Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề Dịch vụ thú y Trung cấp)

UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: VI SINH ĐẠI CƯƠNG - CNTY NGÀNH, NGHỀ: DỊCH VỤ THÚ Y TRÌNH ĐỘ: TRUNG CẤP (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 2017 Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Đây giáo trình nội Trường Cao đẳng Cộng Đồng Đồng Tháp nên nguồn thơng tin phép dùng ngun trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Nội dung giáo trình xây dựng sở thừa kế nội dung giảng giảng dạy nhà trường, kết hợp với nội dung nhằm đáp ứng yêu cầu nâng cao chất lượng đào tạo phục vụ cho đội ngũ giáo viên học sinh – sinh viên nhà trường Mọi mục đích lệch lạc sử dụng với ý đồ kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm i LỜI GIỚI THIỆU Để nâng cao nhu cầu đào tạo, nâng cao chất lượng giảng dạy học tập, việc biên soạn giáo trình cho mơn học yêu cầu cấp thiết Trên sở chương trình khung Bộ Lao Động Thương Binh Xã Hội ban hành kinh nghiệm rút từ thực tế đào tạo, Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Đồng Tháp tổ chức biên soạn chương trình, giáo trình cách khoa học, hệ thống cập nhập kiến thức thực tiễn phù với đối tượng ngành nghề đào tạo Giáo trình Vi sinh đại cương môn khoa học nghiên cứu quy luật chung vi sinh vật có liên quan đến ngành nghề chăn ni thú y Giáo trình cung cấp kiến thức cho làm sở để sinh viên tiếp thu kiến thức môn học chuyên ngành Vi sinh thú y, Chẩn đoán, Bệnh truyền nhiễm Trong q trình thực khơng thể tránh khỏi sai sót Chúng tơi mong nhận ủng hộ đóng góp ý kiến đọc giả để xuất lần sau hoàn thiện tốt Nội dung giáo trình gồm chương: Chương Đại cương vi sinh vật học Chương Hình thái, cấu tạo nhóm vi sinh vật Chương Sinh lý học vi sinh vật Chương Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng vi sinh vật Chương Virus học Chương Di truyền học vi khuẩn Chương Sự phân bố vi sinh vật tự nhiên Chúng xin chân thành cảm ơn tác giả (phần tài liệu tham khảo) có cơng trình nghiên cứu, biên soạn giáo trình, sách, báo tài liệu quý giá lĩnh vi sinh vật học Cảm ơn Sở Lao Động Thương Binh Xã Hội, Trường CĐCĐ Đồng Tháp khoa Nông Nghiệp Thủy Sản, Bộ môn CNTY hướng dẫn, giúp đỡ để hoàn thành nhiệm vụ Đồng Tháp, ngày… tháng năm 2017 Chủ biên Nguyễn Thị Mỹ Linh ii MỤC LỤC NỘI DUNG Trang LỜI GIỚI THIỆU ii CHƯƠNG ĐẠI CƯƠNG VỀ VI SINH VẬT HỌC 1 Đối tượng vi sinh vật học Vai trò vi sinh vật tự nhiên đời sống 2.1 Vai trò vi sinh vật tự nhiên 2.2 Vi sinh vật đời sống 3 Tính chất chung vi sinh vật 3.1 Kích thước nhỏ bé 3.2 Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh 3.3 Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh 3.4 Có lực thích ứng mạnh dễ dàng phát sinh biến dị 3.5 Phân bố rộng, chủng loại nhiều 3.6 Là sinh vật xuất trái đất Lịch sử phát triển vi sinh vật 4.1 Giai đoạn sơ khai vi sinh vật 4.2 Giai đoạn sau phát minh kính hiển vi (Phát KHV) 4.3 Giai đoạn vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur 4.4 Giai đoạn sau Pasteur vi sinh học đại CHƯƠNG HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHĨM VI SINH VẬT Nhóm vi khuẩn 1.1 Hình thái kích thước vi khuẩn 1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn 14 Một số nhóm vi khuẩn đặc biệt 24 2.1 Xạ khuẩn 24 2.2 Mycoplasma dạng L vi khuẩn 25 Nấm men 27 3.1 Hình thái nấm men 27 3.2 Cấu tạo nấm men 27 Nấm mốc 31 4.1 Hình thái nấm mốc 31 4.2 Cấu tạo nấm