nguyên thứ hai protein CP4 EPSPS Chú giải Bề mặt phủ Hình A.4 – Sau rửa, chất màu tetramethylbenzidin (TMB) đặc hiệu HRP thêm vào, HRP tạo tín hiệu màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên dải tuyến tính Thêm dung dịch hãm để ngừng đổi màu Cường độ màu tạo thành đo bước sóng 450 nm A.4 Thuốc thử A.4.1 Khái quát Trong suốt trình phân tích, sử dụng loại thuốc thử phân tích, nước cất nước khử ion, trừ có quy định khác LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Mọi sai lệch so với chuẩn thực chứng tỏ thuốc thử thiếu ổn định Nếu thành phần chất đổi sang màu xanh thuốc thử cần loại bỏ Không sử dụng dung dịch đệm dung dịch cộng hợp bị vẩn đục Tất phận thử phải bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC Hạn sử dụng thử ghi nhãn Dựa việc kiểm định nhanh độ ổn định, hạn sử dụng thử xác định tháng nhiệt độ từ oC đến oC Dung dịch gốc kháng thể cộng hợp (A.6.6.1) dung dịch làm việc kháng thể cộng hợp (A.6.6.2) phải bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC hết hạn sử dụng Dung dịch đệm pha loãng để rửa phải bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC không lâu thời hạn sử dụng thử A.4.2 Thuốc thử kèm thử A.4.2.1 Dung dịch đệm tách chiết đậu tương, đệm natri borat, pH 7,5 A.4.2.2 Dung dịch đệm cho đậu tương, PBS, Tween 20, albumin huyết bò, pH 7,4 A.4.2.3 Hàng giếng phủ, 12 hàng, hàng giếng phủ kháng thể đơn dòng giá đỡ A.4.2.4 Protein thỏ kháng CP4 EPSPS cộng hợp với peroxidaza cải ngựa (HRP), đông khô A.4.2.5 Dung dịch đệm pha lỗng cộng hợp, 10 % huyết chuột vơ hoạt nhiệt A.4.2.6 Cơ chất màu, Blue-K 5) [Tetramethylbenzindin (TMB), hydro peroxit, dimethylformamid % làm dung môi] A.4.2.7 Dung dịch hãm, 0,5 % axit sulfuric A.4.2.8 Dung dịch đệm rửa đậm đặc 10 lần, PBS, Tween 20, pH 7,1 A.4.2.9 Các chuẩn đối chứng dương đối chứng âm phù hợp với chất nền, ví dụ 0,1 %, 0,5 %, %, % % w/w A.4.3 Các hóa chất khơng kèm thử A.4.3.1 Cồn, metanol, nồng độ thể tích Φ 70 %, etanol Φ 95 % A.4.3.2 Chất tẩy rửa, dùng cho bể siêu âm, tùy chọn A.5 Thiết bị dụng cụ A.5.1 Khái quát Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể là: A.5.2 Tủ lạnh, làm việc nhiệt độ khoảng oC A.5.3 Ống ly tâm hình nón polypropylen, có nắp đậy kín, ví dụ dung tích 15 ml A.5.4 Giấy bóng giấy nhơm A.5.5 Băng dính, để cố định khay giếng A.5.6 Chai rửa, ví dụ 500 ml A.5.7 Micropipet xác, chia độ, ví dụ 20 µl đến 500 µl A.5.8 Máy trộn, ví dụ Votex ®6) A.5.9 Cân, cân xác đến 0,01 g A.5.10 Máy ly tâm, tạo lực ly tâm tối thiểu 000 x g đầu ống ly tâm A.5.11 Máy đọc vi đĩa, có khả đọc độ hấp thụ 450 nm A.5.12 Tủ ấm nồi cách thủy, trì nhiệt độ 37 oC A.5.13 Rây kích thước lỗ 450 µl, tương đương 5) Blue-K tên thương mại sản phẩm Công ty Neogen, Lansing, Michigan, USA cung cấp Thông tin tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, tổ chức CEN khơng ấn định phải sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm khác cho kết