cấu tạo và vai trò enzyme catalase

Báo cáo tiểu luận về cấu tạo, vai trò, các nhân tố ảnh hưởng đến enzyme catalase, ứng dụng của enzyme catalase, tổng hợp một số ứng dụng của enzyme từ các bài báo nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước

BÁO CÁO MÔN: PROTEIN – ENZYME HỌC CẤU TẠO VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME CATALASE i MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG ivi DANH SÁCH HÌNH v Chương I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nghiên cứu nước 2.2 Nghiên cứu nước Chương III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Cấu tạo enzyme catalase 3.1.1 Cấu trúc tổng thể catalase 3.1.2 Heme 3.1.3 Các kênh đến nhóm heme 3.1.4 Cơ chế tác động enzyme catalase 3.1.5 Điều hòa biểu gen catalase 3.1.6 Cofactor catalase 3.2 Thí nghiệm tổng hợp catalase ống nghiệm 3.3 Vai trò enzyme catalase 3.3.1 Enzyme catalase tham gia vào chế bảo vệ chống ôxy hóa gây stress mặn lúa 3.3.2 Enzyme catalase tham gia vào chế chịu hạn Amaranthus tricolor 10 3.3.3 Vai trò catalase số bệnh căng thẳng oxy hóa tuổi tác người 11 3.4 Nghiên cứu ứng dụng catalase điều chỉnh sinh lý bệnh stress ơxy hóa gây bệnh tiểu đường biến chứng tới võng mạc 13 3.4.1 Nguyên liệu nghiên cứu 13 3.4.2 Phương pháp 14 3.5 Nghiên cứu tinh xác định số tính chất catalase (Đối tượng sử dụng Bacillus subtilis PY79) 14 3.5.1 Vật liệu phương pháp 14 3.5.2 Tinh enzyme catalase từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis 15 3.5.3 Xác định hoạt độ catalase 15 ii 3.5.4 Xác định hàm lượng protein 16 3.5.5 pH tối thích ảnh hưởng pH đến hoạt độ catalase 16 3.5.6 Nhiệt độ tối thích ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ catalase… ………16 3.5.7 Ảnh hưởng số chất đến hoạt động enzyme 16 3.5.8 Động học catalase tinh 16 Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Enzyme catalase tham gia vào chế bảo vệ chống ơxy hóa gây stress mặn lúa 17 4.2 Enzyme catalase tham gia vào chế chịu hạn Amaranthus tricolor 18 4.3 Thí nghiệm tổng hợp catalase in vitro 19 4.4 Nghiên cứu ứng dụng catalase điều chỉnh sinh lý bệnh stress oy hóa gây bệnh tiểu đường biến chứng tới võng mạc 23 4.5 Khảo sát hoạt tính sinh hoạt enzyme catalase 24 4.5.1 Các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy B subtilis PY79 sinh catalase 24 4.5.2 Tinh catalase 25 4.5.3 Một số tính chất catalase tinh 27 Chương V KẾT LUẬN 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng Bảng 3.2: Các đặc tính sinh hóa holo- apocatalase catalase phân lập lắp ráp ống nghiệm hai nhiệt độ khác 21 Bảng 3.3: Bảng tóm tắt tinh catalase từ B subtilis PY79 25 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Cấu trúc tổng thể catalase S thermophilum (Hem có màu xanh lục) Hình 3.2: Các kênh catalase S thermophilum Hình 3.3: Cấu trúc hem b (a) hem d (b) Hình 3.4: Ảnh hưởng độ mặn đến hàm lượng Catalase