mốc 32 iii Thực hành (xem 1, 2, phần hướng dẫn thực hành) 34 CHƯƠNG SINH LÝ HỌC CỦA VI SINH VẬT 35 Dinh dưỡng vi sinh vật 35 1.1 Nước 35 1.2 Các chất hữu 36 1.3 Các chất vơ (khoáng) 38 Nguồn thức ăn vi sinh vật 38 2.1 Nhu cầu thức ăn vi sinh vật 38 2.2 Nguồn dinh dưỡng Nitơ 40 2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng 40 Sự sinh trưởng phát triển vi sinh vật 41 3.1 Sinh trưởng, sinh sản phát triển vi khuẩn 41 3.2 Phương pháp nghiên cứu phát triển vi khuẩn 41 3.3 Các phương pháp định lượng vi khuẩn 44 3.4 Đường cong sinh trưởng vi sinh vật 45 Thực hành (xem phần hướng dẫn thực hành) 48 CHƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 49 Yếu tố vật lý 49 1.1 Độ ẩm 49 1.2 Nhiệt độ 50 1.3 Ấp suất thẩm thấu 51 1.4 Sóng siêu âm 51 1.5 Tia xạ 52 Yếu tố hóa học 52 2.1 pH môi trường 52 2.2 Oxy 53 2.3 Các chất diệt khuẩn (sát trùng) 53 Ảnh hưởng yếu tố sinh học 54 3.1 Chất kháng sinh 54 3.2 Kháng thể 57 3.3 Các chất tiêu độc khử trùng 57 Thực hành (xem 6, phần hướng dẫn thực hành) 59 CHƯƠNG 5: VIRUS HỌC 60 Đặc tính chung virus 60 iv Hình dạng cấu tạo virus 61 2.1 Hình dạng kích thước virus 61 2.2 Cấu tạo virus 64 2.3 Các dạng đối xứng virus 68 Hệ thống phân loại virus 70 3.1 Hệ thống phân loại theo thứ bậc 70 3.2 Hệ thống phân loại Baltimore 72 Sự nhân lên virus 73 4.1 Sự chép nhân lên virus 73 4.2 Sự chép thể thực khuẩn (phage) 74 Ứng dụng thực khuẩn thể đời sống 76 Thảo luận: Phương pháp chẩn đoán virus học 77 CHƯƠNG DI TRUYỀN HỌC CỦA VI KHUẨN 80 Đặc điểm chung di truyền vi sinh vật 80 Sinh sản vi sinh vật 83 2.1 Sự sinh sản vi sinh vật nhân nguyên (vi khuẩn) 83 2.2 Sự sinh sản vi sinh vật nhân thật (vi nấm) 86 Đột biến vi sinh vật 90 3.1 Định nghĩa 90 3.2 Tính vơ hướng đột biến 90 3.3 Nguyên nhân đột biến 90 3.4 Tần số đột biến thiên nhiên 90 3.5Tác nhân gây đột biến vi sinh vật 90 3.6 Sự biểu tính trạng đột biến 91 3.7 Lợi ích đột biến 91 CHƯƠNG SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN 92 Hệ vi sinh vật đất 92 Hệ vi sinh vật nước 94 2.1 Sự phân bố vi sinh vật môi trường nước 94 2.2 Vi sinh vật gây bệnh nước 95 Hệ vi sinh vật khơng khí 96 Tác động yếu tố sinh vật học 98 4.1 Quan hệ cộng sinh 98 4.2 Quan hệ tương hỗ 98 v 4.3 Quan hệ đối kháng 99 4.4 Quan hệ ký sinh 99 Thực hành: (xem 5, phần hướng dẫn thực hành) 99 PHẦN HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH 100 BÀI CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHONG THÍ NGHIỆM VI SINH 100 BÀI TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 102 BÀI PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 107 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT 112 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT 121 Bài PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 vi GIÁO TRÌNH MƠN HỌC VI SINH ĐẠI CƯƠNG - CNTY Tên môn học: Vi sinh đại cương - CNTY Mã mơn học: TNN426 Vị trí, tính chất, ý nghĩa vai trị mơn học: - Vị trí mơn học: môn học sở Nội dung môn học bao gồm kiến thức mơ tả hình dạng cấu trúc, đặc điểm biến dưỡng, đặc điểm di truyền vi sinh vật Các tính chất sử dụng làm sở cho phân loại định danh, cho trình phân lập chẩn đốn vi sinh vật Vai trị chúng trình sinh bệnh cho người động thực vật, lợi ích vi sinh vật môi trường sinh vật vật khác giải thích - Tính chất: Đây môn học kỹ quan trọng làm tảng cho mơn học chun mơn: Chẩn đốn xét nghiệm Bệnh truyền nhiễm - Ý nghĩa