tương tự 6) Votex sản phẩm thích hợp có bán sẵn thị trường Thơng tin tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, tổ chức CEN không ấn định phải sử dụng sản phẩm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh A.5.14 Rây kích thước lỗ 150 µl (100 mesh), tương đương www.luatminhkhue.vn A.5.15 Bộ pipet nhiều kênh, ví dụ từ 50 µl đến 300 µl (tùy chọn) A.5.16 Dụng cụ đựng thuốc thử cho pipet nhiều kênh (tùy chọn) A.5.17 Máy rửa vi đĩa tự động (tùy chọn) A.5.18 Giá đựng ống nghiệm dùng cho ống ly tâm 15 ml (tùy chọn) A.5.19 Bể siêu âm (tùy chọn) A.6 Tiến hành A.6.1 Cảnh báo phòng ngừa Phải cẩn thận dùng dung dịch axit dung dịch có chứa TMB Thơng gió tự nhiên vừa đủ A.6.2 Hạn chế qui trình Phản ứng ELISA bị giới hạn cho mẫu có số lượng protein CP4 EPSPS tương quan tuyến tính với hàm lượng nguyên liệu biến đổi gen có mẫu chuẩn sử dụng Đối với mẫu thực phẩm qua xử lý nhiệt mẫu thực phẩm dạng hỗn hợp mối tương quan khơng áp dụng Bộ thử ELISA thiết kế để có hiệu suất tối ưu nhiệt độ môi trường từ 15 oC đến 30 oC Độ hấp thụ mẫu chuẩn cao phải lớn 0,8 mật độ quang (OD) khơng nằm ngồi dải tuyến tính máy đo quang phổ (giới hạn thay đổi khác tùy vào loại máy quang phổ) Ở nhiệt độ cao 30 oC, giá trị OD tăng nhanh hơn, nên giảm thời gian ủ ấm enzym với chất Ở nhiệt độ thấp (nhỏ 15 oC) thời gian ủ ấm chất cần phải tăng lên A.6.3 Lấy mẫu Lấy mẫu theo ISO 21568 A.6.4 Chuẩn bị mẫu Lấy mẫu thử đồng từ mẫu phòng thử nghiệm, mẫu kép, xem ISO 21568 Đối với đậu tương nguyên liệu, nên lấy 000 g, trộn lẫn nghiền nhỏ lọt qua rây Để phân tích định lượng kích cỡ hạt nghiền phải nhỏ 150 µm phân tích định tính phải nhỏ 450 µm Khi rây bột phải cẩn thận tránh nhiễm bẩn Ngoài ra, cần ý khơng làm mẫu bị nóng q Hoạt động máy trộn bao gồm việc trộn nghiền mẫu Từ mẫu nghiền, lấy khoảng 100 g lọc qua rây có cỡ lỗ 450 µm (A.5.13) Lượng mẫu phải lọt qua rây 90% Để phân tích định tính dùng trực tiếp mẫu này, để phân tích định lượng phải rây tiếp qua rây cỡ lỗ 150 µm (A.5.14) Mẫu lọt qua rây 450 µm coi đồng Vì vậy, cần rây đủ lượng mẫu lọt qua rây 150 µm để dùng cho phép phân tích Các dạng mẫu khác phải xử lý tương tự cần lượng mẫu nhỏ A.6.5 Các biện pháp tránh nhiễm bẩn chuẩn bị mẫu A.6.5.1 Khái quát Hệ thống thử ELISA kỹ thuật nhạy phát lượng nhỏ protein CP4 EPSPS Vì lý đó, theo kinh nghiệm tất thiết bị dùng để xử lý mẫu đậu tương phải làm sau mẻ mẫu Các quy trình sau bao gồm bước làm thành phần khác biệt Bước thứ hai, rửa cồn, để vô hiệu tẩy protein cịn sót lại thiết bị A.6.5.2 Làm máy nghiền máy trộn Làm bàn chải mềm Tráng cồn (cồn chứa phun từ máy phun thiết bị phun tay) Nên tráng phun cồn lần Sau tráng kỹ nước Nếu cần dùng lại để khơ tự nhiên dùng máy sấy tóc Rửa bàn chải định kỳ ngâm vào dung dịch cồn (A.4.3.1) Làm khô bàn chải trước lần sử dụng Lau bàn chải vải mềm khăn phòng thử nghiệm A.6.5.3 Làm rây LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Rây dễ bị bết