Các cột có chữ khác có khác biệt đáng kể mức 0,05 17 Hình 3.5: Đáp ứng superoxide dismutase 18 Hình 3.6: Đáp ứng catalase 18 Hình 3.7: Tỷ lệ lắp ráp catalase ống nghiệm khả hoạt động catalase 19 Hình 3.8: Ái lực heme apocatalase 20 Hình 3.9: Độ tinh khiết chế phẩm apo- holocatalase phân lập từ dịch chiết tế bào chất chủng E faecalis ELF7 / pLUF15 ni mơi trường có bổ sung heme (holo-KatA) khơng có heme (apo-KatA) 22 Hình 3.10: CAT-SKL làm giảm nồng độ lipid hydroperoxide tăng hoạt động catalase mô 24 Hình 3.11: Các điều kiện thích hợp cho nuôi cấy B subtilis PY79 sinh catalase A) môi trường nuôi cấy, B) nồng độ H2O2 cảm ứng, C) thời điển cảm ứng H2O2, D) Thời gian thu sinh khối tế bào 25 Hình 3.12: Sắc kí đồ phân đoạn tinh catalase từ dịch chiết B subtilis qua cột trao đổi anion Q-sepharose (A) CM-sepharose (B) 26 Hình 3.13: Điện di SDS-PAGE phân đoạn tinh catalase từ dịch chiết B subtilis 26 Hình 3.14: Ảnh hưởng pH (A), độ ổn định pH (B) đến hoạt độ catalase tinh từ B subtilis 27 Hình 3.15: Ảnh hưởng nhiệt độ (A) độ bền nhiệt độ catalase (B) tinh từ B Subtilis 28 Hình 3.16: Ảnh hưởng chất đến hoạt độ catalase tinh từ B subtilis 28 Hình 3.17: Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng thuỷ phân H2O2 catalase nồng độ H2O2 khác theo phương trình Lineweaver-Burk 29 v Chương I GIỚI THIỆU 1 Đặt vấn đề Catalase (EC 1.11.1.6) có chức phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) oxygen (O2), enzyme chống oxi hóa có vai trị quan trọng loại bỏ gốc ơxy hóa tế bào Trong chuỗi vận chuyển điện tử, ôxy phân tử (O2) hoạt động chất nhận điện tử cuối cùng, làm phát sinh tích tụ sản phẩm có tính ơxy hóa mạnh (ROS) Gốc hydroxyl (OH-) hydrogen peroxide (H2O2) chất ơxy hóa mạnh có khả gây hại cao tế bào Các nghiên cứu cho thấy, catalase có nhiều ứng dụng sinh y học: enzyme có vao trị ức chế phá vỡ tế bào thần kinh, apotosis, chống viêm, lão hóa khối u Nồng độ catalase với số enzyme chống oxi hóa khác cịn xem số để đánh giá nhóm ơxy hoạt động ROS (reactive oxygen species) tạo trình phát sinh số bệnh người (Nadem et al., 2015) Bên cạnh đó, thách thức lớn nông nghiệp giới phải sản xuất thêm 70% lương thực cho thêm 2,3 tỉ người vào năm 2050 toàn giới (FAO, 2009) Trong số yếu tố gây cản trở đến suất lúa độ mặn yếu tố nguy hiểm Hơn 20% diện tích đất canh tác tồn giới bị ảnh hưởng tình trạng mặn số lượng tăng lên hàng ngày khắp nơi quốc gia ven biển Đất nhiễm mặn yếu tố làm suy giảm suất trồng, hầu hết loại trồng bị ảnh hưởng nồng độ cao muối môi trường đất sản xuất nông nghiệp Nhìn chung, phần lớn giống lúa có khả chịu mặn mức thấp Các bị stress muối cao thường có triệu chứng ngộ độc Na+ tích tụ Na+ giảm khả thu nhận chất dinh dưỡng, dẫn đến cân dinh dưỡng Chính vậy, gia tăng hoạt động enzyme giải độc loại phản ứng ơxy hóa góp phần vào khả chịu mặn thực vật Theo Mishra et al., (2013) công bố báo cáo