TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG MÔN THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ Mã môn 605027 BÁO CÁO BÀI THÍ NGHIỆM HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Năm học 2021 2022 MỤC LỤC 1 TỔN.
TỔNG QUAN
Tổng quan về rau má
Tên khoa học: Centella asiatica
Tên gọi khác: Tích Tuyết Thảo, Liên Tiền Thảo, Lôi Công Thảo Đặc điểm thực vật: Thân cây rau má mảnh khảnh và nhẵn, là loại thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh đỏ, có rễ ở các mấu Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài và phần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt Các lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5–20 cm Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng đứng Chúng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ Gân lá hình cung Qủa hình mắt lưới dày đặc, thường chín sau 3 tháng và tất cả các bộ phận của cây được thu hoạch thủ công Có nguồn gốc Australia, các đảo Thái Bình Dương, New Guinea, Melanesia, Malesia và châu Á Ở nước ta rau má mọc hoang khắp nơi, thường gặp ở các bãi cỏ, bờ ruộng, ven suối, quanh các làng bản.
Các phương pháp trích ly
Hình 1 1 Phương pháp ngâm dầm
Quy trình: Sau khi chuẩn bị dược liệu, đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng loại dược liệu), rút lấy dịch chiết
(lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi)
Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ) Ưu điểm: Đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền
Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu)
Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu
Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết
1.2.2 Chiết Soxhlet Định nghĩa: Chiết xuất Soxhlet là một phương pháp chiết xuất ứng dụng chiết béo và những chất có thể hòa tan và phân hủy trong dung môi liên tục tự động với hiệu suất chiết cao, cần ít thời gian và tiêu thụ dung môi hơn so với phương pháp ngâm hoặc ngấm kiệt Nhiệt độ cao và thời gian chiết dài trong quá trình chiết Soxhlet sẽ làm tăng khả năng biến đổi hoạt chất vì nhiệt
Bước 1: Tráng sạch tất cả các thiết bị thủy tinh và sấy khô, không để dính nước
Bước 2: Cân mẫu đã nghiền vụn và khô cho vào túi giấy lọc sau đó cho vào ống chiết
Bước 3: Lắp bình cầu lên bếp gia nhiệt, gắn bộ chiết Soxhlet Đổ dung môi vào khoảng 2/3 bình cầu hoặc hai lần dung tích ống chiết, sau đó lắp ống sinh hàn vào
Hình 1 2 Sơ đồ quy trình thực hiện
Bước 4: Đun gia nhiệt và để dung môi sôi đến khi dung dịch trong ống Soxhlet gần như mất màu thì quá trình kết thúc Ưu điểm:
Sử dụng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất
Sự ly trích tự động, liên tục nên nhanh chóng
Dễ thu hồi dung môi
Không chiết được một lượng lớn mẫu
Kích thước Soxhlet làm giới hạn lượng hợp chất cho vào, chỉ thích hợp các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Trong quá trình chiết, các hợp chất được chiết ra trữ lại trong bình cầu, nên chúng luôn bị đun sôi ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế hợp chất nào kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị thủy giải, phân giải hoặc tạo các hợp chất khác
Giá thành cao, đồ thủy tinh cần cẩn thận khi sử dụng
Ngấm kiệt đơn giản: Là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môi mới để chiết đến kiệt hoạt chất trong nguyên liệu Đâylà một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất vì không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian
Dụng cụ gồm một bình ngấm kiệt hình trụ đứng bằng thủy tinh, ở dưới đáy bình có van khóa để điều khiển tốc độ dung môi chảy ra Khi đã ngâm mẫu cây trong dung môi sau một thời gian nhất định, dung dịch chảy ra được hứng trong một erlen bên dưới, ở trên có một bình lóng chứa dung môi chảy vào bình ngấm kiệt này
Ngâm nguyên liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt Sau một khoảng thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt nguyên liệu khoảng 3 – 4 cm
Nguyên liệu được chiết kiệt
Tiết kiệm được dung môi ( tái nghâm kiệt)
Có năng suất thấp, lao động thủ công
Cách tiền hành phức tạp hơn so với phương pháp ngâm Tốn dung môi (Ngấm kiệt đơn giản)
Hình 1 4 Phương pháp ngấm kiệt
1.2.4 Phương pháp đun hoàn lưu
Bột cây và dung môi hữu cơ được chứa trong một bình cầu có gắn ống sinh hàn Đun hoàn lưu trên bếp cách thủy ở nhiệt độ sôi của dung môi Sau một thời gian cần thiết, dung dịch chiết được lấy ra và lọc qua giấy lọc Dung môi mới được đưa vào và chiết thêm 3-4 lần nữa cho đến khi kiệt Hiếm khi người ta đun bột cây với dung môi là nước, dù đây là phương pháp trong dân gian vẫn hay dùng để sắc thuốc để uống và một số chất cũng tan được trong nước, nhưng vì nước có nhiệt độ sôi cao và áp suất hơi nhỏ nên rất khó cô cạn
1.2.5 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Đây là phương pháp đặc biệt dùng để ly trích tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi có trong cây Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình có chứa mẫu cây, hơi nước xuyên thấm qua mẫu cây và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi; hơi nước tiếp tục bay hơi và được ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hỗn hợp nước-tinh dầu Dùng ether dầu hỏa hay ether ethyl để ly trích tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình lóng sẽ có sự tách giữa 2 pha tinh dầu – nước
Hình 1 5 Phương pháp đun hoàn lưu
Hình 1 6 Phương pháp lôi cuốn hơi nước
1.2.6Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
Trong chiết xuất, chiếu xạ vi sóng (bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz) vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử này sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường → làm sinh ra nhiệt trong lòng một khối vật chất, làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi
Vi sóng cũng phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết → chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn Đặc biệt thích hợp cho cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước → thời gian chưng cất rút ngắn, hàm lượng tinh dầu thu được cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn
1.2.7Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Sóng siêu âm với tần số trên 20 kHz có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết
Thường được sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn
Tổng quan về các hợp chất có hoạt tính sinh học
Khái niệm: Alkaloids là các hợp chất hữu cơ, có phản ứng kiềm Có chứa N, đa số có nhân dị vòng, thường từ thực vật (đôi khi từ động vật), có dược tính rõ rệt Cho phản ứng với các “thuốc thử chung của alkaloid”
Theo tác dụng dược lý: trị sốt rét, an thần, tạo ảo giác…
Theo taxon thực vật: họ Fabaceae, chi Atropa, Datura
Theo nguồn sinh vật: động vật, thực vật, rêu, nấm… - Theo nguồn acid amin: từ tyr, tryp, orn, lys, his
Theo bậc của Nitơ: N bậc I, II, III, IV; N-oxyd - Theo đường sinh tổng hợp : pseudo-, proto-
