Ảnh hưởng của môi trường khoáng và 6-benzylaminopurine đến quá trình nhân giống in vitro cây cấy nắp ấm (Nepenthes hook miracle x Viking ampullaria) một loài dược liệu quý hiếm

Bài viết Ảnh hưởng của môi trường khoáng và 6-benzylaminopurine đến quá trình nhân giống in vitro cây cấy nắp ấm (Nepenthes hook miracle x Viking ampullaria) một loài dược liệu quý hiếm được thực hiện nhằm xác định loại môi trường khoáng với hàm lương đa lượng thích hợp và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển của cây nắp ấm.

ẢNH HƯỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG KHỐNG VÀ 6BENZYLAMINOPURINE ĐẾN Q TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CẤY NẮP ẤM (NEPENTHES HOOK MIRACLE X VIKING AMPULLARIA) MỘT LOÀI DƯỢC LIỆU QUÝ HIẾM Nguyễn Hồng Đan Thư Bạch Thị Bích Ngọc Viện Khoa Học Ứng Dụng, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS Trịnh Thị Lan Anh TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, Nắp ấm in vitro có chiều cao khoảng 0,5 cm chọn làm nguồn mẫu cho thí nghiệm Cây ni cấy loại mơi trường khống MS, WPM, SH hàm lượng 1, 1/2, 1/4 khoáng đa lượng đồng thời bổ sung 150 ml/l nước dừa; 8,5g/l agar; 1,5g/l than hoạt tính Đối với thí nghiệm BAP (6-Benzylaminopurine) mơi trường khống sử dụng mơi trường khống có nồng độ đa lượng mà phát triển tối ưu Kết cho thấy, sau 60 ngày nuôi cấy mơi trường khống WPM với hàm lượng đa lượng không đổi giúp Nắp ấm phát triển tốt cho sinh trưởng phát triển cây, khả tạo chồi lên đến 69,7% Ở thí nghiệm BAP mơi trường khống WPM giữ ngun đa lượng khả tạo chồi đạt đến 81% nồng độ ml/l sau 60 ngày ni cấy Từ khóa: Nắp Ấm, dược liệu, mơi trường khống, BAP, Nepenthes., nhân giống in vitro GIỚI THIỆU Ở Việt Nam loài thực vật ăn thịt nhiều người biết đến thường nằm họ Nắp ấm Tuy chưa thống kê đầy đủ loài thực vật hầu hết xếp vào nhóm thực vật diệu kỳ giới ăn thịt Từ lâu, nắp ấm sử dụng y học dân gian chúng sử dung điều trị bệnh như: bệnh phong, bệnh tiêu chảy vi khuẩn Vibrio gây ra, bệnh quáng gà, kiết lỵ, đau dày, bệnh loét dày, vàng da, cao huyết áp, sỏi niệu viêm gan (Đỗ Tất Lợi, 2003) Ngày nay, hoạt động dược lý Nắp ấm nghiên cứu nhiều hơn, hoạt tính sinh học công bố hàng loạt kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa chống sốt rét, chống đái tháo đường, chống loãng xương, chống viêm, độc tế bào hoạt động hạ sốt Các nghiêm cứu khả chống ung thư, kháng virus, thực chưa có kết khả quan (Sissi Miguel cộng 2020) Do nhu cầu làm thuốc làm cảnh nắp ấm ngày lớn nên loài dần cạn kiệt tự nhiên khai thác mức diện tích đất ngồi tự nhiên bị thu hẹp, hiểu nhu cầu cấp thiết việc bảo tồn loại “diệu kỳ” nhiều cơng trình nghiên cứu thực hiện, năm 2020, Sissi Miguel cộng thực đề tài “ tái sinh in vitro Nepenthes mirabilis biến đổi gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium” Năm 2008 Bahadu cộng nghiên cứu nuôi cấy mô N khasiana từ mắt 481 thân chồi Năm 2009, Iaibadaiahun Nongrum cộng thực đề tài “ Gieo hạt in vitro Nepenthes khasiana Hook f., loài thực vật ăn trùng độc đáo Ấn Độ” Tuy có nhiều cơng trình nghiên cứu có cơng trình quan tâm đến ảnh hưởng loại mơi trường khống đến sinh trưởng nghiên cứu “ ảnh hưởng mơi trường khống, chất điều hòa sinh trưởng BAP đến cây Nắp