lại bột đậu tương Đập nhẹ rây lên mặt bàn tay cho bong phần dính Chải rây bàn chải mềm Ngâm rây vào cồn phút tráng kỹ nước Nếu cần dùng lại để khơ tự nhiên dùng máy sấy tóc Phương pháp làm khơ khác dùng bể siêu âm làm khơ khơng khí Rửa bàn chải định kỳ ngâm cồn (A.4.3.1) phút Làm khô trước lần sử dụng Lau bàn chải vải mềm A.6.5.4 Làm nơi làm việc Không để bụi đậu tương làm nhiễm bẩn nơi làm việc Không để bụi đậu tương trình xử lý làm nhiễm bẩn thiết bị dùng cho trình xử lý Để đạt hiệu tối ưu, nên tiến hành phân tích phòng riêng cách biệt với nơi nghiền chuẩn bị mẫu để tránh bị ô nhiễm bụi A.6.6 Chuẩn bị dung dịch kháng thể cộng hợp A.6.6.1 Dung dịch gốc kháng thể cộng hợp Làm tan chất kháng thể cộng hợp đông khô (A.4.2.4) dung dịch đệm cộng hợp (A.4.2.5) theo hướng dẫn sử dụng Bảo quản dung dịch gốc kháng thể cộng hợp oC đến oC không lâu hạn sử dụng thử A.6.6.2 Dung dịch làm việc kháng thể cộng hợp Thêm 240 µl dung dịch gốc cộng hợp (A.6.6.1) vào 21 ml dung dịch đệm pha loãng cộng hợp (A.4.2.5) Bảo quản dung dịch làm việc kháng thể cộng hợp oC đến oC không lâu hạn sử dụng thử A.6.7 Chuẩn bị dung dịch đệm rửa Pha loãng 10 lần dung dịch đệm rửa đậm đặc (A.4.2.8) nước với tỷ lệ 1:10 (1+9) A.6.8 Tiến hành thử Để tất thuốc thử đạt tới nhiệt độ phòng Lấy hàng giếng phủ (A.4.2.3) giá đỡ khỏi bao gói Sau lần lấy số lượng cần thiết cần đóng kín bao gói Mười giếng đủ mẫu chuẩn đối chứng mẫu thử trắng Mỗi khay phải có chuẩn chất kiểm chứng Nếu rửa thủ cơng phải dính băng dính tất mép khay (A.5.5) vào giá đỡ cho lần chạy, để tránh hàng giếng bị rơi khỏi giá đỡ trình rửa Quy trình tóm tắt A.7 A.6.9 Tiến hành thử nghiệm A.6.9.1 Tách chiết phần mẫu thử chuẩn đối chứng Các phần mẫu thử mẫu chuẩn âm tính dương tính điều kiện mơ tả đây: 7) tách chiết hai lần Cân khoảng 0,5 g ± 0,01 g loại mẫu chuẩn phần mẫu thử cho vào ống ly tâm polypropylen 15 ml riêng biệt Tiến hành cân mẫu chuẩn theo nồng độ tăng dần Sau cân phần mẫu thử Để tránh nhiễm bẩn, phải lau đĩa cân vải thấm cồn (A.4.3.1) để khô sử dụng đĩa cân dùng lần cho lần cân Thêm 4,5 ml dung dịch đệm tách chiết (A.4.2.1) vào ống ly tâm Trộn phần mẫu thử mẫu chuẩn với dung dịch đệm chiết cách lắc mạnh trộn (vortex) đồng CHÚ THÍCH Bột tách chất béo protein cần thời gian trộn lâu hơn, phải nhiều 15phút Bột nguyên chất béo dễ đồng hóa (khơng đến phút) Ly tâm hỗn hợp khoảng 000 g 15 phút, tốt oC Cẩn thận loại bỏ khoảng ml phần phía dung dịch dịch chiết chuẩn đối chứng cho loại vào ống ly tâm polypropylen 7) Các nguyên liệu đối chứng có bán sẵn thị trường Viện Vật liệu Đo lường, JRC Geel, Đức chứng nhận Thông tin tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, tổ chức CEN không ấn định phải sử dụng sản phẩm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các dung dịch mẫu bảo quản nhiệt độ oC đến oC, không ngày làm việc Trước tiến hành phân tích, pha lỗng dung dịch mẫu dung dịch chuẩn đối chứng dung dịch đệm