Theo cấu trúc hóa học : purin, tropan, quinolin, indol
Hoạt tính sinh học: Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid mà tác dụng đối với sinh vật, con người, mục đích y học
Hình 1 8 Sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”- Đỗ Tất Lợi
▪ Tác dụng lên hệ thần kinh
- Kích thích thần kinh trung ương: strychnine, caffeine
- Ức chế thần kinh trung ương: morphin Codeine
- Kích thích thần kinh giao cảm: ephedrine
- Kích thích phó giao cảm: pilocarpin
- Liệt phó giao cảm: atropine
▪ Tác dụng hạ huyết áp: reserpine, serpentin
▪ Tác dụng chống ung thư: taxol, vinblastine, vincristine
▪ Tác dụng diệt ký sinh trùng,diệt khuẩn: quinine, berberine, arecoline, metine
Là những chất dự trữ Ni tơ, tham gia vào chu trình ni tơ trong thực vật Đôi khi là những chất tích lũy dần từ thức ăn ( kiến lấy alk từ lá cây; ếch, cóc ăn kiến → ếch, cóc có alk) Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật, vũ khí hóa học trong tự vệ, cần có trong quá trình sinh tồn nhất là ở động vật ( cá, cóc, kỳ nhông, ) Khi thực vật có nhóm alkaloid thì tác dụng dược liệu của nó thường do nhóm alkaloid là chủ yếu
Flavonoid là nhóm hợp chất lớn, gặp nhiều trong rau quả, cây cỏ và thức ăn hàng ngày đặc biệt là trong được liệu nguồn gốc thực vật Flavonoid là những chất màu thực vật Phần lớn các chất Flavonoid có màu vàng Tuy nhiên, một số chất có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu
Flavonoid có khung cơ bản gồm 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon Trong đa số trường hợp mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C có chứa oxy, dị vòng C có thể là: Dihydro pyran, -pyron, Dihydro –pyron
Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do OH*, ROO* Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin > quecetin > rhammetin > morin > diosmetin > narigenin > catechin > 5,7-dihydroxy-3’,4’,5’trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon
Flavonoid tạo được phức với các kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa
Phân loại: Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C Được chia thành các nhóm:
- Eu Flavonoid: Flavon, Flavanon, Flavonol,…
- Iso- Flavonoid: isoflavon, isoflavanon, isoflavan,…
▪ Tác dụng của flavonoid đối với thực vật
- Dẫn dụ côn trùng, giúp cho sự thụ phấn
- Bảo vệ cây / tia UV từ mặt trời,
- Bảo vệ cây / côn trùng, nấm mốc, vi sinh vật
- Ức chế enzym, điều hòa sinh trưởng, ↑ tạo nốt sần cố định đạm / họ Fabaceae
▪ Tác dụng của flavonoid đối với con người
- Khả năng dập tắt các gốc tự do, chống oxy hóa
- Tác dụng làm bền thành mạch (tác dụng kiểu vitamin P)
- Giảm tổn thương, bảo vệ chức năng gan
- Chống co thắt, chống loét
- Kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, kháng virus
- Thuốc dùng cho những người não suy: rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc trí bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng hay cáu gắt
- Có tác dụng thông tiểu, làm thuốc hạ đường huyết
Khái niệm: Là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai phần: phần đường và phần không đường Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân hủy khi có nước dưới ảnh hưởng
13 của các enzim (men)có chứa trong cây Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose…
Phân loại: Phần đường và phần không đường của các glycosid thường nối với nhau bằng cầu nối oxy hoặc các cầu nối khác như S,N Người ta có thể phân loại glycosid theo cầu nối Một số trường hợp phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối ester, loại này được gọi là pseudoglycosid(Asiaticosid)