ấm (Nepenthens) in vitro” thực nhằm xác định loại mơi trường khống với hàm lương đa lượng thích hợp ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng BAP đến phát triển nắp ấm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Sử dụng nắp ấm in vitro nhân giống chăm sóc phịng thí nghiệm CNSH thực vật viện Khoa Học Ứng Dụng trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp 2.2.1 Mơi trường ni cấy Mơi trường ni cấy mơi trường khống MS (Murashige Skoog, 1962), môi trường nuôi cấy thân gỗ WPM (Woody Plant Medium theo Lloyd & McCown, 1981), mơi trường khống SH (Schenk & Hildebrandt Medium, 1972) Bổ sung thêm thành phần nước dừa (150 ml/l), đường (30 g/l), agar (8,5 g/l), than hoạt tính (1,5 g/l), chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP) Môi trường khử trùng nồi hấp khử trùng 121oC, áp suất atm 20 phút Theo dõi ghi nhận kết sau 60 ngày nuôi cấy 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường đến phát triển của nắp ấm từ chọn lựa mơi trường thích hợp cho phát triển Sau chọn lọc loại môi trường thích hợp tiến hành thí nghiệm với BAP nồng độ khác mơi trường vừa tìm Các mẫu cấy nuôi cấy ánh sáng huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 18h/ngày Cường độ chiếu sáng từ 1500 – 3000 lux tùy thí nghiệm Nhiệu độ từ 20 – 25 ± 2oC Độ ẩm trung bình khoảng 85 – 90% Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, nghiệm thức lặp lại lần Dung tích bình 100 ml với thể tích mơi trường bình 30 ml mơi trường 2.2.3 Bố trí thí nghiệm a Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống có hàm lượng đa lượng giảm 1/4 đến tăng trưởng, nhân nhanh tạo hoàn chỉnh Nắp ấm Chọn nắp ấm in vitro có chiều cao khoảng 0,5cm, số đạt từ –– lá, giai đoạn tăng trưởng tốt 482 Tiến hành nuôi cấy mẫu nắp ấm chọn loại mơi trường khống có bổ sung vào môi trường 30 g/l đường; 8,5 g/l agar; 1,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa Với hàm lượng khoáng giảm 1/4 khoáng đa lượng, cụ thể là: 1/4 MS, 1/4 WPM, 1/4 SH b Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khoáng có hàm lượng đa lượng giảm 1/2 đến phát triển Nắp ấm Để nhận định xác mơi trường khống phù hợp cho nắp ấm, tiếp tục tiến hành thí nghiệm mơi trường khoáng hàm lượng đa lượng giảm 1/2 Tương tự thí nghiệm 1, tiến hành cấy cấy Nắp ấm vào loại mơi trường khống có bổ sung vào môi trường 30 g/l đường; 8,5 g/l agar; 1,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa Với hàm lượng khoáng giảm 1/2 khoáng đa lượng, cụ thể là: 1/2 MS, 1/2 WPM, 1/2 SH c Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khống đến Nắp Ấm Tương tự thí nghiệm trên, tiếp tục tiến hành thí nghiệm với loại mơi trường khống giữ ngun nồng độ Tiến hành cấy cấy nắp ấm vào loại môi trường khống có bổ sung vào mơi trường 30 g/l đường; 8,5 g/l agar; 1,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa Với mơi trường khống cụ thể là: 1/2 MS, 1/2 WPM, 1/2 SH d Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng BAP đến phát triển va tạo hoàn chỉnh Nắp ấm Sau thu kết môi trường khống tiếp tục tiến hành thí nghiệm với BAP Chọn nắp ấm in vitro có chiều cao từ 0,5 – 1,0 cm, số đạt từ –3 lá, giai đoạn tăng trưởng tốt Tiến hành cấy cấy Nắp ấm vào loại mơi trường khống tốt thí nghiệm