nghiên cứu cho thấy lúa chịu mặn có khả thích nghi tốt cách tăng hoạt động enzyme chống oxy hóa tác động muối Chính việc nghiên cứu để tìm hiểu rõ cấu tạo, đặc điểm hoạt tính enzyme catalase có vai trò quan trọng nghiên cứu khoa học ứng dụng, từ giúp cho người sử dụng, cải biến enzyme phù hợp với mục đích khác thực tiễn đời sống lí để báo cáo “Cấu tạo vai trò enzyme catalase” thực 1.2 Mục tiêu Bài báo cáo tập trung phân tích cấu tạo, vai trị hoạt tính sinh học enzyme catalase nghiên cứu ứng dụng thực tế Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nghiên cứu nước Phạm Thu Hương, Lê Thị Thủy, Đinh Nho Thái, Nguyễn Thị Hồng Loan, 2017 tiến hành nghiên cứu tinh xác định số tính chất catalase từ Bacillus subtilis PY79 Nguyễn Hoàng An, Godagama G D Suminda, Nguyễn Thị Thu Phương, Đinh Nho Thái, Nguyễn Thị Hồng Loan, 2018 tiến hành tinh catalase phương pháp cải tiến từ gan bị nghiên cứu số tính chất enzyme 2.2 Nghiên cứu nước Ankita Nandi, Liang-Jun Yan, Chandan Kumar Jana and Nilanjana Das, 2019 tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng catalase đến bệnh stress ơxy hóa ảnh hưởng tuổi già người Ighodaro, O M and Akinloye, O A., 2018 tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng superoxide dismutase, catalase glutathione peroxidase chế bảo vệ chống lại ơxy hóa Yonca Yuzugullu Karakus, 2020 nghiên cứu tổng hợp cấu trúc chức enzyme catalase Mohammad Golam Kibria, Mahmud Hossain, Yoshiyuki Murata, Md Anamul Hoque, 2017 nghiên cứu ảnh hưởng enzyme chống ơxy hóa giúp chịu mặn Umakanta Sarker and Shinya Oba, 2018 nghiên cứu vai trò enzyme catalase chế chịu hạn loài Amaranthus tricolor Courtney R Giordano, Robin Roberts, Kendra A Krentz, David Bissig, Deepa Talreja, Ashok Kumar, Stanley R Terlecky, and Bruce A Berkowitz, 2015 nghiên cứu ứng dụng catalase điều trị bệnh stress ơxy hóa người bệnh tiểu đường biến chứng tới võng mạc giai đoạn đầu Michael Baureder, Elisabeth Barane, Lars Hederstedt 2014 nghiên cứu thí nghiệm tổng hợp catalase ống nghiệm Chương III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Cấu tạo enzyme catalase 3.1.1 Cấu trúc tổng thể catalase Cấu trúc enzyme Catalase gồm bốn tiểu đơn vị, phần tử chia thành bốn miền Cốt lõi mở rộng tiểu đơn vị tạo β-barrel tám trục song song (b1-8) với kết nối lân cận gần giới hạn vòng β-barrel bên vòng a9 mặt khác Một miền helical mặt β-barrel bao gồm bốn helice C-terminal (a16, a17, a18, and a19) bốn helice bắt nguồn từ dư lượng b4 b5 (a4, a5, a6 a7) Cắt thay dẫn đến biến thể protein khác Các catalase phân thành ba nhóm: catalase-peroxidase chứa heme (HPI), catalase chứa heme đơn chức (HPII) catalase chứa mangan (Yonca Yuzugullu Karakus, 2020) Hình 3.1: Cấu trúc tổng thể catalase S thermophilum (Hem có màu xanh lục) 3.1.2 Heme Trong tất catalaza, nhóm heme nằm sâu cấu trúc lõi, khoảng cách từ phần gần bề mặt phân tử