BÁO cáo bài THÍ NGHIỆM hợp CHẤT tự NHIÊN(HOÀN CHỈNH)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG MÔN THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ Mã môn 605027 BÁO CÁO BÀI THÍ NGHIỆM HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Năm học 2021 2022 MỤC LỤC 1 TỔN.

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG MÔN :THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ Mã môn : 605027 BÁO CÁO BÀI THÍ NGHIỆM HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Năm học 2021-2022 MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rau má 1.2 Các phương pháp trích ly .1 1.2.1 Ngâm dầm .1 1.2.2 Chiết Soxhlet 1.2.3 Ngấm kiệt (PERCOLATION) .5 1.2.4 Phương pháp đun hoàn lưu 1.2.5 Chiết phương pháp lôi nước 1.2.6 Chiết với hỗ trợ vi sóng .8 1.2.7 Chiết với hỗ trợ siêu âm .9 1.2.8 Các cơng trình nghiên cứu trích ly lập hợp chất có rau má 1.3 Tổng quan hợp chất có hoạt tính sinh học 10 1.3.1 Alkaloids 10 1.3.2 Flavonoids 11 1.3.3 Glycoside .12 1.3.4 Tanin 13 1.3.5 Phenolic .14 1.3.6 Protein 15 1.3.7 Steroid 16 1.3.8 Phytosterol 16 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 17 2.1 Đo độ ẩm nguyên liệu 17 2.2 Trích ly phương pháp Soxhlet 17 2.3 Phân tích sơ hóa thực vật cao chiết 20 2.3.1 Cách pha thuốc thử 20 2.3.1.1 Mayer 20 2.3.1.2 Dragondroff (Kraul) .20 2.3.1.3 Wager (Bouchardat) 20 2.3.2 Định tính .20 2.3.2.1: Định tính alkaloids 20 2.3.2.2: Định tính Cardilac Glycoside 21 2.3.2.3: Định tính Saponin .22 2.3.2.4: Định tính Phytosterol 23 2.3.2.5: Định tính hợp chất tannins phenolic 24 2.3.2.6: Định tính Flavonoids 25 2.3.2.7: Định tính Steroid 26 2.3.3 Kết phân tích .27 2.4 Cô lập hợp chất 29 2.4.1 Tiến trình cô lập 29 2.4.2 Sơ đồ cô lập 32 2.4.3 Kết .33 MỤC LỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Phương pháp ngâm dầm Hình Sơ đồ quy trình thực .3 Hình Phương pháp Soxhlet .4 Hình Phương pháp ngấm kiệt Hình Phương pháp đun hồn lưu Hình Phương pháp lơi nước .8 Hình Phương pháp chiết với hỗ trợ vi sóng Hình Sách “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”- Đỗ Tất Lợi 10 Hình Hệ thống chiết cao rau má phương pháp soxlet 18 Hình 2 Sơ đồ chiết cao rau má 19 Hình Kết định tính alkaloids 21 Hình Kết định tính Cardilac Glycoside 22 Hình Kết định tính Saponin 23 Hình Kết định tính Phytosterol .24 Hình Kết định tính tannins phenolic .25 Hình Kết định tính flavonoids 26 Hình Kết định tính Steroid .27 Hình 10 Cao hexan trộn silicagel 30 Hình 11 Sắc ký cột 31 Hình 12 Sắc ký mỏng 31 Hình 13 Sơ đồ quy trình chạy cột 32 Hình 14 Các dung dịch tách lần 33 Hình 15 Kết chạy sắc ký mỏng soi UV hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:1) .34 Hình 16 Các dung dịch tách lần 35 Hình 17 Kết chạy sắc ký mỏng lần hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:2) (10:1) 35 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rau má Tên khoa học: Centella asiatica Tên gọi khác: Tích Tuyết Thảo, Liên Tiền Thảo, Lơi Công Thảo Đặc điểm thực vật: Thân rau má mảnh khảnh nhẵn, loại thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh đỏ, có rễ mấu Nó có hình thận, màu xanh với cuống dài phần đỉnh tròn, kết cấu trơn nhẵn với gân dạng lưới hình chân vịt Các mọc từ cuống dài khoảng 5–20 cm Bộ rễ bao gồm thân rễ, mọc thẳng đứng