Hệ thống phân loại thường dùng hiện nay là phân loại theo cấu trúc của phần không đường nhười ta chia thành các nhóm chất: glycosid tim, iridoid, saponin, anthranoid, flavonoid, coumarin, tanin…
Hoạt tính sinh học: Glycosid trợ tim là một nhóm glycosid có cấu trúc steroid, có tác dụng đặc hiệu đối với bệnh tim nhưng với liều cao chúng là các chất gây độc Trong cây, chúng tồn tại ở dạng glycosid hoà tan trong các dịch tế bào Dưới tác dụng của enzym hay acid loãng, các glycosid bị thuỷ phân tạo thành các genin và các ose Là glycosid nên chúng tan nhiều trong nước và cồn loãng, ít tan trong các dung môi không phân cực như ete, dầu, benzen
Tác dụng: của glycosid tim làm tăng sức co bóp của cơ tim cả ở người lành lẫn người bệnh; làm tăng trương lực cơ tim: làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng, giãn do vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích và kích thước tim; làm chậm nhịp tim: do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút xoang; làm giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất; làm giảm tính kích thích của cơ tâm nhĩ, nhưng trái lại, làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất; gây lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu natri ở ống lượng gần
Khái niệm: Tanin là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát, dương tính với phản ứng thuộc da, và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn
Phân loại: Dựa vào cấu trúc hoá học, tanin được phân làm hai loại:
Tanin thuỷ phân được hay còn gọi là tanin pyrogallic vì sau khi bị thuỷ phân, những tanin thuộc nhóm này sẽ bị cắt ra thành một đường, thường là glucose và một acid, thường là acid gallic
Tanin không thuỷ phân được hay tanin ngưng tụ Dưới tác dụng của acid hay enzym, chúng dễ tạo thành tanin đỏ hoặc một sản phẩm trùng hợp gọi là phlobaphen rất ít tan trong nước Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như vỏ Canhkina, vỏ quế,…
Do có tính tạo tủa với protein, khi tiếp xúc với niêm mạc, tổ chức da bị tổn thương hay vết loét,… tanin sẽ tạo một màng mỏng, làm máu đông lại, ngừng chảy nên ứng dụng làm thuốc đông máu và thuốc săn se da
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Đo độ ẩm của nguyên liệu
Độ ẩm được đo bằng máy Độ ẩm nguyên liệu: 10,14%
Trích ly bằng phương pháp Soxhlet
Nguyên liệu được trích bằng phương pháp soxhlet
Bước 1: Cho 24,68g bột rau má vào túi lọc rồi đưa túi lọc vào bộ chiết soxhlet
Bước 2: Rót dung môi (Hexan) vào từ trên bộ soxhlet xuống, cho chảy đến nửa bình cầu Bước 3: Bật bếp đun Tiến hành chiết trong vài giờ đến khi ống chuyển của bộ chiết trong suốt (ban đầu màu xanh)
Bước 4: Rót dung môi trong bình ra mang đi cô quay thu được cao hexan và dung môi Thu hồi lại dung môi
Bước 5: Tiếp tục đổ dung môi mới là Ethyl Acetate, cho chảy đến nửa bình cầu vào phần bột rau má vẫn còn trong bộ Soxhlet
Tiếp tục làm các bước như trên Lặp lại như vậy với dung môi thứ 3 là Etanol
Sau khi cô quay sẽ thu được thêm cao Ethyl Acetate và cao Etanol
Hình 2 1 Hệ thống chiết cao rau má bằng phương pháp soxlet
Hình 2 2 Sơ đồ chiết cao rau má
Phân tích sơ bộ hóa thực vật cao chiết
Công thức: K2HgI4 [ Kali – thủy phân (II) iodua – kaliumiodomercurat]
Là thuốc thử alkaloid thông thường, cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể cả trong dung dịch acid loãng, được điều chế bằng cách hoàn tan hỗn hợp thủy ngân clorua (1,35g) và kali iodua (5,00g) trong nước (100,0 mL)