cho đậu tương (A.4.2.2) theo bảng A.1 Bảng A.1 – Độ pha loãng tùy theo chất Chất Độ pha loãng Đậu tương 1:300 Bột đậu tương Bột đậu tương tách chất béo 1:300 a Mẫu protein a 1:300 1:10 a Các chất chưa đánh giá thử nghiệm cộng tác Độ pha loãng dựa kinh nghiệm nhà sản xuất Tóm tắt bước tách chiết nêu Bảng A.2 A.6.9.2 Quy trình phản ứng miễn dịch ELISA A.6.9.2.1 Khái quát Bộ thử ELISA thực theo nhiều dạng khác sử dụng số hàng hàng giếng Nên theo cách nạp giếng ngẫu nhiên, nghĩa mẫu thử mẫu kiểm chứng cần phải nạp vào vị trí cố định để tránh ảnh hưởng vị trí khay xảy ra, có Tất phản ứng phải chạy tối thiểu hai lần song song tính giá trị hấp thụ trung bình Mỗi lần chạy bao gồm: phép thử trắng, mẫu trắng dung dịch chuẩn đối chứng dương Khi bắt đầu phân tích tất bước phải hồn tất mà khơng bị gián đoạn Tóm tắt quy trình ELISA đưa bảng A.3 A.6.9.2.2 Ủ ấm Dùng micropipet lấy 100 µl dung dịch mẫu pha loãng dung dịch mẫu chuẩn cho vào giếng thích hợp tiến hành phép thử trắng Sử dụng tip riêng cho lần hút pipet để tránh nhiễm bẩn sang lần Bọc khay giấy bóng kính giấy nhơm (A.5.4) để tránh nhiễm bẩn bay Trước ủ ấm, nên lắc nhẹ khay vi đĩa cách dùng ngón tay trỏ ngón cầm mép ngắn khay đưa nhẹ sang hai phía Ủ ấm khay vi đĩa 37 oC A.6.9.2.3 Rửa Rửa lần 300 µl dung dịch đệm rửa (A.6.7) cách dùng máy trộn (A.5.8) Rửa thủ công: Đổ hết lượng chứa giếng cách lật úp xuống chậu rửa thùng rác Dùng chai rửa loại 500 ml chứa dung dịch rửa, làm đầy giếng, để khoảng 60 giây, sau lại đổ hết Lặp lại bước rửa lần Loại bỏ dịch lỏng bọt khí cịn sót lại cách lật úp xuống lớp giấy lau Để tránh hàng giếng bị rơi khỏi giá đỡ, nên dùng băng dính dán lại Rửa tự đồng: Sau ủ, dùng máy rửa vi đĩa hút hết lượng chứa giếng, sau đổ đầy giếng dung dịch đệm rửa làm việc Lặp lại thao tác hút rửa giếng lần Cuối cùng, dùng máy hút khô giếng vỗ khay lật úp lên tập giấy lau để loại hết chất lỏng bọt khí CHÚ THÍCH Khơng để giếng khơ hẳn, ảnh hưởng đến việc phân tích CHÚ THÍCH Rửa khơng kỹ làm sai lệch kết Dù rửa thủ công hay rửa máy, phải chắn giếng rửa với thể tích A.6.9.2.4 Bổ sung dung dịch kháng thể cộng hợp Dùng micropipet cho 100 µl dung dịch kháng thể cộng hợp làm việc (A.6.6.2) vào giếng Bọc khay lại để tránh nhiễm bẩn bay Trước ủ, lắc nhẹ khay vi đĩa cách dùng ngón tay trỏ ngón cầm mép ngắn khay đưa nhẹ sang hai phía LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Ủ khay vi đĩa nhiệt độ 37 oC A.6.9.2.5 Rửa Sau giai đoạn ủ, lặp lại bước rửa mô tả (A.6.9.2.3) A.6.9.2.6 Bổ sung chất Dùng micropipet lấy 100 µl chất màu (A.4.2.6) cho vào giếng Lắc nhẹ khay ủ 10 phút nhiệt độ phòng Việc bổ sung chất màu phải thực liên tục, khơng gián đoạn Duy trì trình tự khoảng cách thời gian trình bổ sung dung dịch A.6.9.2.7 Bổ sung dung dịch hãm Sau ủ, dùng pipet lấy 100 µl dung dịch hãm (A.4.2.7) cho vào giếng, việc bổ sung dung dịch hãm phải theo trình tự thuốc thử màu Lắc nhẹ khay 10 giây để ngừng màu phân