Chúng có màu trắng kem che phủ lơng tơ rễ Gân hình cung Qủa hình mắt lưới dày đặc, thường chín sau tháng tất phận thu hoạch thủ cơng Có nguồn gốc Australia, đảo Thái Bình Dương, New Guinea, Melanesia, Malesia châu Á Ở nước ta rau má mọc hoang khắp nơi, thường gặp bãi cỏ, bờ ruộng, ven suối, quanh làng 1.2 Các phương pháp trích ly 1.2.1 Ngâm dầm Hình 1 Phương pháp ngâm dầm Quy trình: Sau chuẩn bị dược liệu, đổ dung môi cho ngập dược liệu bình chiết xuất, sau thời gian ngâm định (quy định riêng cho loại dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc gạn) rửa dược liệu lượng dung mơi thích hợp Để tăng cường hiệu chiết xuất, tiến hành khuấy trộn cánh khuấy rút dịch chiết lại đổ lên (tuần hoàn cưỡng dung mơi) Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh ngâm động, ngâm nóng ngâm lạnh, ngâm lần nhiều lần (còn gọi ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ) Ưu điểm: Đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Nhược điểm: Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã nạp liệu) Nếu chiết lần khơng chiết kiệt hoạt chất dược liệu Nếu chiết nhiều lần dịch chiết lỗng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết 1.2.2 Chiết Soxhlet Định nghĩa: Chiết xuất Soxhlet phương pháp chiết xuất ứng dụng chiết béo chất hịa tan phân hủy dung môi liên tục tự động với hiệu suất chiết cao, cần thời gian tiêu thụ dung môi so với phương pháp ngâm ngấm kiệt Nhiệt độ cao thời gian chiết dài trình chiết Soxhlet làm tăng khả biến đổi hoạt chất nhiệt Quy trình: Hình Sơ đồ quy trình thực Cách tiến hành: Bước 1: Tráng tất thiết bị thủy tinh sấy khơ, khơng để dính nước Bước 2: Cân mẫu nghiền vụn khô cho vào túi giấy lọc sau cho vào ống chiết Bước 3: Lắp bình cầu lên bếp gia nhiệt, gắn chiết Soxhlet Đổ dung môi vào khoảng 2/3 bình cầu hai lần dung tích ống chiết, sau lắp ống sinh hàn vào Bước 4: Đun gia nhiệt để dung môi sôi đến dung dịch ống Soxhlet gần màu trình kết thúc Hình Phương pháp Soxhlet Ưu điểm: Sử dụng dung mơi mà chiết kiệt hoạt chất Sự ly trích tự động, liên tục nên nhanh chóng Dễ thu hồi dung mơi Nhược điểm: Khơng chiết lượng lớn mẫu Kích thước Soxhlet làm giới hạn lượng hợp chất cho vào, thích hợp nghiên cứu phịng thí nghiệm Trong trình chiết, hợp chất chiết trữ lại bình cầu, nên chúng ln bị đun sơi nhiệt độ sơi dung mơi hợp chất bền nhiệt carotenoid bị thủy giải, phân giải tạo hợp chất khác Giá thành cao, đồ thủy tinh cần cẩn thận sử dụng 1.2.3 Ngấm kiệt (PERCOLATION) Ngấm kiệt đơn giản: Là phương pháp ngấm kiệt sử dụng dung môi để chiết đến kiệt hoạt chất nguyên liệu Đâylà phương pháp trích ly sử dụng phổ biến khơng địi hỏi nhiều thao tác thời gian Dụng cụ gồm bình ngấm kiệt hình trụ đứng thủy tinh, đáy bình có van khóa để điều khiển tốc độ dung môi chảy Khi ngâm mẫu dung môi sau thời gian định, dung dịch chảy hứng erlen bên dưới, có bình lóng chứa dung mơi chảy vào bình ngấm kiệt Cách tiến hành: Ngâm ngun liệu vào dung mơi bình ngấm kiệt Sau khoảng thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung mơi phía cách cho dung mơi chảy chậm liên tục qua lớp dược liệu nằm n Lớp dung mơi bình chiết thường để ngập bề mặt nguyên liệu khoảng – cm - Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc Luu ý: khơng lắc q trình thí nghiệm Hiện tượng: Tách