Công thức: KBiI4 [Kali – bizmut iodua]
Là thuốc thử alkaloid cho tủa kết tinh màu vàng cam (đỏ), được điều chế bằng cách cho 8(g) Bi(NO3)2.5H2O hòa tan trong 20 ml nước, trộn đều và để yên
Công thức: KI3 [dung dịch kali – iodua 0.1N +I2]
Cho tủa kết tinh màu nâu đỏ sẫm với alkaloid, điều chế bằng cách hòa tan 2(g) Iot và 6(g)
- Cho một ít mẫu cao hòa tan với nước, khuấy, lắc
- Chia dung dịch vào 3 ống nghiệm:
▪ Ống nghiệm 1: Nhỏ 2 giọt Mayer
▪ Ống nghiệm 2: Nhỏ 2 giọt Dragondroff
▪ Ống nghiệm 3: Nhỏ 2 giọt Wager
Cao hexan: Không tan trong nước Sau khi cho thuốc thử thì không có hiện tượng
Cao ethyl acetate: Không tan trong nước Sau khi cho thuốc thử thì không có hiện tượng Cao etanol: Tan trong nước Sau khi cho thuốc thử thì không có hiện tượng a) b) c)
- Cho một ít (rất ít) mẫu cao hòa tan với 1 mL acid acetic băng, lắc
Hình 2 3 Kết quả định tính alkaloids (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
- Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc
Luu ý: không được lắc trong quá trình thí nghiệm
- Lấy một ít bột rau má khuấy đều với nước, đun 10 phút
- Lắc mạnh cho dung dịch tạo bọt
Hình 2 4 Kết quả định tính Cardilac Glycoside (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
- Cho một ít (rất ít) mẫu cao hòa tan với 1 mL acid acetic, lắc
- Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc
Hiện tượng: Dung dịch chuyển màu xanh ngọc bích
Hình 2 5 Kết quả định tính Saponin
2.3.2.5: Định tính hợp chất tannins và phenolic
- Cho một ít mẫu cao hòa tan với nước, khuấy, lắc
- Chia dung dịch vào 2 ống nghiệm:
▪ Ống nghiệm 1: Nhỏ 2 giọt FeCl3 5%
▪ Ống nghiệm 2: Nhỏ 2 giọt Chì acetate 10%
Hình 2 6 Kết quả định tính Phytosterol (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
Hình 2 7 Kết quả định tính tannins và phenolic(a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
- Cho một ít mẫu cao hòa tan với etanol, lắc
- Thêm 1 mL HCl đậm đặc
26 a) b) c) Hình 2 8 Kết quả định tính flavonoids (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
- Cho một ít mẫu cao hòa tan với chlorofom, lắc
- Cho 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc
Hình 2 9 Kết quả định tính Steroid (a Cao hexan, b Cao ethyl acetate, c Cao etanol)
2.3.3 Kết quả phân tích Định tính
Bột rau má, nước Sủi bọt + + +
Xuất hiện màu xanh lục + + +
FeCl3 5% Xuất hiện màu xanh đen - - -
Xuất hiện màu đỏ tươi - - +
H2SO4đđ Đầu tiên xuất hiện màu vàng úa, sau đó là màu xanh lá và cuối cùng tách lớp vàng– xanh lá
Cô lập hợp chất
- Cột sắc ký thường là là một ống thủy tinh đường kính 50 mm trở lên, chiều cao từ 50cm – 1m phía dưới có hình vòi
- Cột được rửa và sấy khô, gắn lên giá vững
- Chuẩn bị một becher đã có chứa sẵn thể tích silicagel phù hợp với cột, hòa với một ít dung môi etyl hexane-ethyl acetate (7:1), vừa rót vừa khuấy nhẹ đều Tránh để chất hấp thu bị vón cục
- Dùng 1 lớp bông gòn thật mỏng chặn phía đầu ra của cột tiếp theo, ngâm bông gòn trước trong cột với hexane-ethyl acetate (7:1) trong khoảng 5 phút, sau đó xả cột và đồng thời cho chất hấp phụ là silicagel dạng sệt (sillicagel có thể tích phù hợp với cột và đã được trộn với dung môi khởi điểm) cho vào cột vừa mở nhẹ khóa bên dưới cột để cho dung môi chảy ra hứng vào 1 becher trống để sử dụng lại dung môi này rót lại đầu cột