vai trò mơn học: Giáo trình có ý nghĩa giảng dạy học tập, cung cấp cho sinh viên kiến thức vi sinh vật học, góp phần quan trọng chương trình ngành nghề đào tạo Mục tiêu môn học/mô đun: Sau học xong học phần sinh viên trang bị: - Về kiến thức: + Hiểu rõ vai trò vi sinh vật trái đất, môi trường, sống người sinh vật khác; + Kiến thức vững đặc điểm tính vi sinh vật: hình dạng cấu trúc vi sinh vật, đặc điểm tính chất sinh trưởng, biến dưỡng di truyền vi sinh vật; + Trình bày cấu tạo, đặc điểm sinh trưởng phát triển, đặc điểm sinh lý di truyền vi sinh vật; + Vận dụng kiến thức để giải thích chế sinh bệnh vi sinh vật bệnh; ni cấy, phân lập, chẩn đốn vi sinh vật; +Các từ chuyên ngành tiếng Anh, hiểu tên vi sinh vật (cấu trúc theo tiếng La tinh); - Về kỹ năng: + Có kỹ thực hành nghiên cứu vi sinh vật vii + Nêu đặc điểm hình thái, cấu tạo nhóm vi sinh vật + Xác định nhu cầu dinh dưỡng, nguồn thức ăn cho loài vi sinh vật Ứng dụng vi sinh vật đời sống + Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng vi sinh vật + Có kỹ xác định tính di truyền nhóm vi sinh vật + Xác định hệ vi sinh vật tự nhiên - Về lực tự chủ trách nhiệm: + Có ý thức lợi ích việc học tập, từ có thái độ học tập đắn; ý thức tự học hỏi nâng cao trình độ + Có khả thích ứng với mơi trường làm việc phịng thí nghiệm; ý thức nguy rủi ro công việc liên quan vi sinh vật học, xử lý/giải vấn đề phát sinh III Nội dung môn học: Nội dung tổng quát phân bổ thời gian: Thời gian (giờ) SốTT Tên chương, mục Tổng số Chương Đại cương vi1 sinh vật học Chương Hình thái, cấu tạo 12 nhóm vi sinh vật Chương Sinh lý học vi sinh 10 vật Chương 4: Ảnh hưởng các6 yếu tố môi trường đến sinh trưởng vi sinh vật Chương Virus học Chương 6: Di truyền biến dị vi khuẩn Chương Sự phân bố vi sinh vật tự nhiên Ôn thi Thi kết thúc mơn học viii Thực hành, thí nghiệm,Kiểm tra Lýthuyết thảo luận, tập 8 2 4 1 Cộng 45 ix 14 28 mang Bào tử thường nằm tế bào sinh dưỡng ba vị trí khác nhau: nằm tâm tế bào gọi bào tử kiểu Bacillus, nằm lệch tâm – kiểu Clostridium nằm cực tế bào gọi bào tử kiểu Plectidium Ở số giống vi khuẩn khác, bào tử tồn tế bào xung quanh tan rã Vật liệu dụng cụ: - Giống vi khuẩn Bacillus cereus môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng ủ – ngày đến tuần 30ºC - Thuốc nhuộm: cách + Lục malachite thuốc nhuộm safranin + Fuschin, HCl 0.5%, H2SO4 1%, xanh methylene (Loeffler) + Xanh methylene đỏ trung tính - Giá nhuộm phiến phết kính nhuộm - Cốc beesse bếp đun Cách tiến hành: a Với thuốc nhuộm lục malachite thuốc nhuộm safranin 1- Chuẩn bị vết bôi phiến kính hơ nóng nhẹ 2- Thêm nước vào cốc beesse đun sơi 3- Đặt giá nhuộm lên cốc beesse đặt phiến kính lên 4- Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ phần kính chút) lên phiến kính Mẫu giấy giúp giữ thuốc nhuộm lại phiến kính 5- Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite hơ nước vòng phút Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khơ phiến kính 6- Khử màu với nước 30 giây cách cho nước chảy lên phiến kính Các tế bào sinh dưỡng bị màu, bào tử giữ màu lại 7- Nhuộm lại với safranin 30 giây rửa lại với nước 30 giây Thấm khô cẩn thận 8- Quan sát kính hiển vi với vật kính đâu (x100) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu hồng Ghi lại kết 118 Lưu ý: Khi nhuộm Gram, bào tử không bị nhuộm nên tế bào trơng giống có lỗ bên Quy trình nhm bào tử theo phương pháp Schaeffer - Fulton b Với thuốc nhuộm Fuschin, HCl 0.5, H2SO4 1% xanh methylene 1- Làm vết bôi mọt phiến kính để khơ tự nhiên 2- Nhỏ vài giọt HCl 0.5% lên vết bơi, hơ nóng lửa đèn cồn cho bốc phút rửa với nước 3- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuschin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng bốc vịng phút 4- Rửa vết bơi nước 5- Tẩy màu dung dịch H2SO4 1% phút 6- Rửa vết bôi nước 7- Nhuộm vết bôi xanh methylene – 15 phút 8- Rửa lại với nước để khô tự nhiên 9- Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu ( x100) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu xanh Ghi lại kết c Với thuốc nhuộm Xanh methylene đỏ trung tính: 1- Làm vết bơi phiến kính 2- Cố định tiêu lửa đèn cồn 119 3- Nhuộm xanh methylene phút có hơ nóng từ bên 4- Rửa vết bơi nước hết màu 5- Nhuộm với đỏ trung tính 0.5% phút 6- Rửa lại nước, để khơ 7- Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu ( x100 ) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu đỏ Ghi lại kết Thực hành Sinh viên thực hành làm tiêu bản: - Giọt ép, giọt treo - Nhuộm gram vi khuẩn phòng thí nghiệm chuẩn bị - Nhuộm Kháng acid từ vaccine BCG - Nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (malachite thuốc nhuộm safranin) Báo cáo Sinh viên viết báo cáo cách tiến hành kết nhuộm 120 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Khái niệm Phân lập vi sinh vật trình tách riêng lồi vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đầu Vi sinh vật dạng khiết giống vi sinh vật tạo từ tế bào ban Trong thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều lồi khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, lý hoá sử dụng vào thực tiễn lồi cần phải đưa chúng dạng khiết Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết Với hầu hết loại mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc Phân lập khiết vi sinh vật đơn bào 3.1 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật môi trường phân lập a Yêu cầu: Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đưa dạng lỏng cách: - Nghiền mẫu - Hoà tan mẫu nước cất vô trùng Sau thực mẫu dạng lỏng, tiếp tục pha loãng nồng độ cần thiết Cấy mẫu môi trường đặc trưng Để có chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần kỹ thuật pha loãng nêu tất khuẩn lạc xuất môi trường đồng Mức độ khiết chủng kiểm tra sau: 121 - Việc tạo hộp ria từ khuẩn lạc đơn chủng tạo loại khuẩn lạc bề mặt mơi trường có hình thái giống với khuẩn lạc chủng ban đầu - Mỗi khuẩn lạc đơn chứa loại tế bào có hình thái giống quan sát kính hiển vi Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nguy bị nhiễm cách thực nghiêm túc yêu cầu thao tác vô trùng b Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí thực sau: 1) Kỹ thuật hộp ria Khử trùng bề mặt bàn tay cồn 70º, chờ khô đốt đèn cồn Đĩa môi trường đổ bảo quản lạnh từ 4ºC – 8ºC, trước dùng đặt vào tủ ấm 37ºC khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô Thực bước sau: - Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên mẫu ( bệnh phẩm, thực phẩm,…), ngày cấy, người cấy - Ước lượng úp đĩa xuống dùng bút thước chia đĩa thành phần - Đốt que cấy lửa đèn cồn thao tác lấy mẫu ống nghiệm - Dùng ngón ngón ( bàn tay trái ) ấn vào tâm đĩa petri, ngón cịn lại xoay hơ mép nắp đĩa đèn cồn trước cấy - Cầm đĩa lọt vào lịng bàn tay trái, ngón ngón út tỳ vào nắp để đẩy nắp lên cho nắp đáy tạo góc khoảng 