khoảng 20A0 Trong cấu trúc tyrosine phía gần heme (Tyr415 HPII) histidine asparagine phía xa (His128 Asn201 HPII), cho cần thiết cho xúc tác Ôxy nhóm hydroxyl phenolic dư lượng tyrosine phối tử gần heme sắt deproto hóa mang điện tích âm, dẫn đến ổn định trạng thái ôxy hóa cao sắt Vịng imidazole histidine xa đặt gần song song với heme khoảng cách trung bình khoảng 3,5A0 vịng pyrrole III PMC vòng pyrrole IV PVC HPII Dư lượng histidine asparagine phía xa heme làm cho môi trường kỵ nước mạnh Một dư lượng serine bảo tồn (Ser167 HPII) tìm thấy liên kết hydro với Nδ histidine thiết yếu tạo điều kiện thuận lợi cho chế enzym 3.1.3 Các kênh đến nhóm heme Khả tiếp cận hạn chế catalase nhóm heme địi hỏi diện kênh Heme enzyme kết nối với bề mặt bên ba kênh, kênh chính, kênh bên kênh trung tâm Trong số đó, kênh đặt vng góc với bề mặt heme Kênh bên tiếp cận ngang với heme kênh trung tâm hướng từ phía xa Hình 3.2: Các kênh catalase S thermophilum Kênh coi đường để di chuyển chất đến vị trí hoạt động Nó có hình phễu với chiều dài 30A0 catalaza nhỏ catalaza lớn, kênh thay kênh kéo dài, bị thắt lại phân đôi bao gồm miền tận C đơn vị liền kề Kênh bên kênh phụ tiếp cận heme asparagin thiết yếu xuất bề mặt phân tử vị trí tương ứng với túi liên kết NADP (H) catalaza liên kết đồng yếu tố Chức kênh chưa biế Phân tích động lực học phân tử nước khỏi protein qua kênh Kênh trung tâm đường ưa thích để xâm nhập chất, dài hẹp để giải phóng sản phẩm phản ứng (nước oxy phân tử) Vì kênh trung tâm chủ yếu ưa nước dẫn đến khoang trung tâm tiếp giáp với khối nước, lối cho O2 Tuy nhiên, thay gốc axit amin mở rộng kênh catalaza lớn cho phép oxy qua kênh Trên thực tế, oxy ưu tiên qua kênh thay kênh trung tâm tất catalaza có heme loại b vị trí hoạt động Do đó, diện kênh nhỏ chế thay để giải phóng nhanh sản phẩm điều kiện H2O2 cao nhấn mạnh (Yonca Yuzugullu Karakus, 2020) 3.1.4 Cơ chế tác động enzyme catalase Catalase nhóm enzyme nghiên cứu nhiều Thuật ngữ catalase lần Loew xác định enzyme phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) vào năm 1901 sau trở thành trọng tâm nghiên cứu nhà hóa sinh sinh học phân tử Phản ứng tổng thể catalase mơ tả đơn giản phân hủy hai phân tử hydrogen peroxide thành nước ôxy (phản ứng 1) Phản ứng xúc tác xảy hai giai đoạn riêng biệt, xảy giai đoạn bao gồm chủ yếu dựa loại catalase Giai đoạn bao gồm q trình ơxy hóa heme cách sử dụng phân tử hydro peroxide thứ để tạo thành loại oxyferryl, đương lượng oxy tách khỏi sắt từ vòng porphyrin để tạo gốc cation porphyrin (phản ứng 2) Trong giai đoạn thứ hai, chất trung gian gốc này, gọi hợp chất I, bị khử hydrogen peroxide thứ hai để tái tạo lại enzyme trạng thái nghỉ, nước oxy (phản ứng 3) Catalase hoạt động peroxidase, hợp chất hữu thích hợp sử dụng chất cho điện tử Trong phản ứng peroxidase, hợp chất I chuyển thành hợp chất II (phản ứng 4), hợp chất bị