- Bên cạnh đó dùng đũa khuấy hoặc bóp cao su gõ thật nhẹ lên thành cột để hạn chế tối đa sự hình thành bọt khí, giúp nén đều trong cột và chất hấp thụ không bị bám dính trên thành cột
- Đổ một lần, nhẹ nhàng để tránh làm nứt cột, tuyệt đối không được để cột khô nên phải liên tục đổ dung môi vừa hứng được ở đầu ra, rót lại đầu vào của cột Chạy tới khi nào lớp sillicagel trong cột không thay đổi chiều cao thì ngưng lại Tránh trường hợp làm nhấp nhô, lồi lõm bề mặt sillicagel làm ảnh hưởng đến quá trình giải ly sắc ký cột
- Xác định hệ dung môi giải ly sắc ký cột phù hợp qua việc dò bằng sắc ký bản mỏng - cho kết quả Rf khoảng 0.5 (vết cần phân lập nằm giữa bản Vì vậy, ta chọn hệ dung môi khởi điểm là hexane-ethyl acetate (7:1)
- Cho cao rau má hexan trộn chung với 1 ít dung môi giống hệ dung môi giải ly
- Để cho tan hoàn toàn rồi trộn với sillicagel cho tới khi nào mẫu tơi, mịn như kích thước hạt sillicagel ban đầu rồi đổ vào cột nhẹ nhàng để lớp cao nằm trên lớp silicagel (vẫn chừa lại một ít dung môi khởi điểm phía trên của quá trình tráng-kiểm tra cột để mẫu hòa tan dễ dàng hơn)
- Nạp mẫu xong mở khóa cột chậm để toàn bộ dung dịch mẫu thấm đều vào silicagel, tuyệt đối không được để khô cột, rót tiếp dung môi pha sẵn vào cột liên tục
- Mẫu sẽ dần dần chạy xuống đầu ra của cột ta dùng ống nghiệm để thu mẫu
Hình 2 10 Cao hexan trộn silicagel
Quá trình giải ly cột
Hứng dung dịch giải ly trong nhiều ống nghiệm khác nhau, chấm một ít dung dịch giải ly để đem đi thực hiện sắc ký bản mỏng Những ống nghiệm nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau
Quá trình thực hiện sắc kí bản mỏng
Bước 1: Chuẩn bị 1 mao quản, dùng một becher chứa ethanol rửa sạch mao quản sau khi chấm mẫu và bông gòn để thấm mẫu dư
Bước 2: Dùng mao quản chấm lên dung dịch mẫu trong ống nghiệm rồi chấm trực tiếp lên bản mỏng một chấm nhẹ chính giữa ở vạch 0.5cm phía dưới
Bước 3: Pha sẳn dung môi giải ly hexane-ethyl acetate (7:1)
Bước 4: Dùng nhíp gắp bảng mỏng đã được chấm mẫu lên bỏ vào các lọ (phải là lọ kín có nắp đậy) có chứa dung môi giải ly, các vết mẫu không được ngập quá dung môi giải ly
Bước 5: Sau đó chờ cho đến khi dung môi chạy đến vạch 0.2 cm phía trên của bản mỏng, lấy ra đem đi soi đèn UV để ghi nhận lại kết quả
Hình 2 12 Sắc ký bản mỏng
2.4.2 Sơ đồ cô lập hexane-ethyl acetate (7:1) hexane-ethyl acetate (7:1)
Hình 2 13 Sơ đồ quy trình chạy cột
Khi chạy sắc ký cột ta thấy dung dịch tách thành nhiều lớp khác nhau rõ rệt, ta tiến hành tách từng lớp và thu hồi từng lớp dung dịch Sau đó, dùng dung dịch vừa thu được tiếp tục thực hiện đo sắc ký bản mỏng với hệ dung môi hexane-ethyl acetate (7:1), hệ giải ly hexane-ethyl acetate (7:1) Ta thu được kết quả như sau: a) b)
Hình 2 14 Các dung dịch được tách lần 1
34 c) d) e) Để có thể tách được hoàn toàn những chất có trong lớp dung dịch ta tiến hành chạy sắc ký bản mỏng để tìm hệ dung môi thích hợp Sau đó, ta tiến hành chạy sắc ký cột tương tự như trên để có thể cô lập được hoàn toàn những chất có trong lớp dung dịch
Nhóm em đã tiến hành chạy cột lần 2 với mẫu số 2 vì sau khi chấm sắc ký bản mỏng cho thấy các vết khá đậm Sử dụng hệ dung môi chạy cột là hexane-ethyl acetate (7:2), sau đó thay đổi tỷ lệ 10:1
Hình 2 15 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng và soi UV của hệ dung môi hexane-ethyl acetate
Hình 2 16 Các dung dịch được tách lần 2 (a tỷ lệ 7:2, b tỷ lệ 10:1)
Hình 2 17 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng lần 2 của hệ dung môi hexane-ethyl acetate