có bổ sung vào mơi trường 30 g/l đường; 8,5 g/l agar; 1,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa BAP nồng độ 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/L Các tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu sinh học thông dụng: số (lá/cây), chiều cao (cm), kích thước bình (cm), đặc điểm 2.2.4 Thống kê xử lý số liệu Số liệu sau thu thập ứng với tiêu theo dõi xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010® Statgraphics centurion 19; phân tích phương sai (ANOVA), với P ≤ 0,05 Kết kết luận 3.1 Kết 483 a Ảnh mơi trường khống giảm 1/4 hàm lượng đa lượng đến tăng trưởng cấy Nắp ấm in vitro Cây nắp ấm sau chuyển sang mơi trường thí nghiệm cảm ứng môi trường sau tuần cấy mẫu Kết bảng cho thấy sau tuần nuôi cấy loại mơi trường khống khác cho kết tương đối khác biệt không đáng kể, phát triển khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu khác thường, chiều cao tương đối Tuy nhiên nghiệm thức A2 (mơi trường ¼ WPM) cho tăng trưởng mẫu cấy tốt so với môi trường cịn lại (hình 1), nghiệm thức có số lượng 2,95 lá, chiều cao đạt 2,52 cm, kích thước bình đạt 0,58 cm Bảng 1: Kết thí nghiệm ảnh hưởng loại môi trường nồng độ 1/4 đến tăng trưởng, nhân nhanh tạo hoàn chỉnh Số lượng Chiều cao Kích thước (lá/cây) (cm) bình (cm) A1 2,60b 2,23b 0,54a A2 2,95a 2,52a 0,58a A3 2,37c 2,44a 0,47b Nghiệm thức 484 Hình 1: Sự tăng trưởng Nắp ấm mơi trường ¼ WPM sau tuần nuôi cấy b Ảnh môi trường khoáng giảm 1/2 hàm lượng đa lượng đến tăng trưởng cấy Nắp ấm in vitro Do kết thí nghiệm khơng có ý nghĩa khơng giúp chọn loại mơi trường khống thích hợp cho chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm với loại mơi trường khống nồng độ 1/2 Ở thí nghiệm này, có dấu hiệu cảm ứng môi trường sau tuần nuôi cấy, sau khoảng tuần ta thấy rõ khác biệt loại môi trường, môi trường khống 1/2 SH chiều cao khơng q khác biệt so với lúc đâu mơi trường cịn lại Sau tuần ni cấy, mơi trường khống 1/2 WPM phát triển tốt hơn, mọc dài, kích thước bình lớn (hình 2) Kế tiếp mơi trường 1/2 SH, thời gian đầu môi trường gần phát triển không đáng kế đến tuần thứ phát triển mạnh, dài, bình lớn dần Bảng 2: Kết thí nghiệm ảnh hưởng loại môi trường nồng độ 1/2 đến tăng trưởng, nhân nhanh tạo hồn chỉnh Số lượng Chiều cao Kích thước (lá/cây) (cm) bình (cm) B1 3,59c 3,16c 0,53c B2 4,95a 4,06a 0,84a B3 4,24b 3,54c 0,75b Nghiệm thức 485 Hình 2: Sự tăng trưởng Nắp ấm mơi trường ½ WPM sau tuần ni cấy c Ảnh mơi trường khống giữ ngun hàm lượng đa lượng đến tăng trưởng cấy Nắp ấm in vitro Để lần khẳng định ảnh hưởng mơi trường khống đến phát triển Nắp ấm chúng tơi tiếp tục tiến hành thíc nghiệm với loại mơi trường khống nồng độ bình thường Cũng thí nghiệm trên, Nắp ấm cảm ứng môi trường từ sau tuần nuôi cấy, mội loại môi trường phát triển nhanh, chiều cao tăng vọt, kích thước bình lớn, sau khoảng tuần nuôi cấy bắt đầu suất khác biệt loại môi trường khống, tương tự thí nghiệm 2, nắp ấm môi trường WPM phát triển nhanh hơn, chiều cao vượt trội, dài, bính xuất hầu hết (hình 3) Bảng 3: Kết thí nghiệm ảnh hưởng loại môi trường đến tăng trưởng, nhân nhanh tạo hoàn chỉnh Số lượng Chiều cao Kích thước (lá/cây) (cam/cây) bình (cm) C1 4,56b 3,29c 0,64b C2 5,19a 4,55a 0,71a C3 