lớp a) b) Hình Kết định tính Cardilac Glycoside (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol) 2.3.2.3: Định tính Saponin Thao tác thí nghiệm - Lấy bột rau má khuấy với nước, đun 10 phút - Lọc lây dịch chiết - Lắc mạnh cho dung dịch tạo bọt Hiện tượng: Có bọt 22 c) Hình Kết định tính Saponin 2.3.2.4: Định tính Phytosterol Thao tác thí nghiệm - Cho (rất ít) mẫu cao hịa tan với mL acid acetic, lắc - Cho mL acetic anhydric - Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc Hiện tượng: Dung dịch chuyển màu xanh ngọc bích 23 a) b) c) Hình Kết định tính Phytosterol (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol) 2.3.2.5: Định tính hợp chất tannins phenolic Thao tác thí nghiệm - Cho mẫu cao hịa tan với nước, khuấy, lắc - Chia dung dịch vào ống nghiệm: ▪ Ống nghiệm 1: Nhỏ giọt FeCl3 5% ▪ Ống nghiệm 2: Nhỏ giọt Chì acetate 10% Hiện tượng: 24 a) b) c) Hình Kết định tính tannins phenolic(a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol) 2.3.2.6: Định tính Flavonoids Thao tác thí nghiệm - Cho mẫu cao hòa tan với etanol, lắc - Thêm bột Mg - Thêm mL HCl đậm đặc - Đem hơ nóng Hiện tượng: 25 a) b) c) Hình Kết định tính flavonoids (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol) 2.3.2.7: Định tính Steroid Thao tác thí nghiệm - Cho mẫu cao hịa tan với chlorofom, lắc - Thêm mL anhydrit acetic - Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc Hiện tượng: 26 a) b) c) Hình Kết định tính Steroid (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol) 2.3.3 Kết phân tích Ca Định Thuốc tính Hiện tượng thử o nhexan Mayer’s Alkaloi Tủa nhạt Dragondr Tủa cam off’s ds Bouchard nâu Tủa đỏ at o Et hyl acetate Ca o Eth anol - - - - - - - - - + + + H SO + Glycos ides Cardiac vàng Ca CH COO Tách lớp H 27 băng + FeCl 5% Saponi Bột rau Sủi bọt má, nước n + + + + + + - - - - - + - - + + + + CH COO Phytost erol H +(CH CO )2O Xuất màu xanh lục + H SO 4đđ FeCl 5% Tanin phenolic màu xanh đen Pb(OCO CH ) 10% Flavan oids Xuất Bột Xuất tủa trắng Mg, HCl đđ Xuất màu đỏ tươi Đầu Clorofor Steroid s tiên xuất màu vàng úa, sau m, Anhydrid e acetic, H SO 4đđ màu xanh cuối tách lớp vàng– xanh 28 2.4 Cơ lập hợp chất 2.4.1 Tiến trình cô lập Chuẩn bị cột: - Cột sắc ký thường là ống thủy tinh đường kính 50 mm trở lên, chiều cao từ 50cm – 1m phía có hình vịi - Cột rửa sấy khơ, gắn lên giá vững - Chuẩn bị becher có chứa sẵn thể tích silicagel phù hợp với cột, hịa với dung mơi etyl hexane-ethyl acetate (7:1), vừa rót vừa khuấy nhẹ Tránh để chất hấp thu bị vón cục Nhồi cột - Dùng lớp bơng gịn thật mỏng chặn phía đầu cột tiếp theo, ngâm bơng gịn trước cột với hexane-ethyl acetate (7:1) khoảng phút, sau xả cột đồng thời cho chất hấp phụ silicagel dạng sệt (sillicagel tích phù hợp với cột trộn với dung môi khởi điểm) cho vào cột vừa mở nhẹ khóa bên cột dung môi chảy hứng vào becher trống để sử dụng lại dung mơi rót lại đầu cột - Bên cạnh dùng đũa khuấy bóp cao su gõ thật nhẹ lên thành cột để hạn chế tối đa hình thành bọt khí, giúp nén cột chất hấp thụ khơng bị bám dính thành cột - Đổ lần, nhẹ nhàng để tránh làm nứt cột, tuyệt đối không để cột khô nên phải liên tục đổ dung môi vừa hứng đầu ra, rót lại đầu vào cột Chạy tới lớp sillicagel cột không thay đổi chiều cao ngưng lại Tránh trường hợp làm