bố dung dịch hãm Việc bổ sung dung dịch hãm phải thực liên tục, không gián đoạn Cần bảo vệ khay tránh ánh nắng mặt trời, không cường độ màu bị ảnh hưởng A.6.9.2.8 Đọc độ hấp thụ Dùng máy đọc vi đĩa, có gắn lọc phù hợp để đọc bước sóng 450 nm, đo độ hấp thụ giếng Việc đọc phải thực 30 phút sau bổ sung dung dịch hãm Ghi lại kết thu tính giá trị hấp thụ trung bình dùng chương trình máy tính A.7 Sơ đồ Bảng A.2 – Qui trình tách chiết Quy trình Mơ tả Cân 0,5 g Cân mẫu phân tích, mẫu trắng, mẫu chuẩn đối chứng Thêm 4,5 ml Thêm dung dịch đệm tách chiết (A.4.2.1) Trộn Trộn phần mẫu thử với dung dịch đệm chiết đồng nhất, bột chưa tách chất béo thời gian nhỏ phút, cịn bột tách chất béo, mẫu protein nhiều 15 phút Ly tâm 000 x g Ly tâm mẫu 000 x g 15 phút, oC Loại bỏ phần phía cho vào ống Độ pha loãng: 1:300 1:10 tùy theo loại nguyên liệu nghiên cứu Pha lỗng dung dịch mẫu thử tạo thành, phân tích trắng chuẩn đối chứng Bảng A.3 – Qui trình ELISA Quy trình Bổ sung Thể tích 100 µl Mơ tả Dùng pipet lấy dung dịch pha lỗng, dung dịch mẫu thử, mẫu trắng chuẩn đối chứng cho vào giếng phân tích thích hợp trộn Ủ Ủ 37 oC Rửa Rửa lần dung dịch đệm rửa (A.6.7) Bổ sung 100 µl Phân phối chất kháng thể cộng hợp (A.4.2.4) vào giếng phân tích trộn Ủ Ủ 37 oC Rửa Rửa lần dung dịch đệm rửa (A.6.7) Bổ sung 100 µl Ủ Bổ sung Phân phối chất màu (A.4.2.6) vào giếng trộn Ủ 10 phút nhiệt độ phòng 100 µl Phân phối dung dịch hãm (A.4.2.7) vào giếng trộn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh Quy trình www.luatminhkhue.vn Thể tích Đo độ hấp thụ Mơ tả Đo độ hấp thụ giếng phân tích máy đọc đĩa 450 nm A.8 Đánh giá Số liệu phải ghi lại Dùng giá trị chuẩn để xây dựng đường chuẩn Các giá trị từ phân tích trắng phải trừ khỏi tất giá trị dung dịch mẫu thử pha loãng chuẩn đối chứng Trung bình giá trị chỉnh từ điểm chuẩn thực hai lần song song phải dùng để xây dựng đường chuẩn Giá trị trung bình thu từ dung dịch mẫu thử thực hai lần song song dùng để suy nồng độ từ đường A.9 Tiêu chí chấp nhận/loại bỏ Mỗi vận hành phải đáp ứng tiêu chí chấp nhận/loại bỏ quy trình để có giá trị liệt kê Bảng A.4 Một vận hành gồm: phân tích trắng, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm mẫu chưa biết Tất dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn phân tích trắng phải chạy hai lần song song Nếu vận hành khơng đạt tiêu chí chấp nhận phải lặp lại tồn qui trình Các dung dịch mẫu thử khơng đạt tiêu chí chấp nhận lần vận hành phải tiến hành lần hai Bảng A.4 – Tiêu chí chấp nhận loại bỏ kết Phân tích trắng dung dịch đệm A 450 nm < 0,30 % chuẩn sinh vật biến đổi gen A 450 nm < 0,30 2,5 % chuẩn đối chứng A 450 nm ≥ 0,8 Tất chuẩn đối chứng dương, OD CV (OD) ≤ 15 % Dung dịch mẫu CV (OD) ≤ 20 % A.10 Tình trạng Phương pháp thử nghiệm nghiên cứu liên phòng thử nghiệm mẫu chuẩn CRM 410 theo TCVN 6910 (ISO 5725) Trung tâm Nghiên cứu Phối hợp Ủy ban châu Âu Ispra, Italia thực hiện, xem [3] Phương