4,35b 3,85b 0,69b Nghiệm thức 486 Hình 3: Sự tăng trưởng Nắp ấm môi trường WPM sau tuần nuôi cấy d Ảnh hưởng BAP đến phát triển tạo hoàn chỉnh Nắp ấm Sau có kết thí nghiệm mơi trường khống, chúng tơi chọn mơi trường khống WPM mơi trường thích hợp cho phát triển Nắp ấm tiếp tục tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng BAP Ở thí nghiệm ta thấy bổ sung BAP vào môi trường ảnh hưởng đến hình thành chồi Khi bổ sung vào môi trường mg/L BAP số đạt cao 5,3 lá, kích thước binhg đạt cao 0,88cm, chiều cao tốt 0,5 mg/L BAP (hình 4) Bảng 4: Kết tính nghiệm ảnh hưởng BAP đến tăng trưởng, nhân nhanh tạo hoàn chỉnh Nắp ấm Số lượng Chiều cao Kích thước (lá/cây) (cm/cây) bình (cm) D1 4,86c 4,14b 0,57d D2 5,06b 4,58a 0,74b D3 4,55d 3,95c 0,66c D4 5,33a 4,35ab 0,88a D5 4,56d 4,01b 0,53d Nghiệm thức 487 Hình 4: Sự tăng trưởng Nắp ấm môi trường WPM bổ sung 2,0 mg/L BAP sau tuần nuôi cấy 3.2 Kết luận Môi trường WPM có hiệu cao mơi trường MS môi trường SH sinh trưởng Nắp ấm Sự bổ sung BAP cho hiệu không rõ rệt lên phát triển Nắp ấm, tỷ lệ phát triển không khác biệt so với đối chứng, thí nghiệm BAP nồng độ nồng độ 2mg/l cho kết tốt so với nghiệm thức lại thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Andrew H Thornhill, Ian S Harper, and Neil D Hallam (2008) The Development of the Digestive Glands and Enzymes in the Pitchers of Three Nepenthes Species: N alata, N tobaica, and N ventricosa (Nepenthaceae) International Journal of Plant Sciences 169 (5): 615-624 [2] Bahadur V., Kirad K.S., Mathew A., Singh D.B (2008) Tissue culture studies in Nepenthes khasiana Acta Horticulturae, 786: 287-293 [3] Mabberley D.J (2000) The Plant-Book, 2nd ed Cambridge University Press, Cambridge, UK, p858 [4] Đỗ Tất Lợi (2003) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học cổ truyền [5] George E F (2008) Plant Propagation by Tissue Culture 3rd edition, Chapter - Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues and antagonists, 205-226 [6] Lee C C (2008) Carnivorous plants: New Ornamentals Chronica Hort., 48: 11-14 [7] Lloyd G & B H McCown (1981) Woody plant medium (WPM) - A mineral nutrient formation for microculture of woody plant species Hort p453 [8] Martin C., Matthew J (2013) Recircumscription of the Nepenthes alata group (Caryophyllales: Nepenthaceae), in the Philippines, with four new species European Journal of Taxonomy, 69: 1-23 [9] Sherwin C (1981) Bulletin of the Torrey Botanical Club, 324-330 [10] Suraninpong P., Nuanlaong, S., Wuthisuthimethavee S (2015) A new classification of thailand's nepenthes species by genetic analysis of aflp markers 488 ... 3.1 Kết 483 a Ảnh môi trường khoáng giảm 1/4 hàm lượng đa lượng đến tăng trưởng cấy Nắp ấm in vitro Cây nắp ấm sau chuyển sang mơi trường thí nghiệm cảm ứng môi trường sau tuần cấy mẫu Kết bảng... trưởng Nắp ấm mơi trường ½ WPM sau tuần ni cấy c Ảnh mơi trường khống giữ ngun hàm lượng đa lượng đến tăng trưởng cấy Nắp ấm in vitro Để lần khẳng định ảnh hưởng mơi trường khống đến phát triển Nắp. .. nghiên cứu “ ảnh hưởng mơi trường khống, chất điều hòa sinh trưởng BAP đến cây Nắp ấm (Nepenthens) in vitro? ?? thực nhằm x? ?c định loại mơi trường khống với hàm lương đa lượng thích hợp ảnh hưởng chất