nhấp nhô, lồi lõm bề mặt sillicagel làm ảnh hưởng đến trình giải ly sắc ký cột Nạp mẫu - Xác định hệ dung môi giải ly sắc ký cột phù hợp qua việc dò sắc ký mỏng - cho kết Rf khoảng 0.5 (vết cần phân lập nằm Vì vậy, ta chọn hệ dung môi khởi điểm hexane-ethyl acetate (7:1) - Cho cao rau má hexan trộn chung với dung môi giống hệ dung môi giải ly 29 - Để cho tan hoàn toàn trộn với sillicagel mẫu tơi, mịn kích thước hạt sillicagel ban đầu đổ vào cột nhẹ nhàng để lớp cao nằm lớp silicagel (vẫn chừa lại dung mơi khởi điểm phía q trình tráng-kiểm tra cột để mẫu hòa tan dễ dàng hơn) - Nạp mẫu xong mở khóa cột chậm để tồn dung dịch mẫu thấm vào silicagel, tuyệt đối không để khơ cột, rót tiếp dung mơi pha sẵn vào cột liên tục - Mẫu chạy xuống đầu cột ta dùng ống nghiệm để thu mẫu Hình 10 Cao hexan trộn silicagel Quá trình giải ly cột Hứng dung dịch giải ly nhiều ống nghiệm khác nhau, chấm dung dịch giải ly để đem thực sắc ký mỏng Những ống nghiệm có kết sắc ký lớp mỏng giống gom chung lại với Q trình thực sắc kí mỏng Bước 1: Chuẩn bị mao quản, dùng becher chứa ethanol rửa mao quản sau chấm mẫu bơng gịn để thấm mẫu dư Bước 2: Dùng mao quản chấm lên dung dịch mẫu ống nghiệm chấm trực tiếp lên mỏng chấm nhẹ vạch 0.5cm phía Bước 3: Pha sẳn dung môi giải ly hexane-ethyl acetate (7:1) 30 Bước 4: Dùng nhíp gắp bảng mỏng chấm mẫu lên bỏ vào lọ (phải lọ kín có nắp đậy) có chứa dung mơi giải ly, vết mẫu không ngập dung môi giải ly Bước 5: Sau chờ dung mơi chạy đến vạch 0.2 cm phía mỏng, lấy đem soi đèn UV để ghi nhận lại kết Hình 11 Sắc ký cột Hình 12 Sắc ký mỏng 31 2.4.2 Sơ đồ cô lập hexane-ethyl acetate (7:1) hexane-ethyl acetate (7:1) Hình 13 Sơ đồ quy trình chạy cột 32 2.4.3 Kết Khi chạy sắc ký cột ta thấy dung dịch tách thành nhiều lớp khác rõ rệt, ta tiến hành tách lớp thu hồi lớp dung dịch Sau đó, dùng dung dịch vừa thu tiếp tục thực đo sắc ký mỏng với hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:1), hệ giải ly hexane-ethyl acetate (7:1) Ta thu kết sau: Hình 14 Các dung dịch tách lần a) b) 33 c) d) e) Hình 15 Kết chạy sắc ký mỏng soi UV hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:1) Để tách hồn tồn chất có lớp dung dịch ta tiến hành chạy sắc ký mỏng để tìm hệ dung mơi thích hợp Sau đó, ta tiến hành chạy sắc ký cột tương tự để lập hồn tồn chất có lớp dung dịch Nhóm em tiến hành chạy cột lần với mẫu số sau chấm sắc ký mỏng cho thấy vết đậm Sử dụng hệ dung mơi chạy cột hexane-ethyl acetate (7:2), sau thay đổi tỷ lệ 10:1 34 a) b) Hình 16 Các dung dịch tách lần (a tỷ lệ 7:2, b tỷ lệ 10:1) Hình 17 Kết chạy sắc ký mỏng lần hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:2) (10:1) 35 36 ... cứu phịng thí nghiệm Trong trình chiết, hợp chất chiết trữ lại bình cầu, nên chúng ln bị đun sôi nhiệt độ sôi dung môi hợp chất bền nhiệt carotenoid bị thủy giải, phân giải tạo hợp chất khác... 2.3.2.5: Định tính hợp chất tannins phenolic Thao tác thí nghiệm - Cho mẫu cao hòa tan với nước, khuấy, lắc - Chia dung dịch vào ống nghiệm: ▪ Ống nghiệm 1: Nhỏ giọt FeCl3 5% ▪ Ống nghiệm 2: Nhỏ giọt... giảm hấp thu chất ruột, ứng dụng để giải độc trường hợp ngộ độc alcaloid kim loại nặng Cũng lý này, khơng nên uống thuốc với nước trà 1.3.5 Phenolic Khái niệm: Các hợp chất phenolic hợp chất có nhiều