oxy hóa hydro peroxit khác để tạo hợp chất III không hoạt động (phản ứng 5) Đối với catalase liên kết NADPH, đề xuất ức chế enzym thông qua xuất hợp chất III ngăn chặn cách ngăn chặn NADPH giải phóng hợp chất hệ II 2H2O2 → 2H2O + O2 (1) Enz (Por-FeIII) + H2O2 → Cpd I (Por+•-FeIV=O) + H2O (2) Cpd I (Por+•-FeIV=O) + H2O2 → Enz (Por-FeIII) + H2O2 + O2 (3) Cpd I (Por+•-FeIV=O) + AH2 → Cpd II (Por-FeIV-OH) + AH• (4) Cpd II (Por-FeIV-OH) + H2O2 → Cpd III (Por-FeIII-O2-•) + H2O (5) Trong số đó, catalaza đơn chức tạo thành nhóm catalaza lớn nghiên cứu rộng rãi Tất chúng có chế hai bước để khử hydrogen peroxide Các Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Enzyme catalase tham gia vào chế bảo vệ chống ơxy hóa gây stress mặn lúa Để khảo sát xem độ mặn đất có ảnh hưởng đến hệ thống bảo vệ chống oxy hóa lúa hay không, người ta đo hoạt động enzyme CAT (catalase), POX (Guaiacol peroxidas) APX (Ascorbate peroxidase) Hoạt động enzym chống oxy hóa bị ảnh hưởng đáng kể phản ứng với stress mặn Hoạt động catalase ascorbate peroxidase kiểu gen chịu mặn tăng lên nồng độ mặn tăng lên (Hình 3.4) Hình 3.4: Ảnh hưởng độ mặn đến hàm lượng Catalase Các cột có chữ khác có khác biệt đáng kể mức 0,05 Tăng phản ứng chống oxy hóa thực vật chứng minh có liên quan tích cực đến việc giảm thiệt hại oxy hóa cải thiện khả chịu mặn (Hasegawa et al., 2000; Mittova et al., 2003; Demiral Turkan, 2005; Hoque et al., 2007a, b, 2008; Banu et al., 2009; El-Shabrawi et al., 2010) Để đánh giá mối quan hệ khả chịu mặn phản ứng chống oxy hóa, hoạt động enzym chống oxy hóa đo Hoạt động enzym chống oxy hóa khác đáng kể để phản ứng với stress mặn Trong nghiên cứu này, hoạt động catalase ascorbate peroxidase tăng lên nồng độ muối tăng kiểu gen lúa chịu mặn hoạt động kiểu gen nhạy cảm với muối (BRRI dhan 28) giảm độ mặn tăng lên so với đối chứng (Hình 1) Các báo cáo trước ủng hộ việc tăng độ mặn làm giảm hoạt động enzym chống oxy hóa bao gồm catalase lúa nhạy cảm với muối, làm tăng hoạt động catalase lúa chịu mặn (Demiral and Turkan, 2005; El-Shabrawi et al., 2010; Hasanuzzaman et al., 2014) 17 4.2 Enzyme catalase tham gia vào chế chịu hạn Amaranthus tricolor Stress khô hạn tạo superoxide từ rò rỉ điện tử quang hợp hô hấp tế bào Enzyme superoxide dismutase phân hủy superoxide Ngược lại, catalase chủ yếu phân hủy photorespiration qua trung gian H2O2 peroxisome Các hoạt động catalase superoxide dismutase tăng dần theo gia tăng căng thẳng hạn hán điều kiện MDS SDS so với xử lý đối chứng hai giống, nhiên, mức tăng hoạt động superoxide dismutase catalase VA13 cao so với VA15 tất mức độ căng thẳng hạn hán (Hình 3.5 3.6) Hoạt động catalase superoxide dismutase VA13 tăng 28% 53% điều kiện MDS 70% 105% điều kiện SDS, hoạt động catalase superoxide dismutase VA15 tăng 48% 64% điều kiện MDS 76% 94% điều kiện điều kiện SDS, tương ứng so với điều trị