45º - Đưa đầu que cấy vào phết góc nhỏ, sát thành đĩa - Thực cấy ria chữ T ria bốn góc (xem hình) hợp - Sau cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm nhiệt độ thời gian thích - Xem kết minh họa bên Chú ý: 122 - Đốt que cấy, hơ miệng ống nghiệm nút bông, hơ mép đĩa trước sau thao tác - Trong suốt q trình cấy, miệng đĩa petri ln gần lửa Tránh nhiễm vi sinh vật từ khơng khí vào - Khi cấy, cầm góc cuối que ngón tay (cái, trỏ, ), lướt nhẹ mặt thạch Nếu tỳ mạnh làm vỡ mặt thạch - Nếu dự đốn số lượng vi khuẩn có dịch mẫu nhiều, sau đường cấy đốt lại que cấy để làm giảm thiểu số lượng vi khuẩn đường ria Nếu không khó tách biệt khuẩn lạc Hình: (a) -Sơ đồ cấy phân lập thạch đĩa; (b) - Kết cấy phân lập thạch đĩa ; (c) - Kết cấy phân lập thạch đĩa (4 đường cấy) Chú ý: cấy ria từ – đường tùy theo đường kính đĩa 2) Kỹ thuật hộp trải - Hút 0,1 ml dịch mẫu pha lỗng cho vào đĩa petri có mơi trường thích hợp - Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải khắp mặt thạch 123 - Tiếp tục sử dụng que gạt gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ đĩa thứ – Đặt đĩa pêtri 1, 2, vào tủ ấm nhiệt độ thích hợp sau thời gian định tuỳ giống vi sinh vật ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa thứ 3) Kỹ thuật hộp đổ - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vơ trùng chuyển 1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa petri - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đun chảy để nguội đến 45 - 55ºC vào đĩa petri cấy mẫu - Xoay nhẹ đĩa petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật kỵ khí thực sau: Phân lập vi sinh vật kị khí mơi trường đặc đĩa pêtri - Dùng môi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí mơi trường - Để nguội mơi trường cịn 45 - 50ºC - Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm - Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa pêtri đậy thật nhanh nắp lại, cho mặt nắp môi trường khơng cịn khơng khí - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc nắp đĩa petri - Nuôi bình yếm khí: sau cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí Thoa lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên đặt vào bình, đậy nắp lại, dùng máy hút chân không Cho vào tủ ấm, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ khối môi trường, dùng que cấy cắt khối mơi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra: 1) Kiểm tra vết cấy 124 Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy môi trường đặc: - Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng đều, chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại - Nếu vết cấy khơng loại bỏ 2) Kiểm tra lại độ chủng loại khuẩn lạc - Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng - Tách khuẩn lạc hồ tan, pha lỗng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng - Nhỏ giọt dịch vào đĩa pêtri có mơi trường - Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, đĩa thứ 2, thứ - Đặt đĩa pêtri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật - Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống Thực hành: Phân lập vi khuẩn - Sinh viên thực hành phân lập vi sinh vật kỹ thuật hộp ria từ hỗn tạp vi sinh vật phịng thí nghiệm cung cấp Báo cáo kết Trình bày lại phương pháp phân lập nộp báo cáo kết phân lập 125 Bài PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng việc đánh giá chất lượng vi sinh chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối… Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường thực theo phương pháp chủ yếu đếm trực tiếp đếm gián tiếp Mục đích - Trang bị cho sinh viên kỹ thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật dung dịch môi trường nuôi cấy - Yêu cầu sinh viên phải hiểu ý nghĩa nguyên tắc việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật - Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành thao tác đếm số lượng tế bào vi sinh vật từ loại mẫu khác Nguyên vật liệu thiết bị Thiết bị dụng cụ - kính hiển vi vật kính x10, x40, lamelle - kim cấy đèn cồn - Buồng đếm hồng cầu Thomas Neubaur - micropipette đầu col 1ml vô trùng, đầu col 0, 1-0,2ml - vial khử trùng - ống nghiệm 10ml dùng để pha loãng dịch mẫu vi khuẩn - đĩa petri khử trùng - Bút lông dầu Vật liệu hóa chất - Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…) - Dịch nấm men ống giống nấm men nuôi cấy 48 - Mẫu cám, bắp, thịt… - Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…) đĩa/1 sinh viên - chai chứa 1lít nướcmuối sinh lý cất khử trùng Nguyên tắt chung 126 - Mẫu phải pha loãng Tuỳ theo mức độ nhiễm khuẩn mẫu ta có ước lượng pha loãng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000…… - Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường NaCl 9%0 hay phot phat đệm vô trùng - Cách pha: + Mẫu 1/5 : 1ml mẫu + 4ml NaCl 9%0 + Mẫu 1/10: 1ml mẫu + 9ml NaCl 9%0 - Từ mẫu 1/10 (10-1) lấy 1ml + 9ml NaCl 9%0 ta có độ pha lỗng 10-2 , ta có độ pha lỗng 10-3, 10-4…… 1ml 1ml 1ml 1/100 1/102 1/103 1/104 Phương pháp đếm 3.1 Đếm trực tiếp buồng đếm a Cấu tạo buồng đếm Hình 2: Buồng đếm tế bào vi sinh vật 127 - Buồng đếm phiến kính trong, dày, hình chữ nhật - Giữa phần lõm phẳng, có kẻ hai khung đếm gồm 400 nhỏ Bên ngồi có ghi tên loại buồng đếm, ghi thông số kỹ thuật hình b Cấu tạo khung đếm Cấu tạo khung đếm có: - Trường hợp 1: khung có 16 lớn, lớn có 25 nhỏ Vậy khung có 400 nhỏ - Trường hợp 2: khung có 25 lớn, lớn có 16 nhỏ Vậy khung có 400 ô nhỏ - Diện tích ô nhỏ 1/400 mm2 Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3 c Cách tiến hành - Đặt lammen phủ lên khung đếm - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men pha loãng, bỏ vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm lammen - Dung dịch chảy tràn từ từ vào rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, thừa Nếu bị bọt kẹt lại lammen phải làm lại - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ trước, sau dùng vật kính x40 để đếm - Đếm số tế bào ô lớn ( ô cạnh, ô giữa), đếm ô nhỏ ô lớn Trong tất ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trước, sau đếm số tế bào nằm cạnh phía cạnh bên phải - Đếm tất 80 nhỏ có ô lớn (T/h: ô lớn có 16 ô nhỏ) 128 - Hoặc đếm 125 nhỏ có ô lớn (T/h: ô lớn có 25 ô nhỏ) d Cơng thức tính Số tế bào/1 ml mẫu = a x 4.000 x 1.000 /H Trong đó: a = số tế bào trung bình có nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3 ) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành mm3 1.000 = số qui đổi từ mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3 ) H = hệ số pha lỗng (ví dụ: H = 10-2) e Chú ý: - Chỉ đếm tổng số tế bào, biết tế bào sống, tế bào chết - Nồng độ dịch huyền phù pha loãng cho mật độ ô nhỏ không 10 tế bào - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm lau khơ - Để đạt độ xác cao, số tế bào trung bình đếm nhỏ: 2.5 < a