pháp sử dụng phép thử liên phòng khác với mô tả liên quan đến khía cạnh sau: - Khơng rây, - Khơng nói rõ sử dụng thuốc thử, - Khơng nói rõ việc chuẩn bị mẫu, - Phương pháp áp dụng mẫu chuẩn chứa 0,1 %, 0,5 % % CRM 410, - Các chuẩn đối chứng không phân tích hai lần song song, - Lượng mẫu khơng đủ để lặp lại phân tích để áp dụng tiêu chí chấp nhận/loại bỏ Các kết thử liên phòng thử nghiệm liệt kê Bảng A.5 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Bảng A.5 – Dữ liệu độ chụm Phầm trăm mẫu sinh vật biến đổi gen bột đậu tương Năm thử liên phòng thử nghiệm 0,5 % 1999 Số lượng phòng thử nghiệm 37 Số phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 37 Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm) Số kết chấp nhận 37 Giá trị trung bình , % sinh vật biến đổi gen % giá trị thực Độ lệch chuẩn lặp lại s 0,440 88,1 a r 0,062 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr % b Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 sr]a Độ lệch chuẩn tái lập sR a 0,176 0,083 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %b Giới hạn tái lập [R = 2,8 sR] 12,4 a a sr, sR, r, R biểu thị đơn vị % sinh vật biến đổi gen b RSDr RSDR biểu thị phần trăm giá trị thực LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 16,6 0,238 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ISO 5725 (all Parts), Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results ISO Guide 30, Terms and definitions used in connection with reference materials [1] Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling: In House method validation In House validated methods and their role in methods of analysis for codex purposes Codex Alimentarius Commission (CX/MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998 [2] Horwitz W.: Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies Pure and Applied Chemistry, 1995, 67: 331-343 [3] Lipp, M., Anklam, E., and Stave, J., 2000 Validation of an Immunoassay for Detection and Quantitation of a Genetically Modified Soybean in Food and Food Fractions Using Reference Materials: Interlaboratory Study Journal of AOAC International Vol 83, No.4, pp.919-927 [4] GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide, (1999) Strategic Diagnostics Inc., Rev 052099, Vers.1.8 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 ... sơcơla đen) 8.4 Chuẩn bị đường chuẩn Để dựng đường chuẩn, khuyến cáo sử dụng mẫu chuẩn mẫu chuẩn đánh giá phù hợp chất 8.5 Qui trình phân tích Tùy theo qui trình chọn Phụ lục A tiêu chuẩn này, mà... dụng tiêu chuẩn này, cần tuân thủ yêu cầu chung đảm bảo chất lượng phịng thử nghiệm (ví dụ: liên quan đến hiệu chuẩn thiết bị, xác định kép, phép thử trắng, sử dụng mẫu chuẩn, dựng đường chuẩn. .. định Sử dụng mẫu chuẩn phù hợp với chất để so sánh trực tiếp mẫu chuẩn mẫu thử Tuy nhiên, mẫu cần phân tích so với mẫu chuẩn mà khơng chất phải đánh giá ảnh hưởng chất Ví dụ, chuẩn bị dịch chiết