đối chứng (Umakanta Sarker and Shinya Oba, 2018) Hình 3.5: Đáp ứng superoxide dismutase Hình 3.6: Đáp ứng catalase 18 4.3 Thí nghiệm tổng hợp catalase in vitro Tốc độ mà hoạt tính catalase xuất bổ sung lượng dư thừa hemin vào apocatalase xác định cách sử dụng xét nghiệm dựa máy quang phổ Tỷ lệ hoạt tính catalase cuối thu được phát phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ ( Hình 3.7A ) Ở 37°C, hoạt động tăng lên nhanh chóng để đạt đến mức ổn định hoạt động thấp vòng vài phút ( Hình 3.7B) Ở 20°C, lạnh hơn, hoạt tính tăng chậm nhiều để đạt mức tối đa, cao 10 lần so với mức thu 37°C tương tự holocatalase cô lập Ủ apocatalase với lượng heme dư thừa 37°C sau 15°C dẫn đến tăng hoạt tính cuối đạt đến mức tương tự holocatalase Điều chứng tỏ phần lớn phân tử apocatalase có heme ổn định 37°C trở thành enzyme hoạt động hoàn toàn nhiệt độ hạ thấp (Michael Baureder et al., 2014) Hình 3.7: Tỷ lệ lắp ráp catalase ống nghiệm khả hoạt động catalase Ái lực apocatalase heme phân tích cách trộn 40 pmol apocatalase phân lập với 80 pmol hemin Nồng độ Hemin sử dụng nằm khoảng từ 26 nM đến µM Hoạt tính catalase xác định sau ủ 37°C 45 phút Thí nghiệm cho thấy giá trị KD biểu kiến 150 nM (Hình 3.8) 19 Hình 3.8: Ái lực heme apocatalase Sự hình thành catalase hoạt động địi hỏi phải chèn nhóm heme cho tiểu đơn vị lắp ráp homo-tetramer có cấu trúc phức tạp Như xác định từ cấu trúc tinh thể holoenzyme, bao gồm cấu trúc tinh thể E faecalis catalase, monome catalase heme tiểu đơn vị nhỏ bao gồm bốn vùng: nhánh tận N (gốc 4-50 E faecalis), vùng β (gốc 51-300), vùng bọc (gốc 301-415 ), vùng xoắn α đầu C (phần dư 416–477) Túi heme bao gồm His-54, vị trí hoạt động dư lượng histidine thiết yếu heme xa, vùng β, bốn sợi tạo thành hầu hết phía xa heme, vùng bao bọc với phối tử trục tyrosyl gần heme (Tyr-337) Trong catalase lắp ráp, nhánh đầu cuối N monome đan xen với vùng bọc monome khác (Michael Baureder et al., 2014) Trong cơng trình này, nhà khoa học nghiên cứu biểu catalase tế bào E faecalis phân lập apoprotein catalase sử dụng cho nghiên cứu lắp ráp ống nghiệm Tế bào E faecalis tổng hợp vi khuẩn uốn ván phát triển tốt điều kiện khơng có heme hấp thụ heme từ mơi trường để lắp ráp protein heme Thí nghiệm gen katA phiên mã dịch mã độc lập với heme môi trường sinh trưởng Apocatalase phát bị phân hủy tế bào hoạt động phân giải protein chưa xác định gây giai đoạn tăng trưởng hàm mũ muộn Catalase lắp ráp ống nghiệm cách trộn apocatalase tinh khiết với hemin Ở 15°C, trình phát nhiều để hoàn thành mang lại 90% enzyme hoạt động (so với holoenzyme lắp ráp thể ) ( Bảng3.2) 20 Bảng 3.2: Các đặc tính sinh hóa holocatalase apocatalase catalase phân lập lắp ráp ống nghiệm hai nhiệt độ khác In vitro assembled catalase Holocatalase Apocatalase Protoheme IX/KatA (mol/mol) Catalase activity (U/pmol KatA) 4.2 ± 1.0 (100%) Ở 15°C Ở 37°C