Báo cáo tiểu luận về cấu tạo, vai trò, các nhân tố ảnh hưởng đến enzyme catalase, ứng dụng của enzyme catalase, tổng hợp một số ứng dụng của enzyme từ các bài báo nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Catalase (EC 1.11.1.6) là enzyme quan trọng trong việc phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxygen (O2), giúp loại bỏ các gốc oxy hóa trong tế bào Trong chuỗi vận chuyển điện tử, ôxy phân tử (O2) là chất nhận điện tử cuối cùng, dẫn đến sự tích tụ các sản phẩm có tính oxy hóa mạnh (ROS) như hydroxyl (OH-) và hydrogen peroxide (H2O2), có khả năng gây hại cho tế bào Nghiên cứu cho thấy catalase có nhiều ứng dụng trong sinh y học, bao gồm ức chế sự phá vỡ tế bào thần kinh, apoptosis, chống viêm, lão hóa và khối u Nồng độ của catalase cùng với các enzyme chống oxy hóa khác được xem là chỉ số đánh giá mức độ ROS liên quan đến sự phát sinh một số bệnh ở người (Nadem et al., 2015).
Một trong những thách thức lớn đối với nền nông nghiệp toàn cầu là cần sản xuất thêm 70% cây lương thực để đáp ứng nhu cầu của 2,3 tỷ người vào năm 2050 (FAO, 2009) Độ mặn là một trong những yếu tố nguy hiểm nhất ảnh hưởng đến năng suất cây lúa, với hơn 20% diện tích đất canh tác toàn cầu bị nhiễm mặn, đặc biệt là ở các quốc gia ven biển Đất nhiễm mặn làm suy giảm năng suất cây trồng, vì hầu hết các loại cây đều bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối cao Phần lớn giống lúa hiện nay chỉ chịu mặn ở mức thấp, và cây bị stress do muối thường gặp triệu chứng ngộ độc Na+, dẫn đến mất cân bằng dinh dưỡng Do đó, sự gia tăng hoạt động của các enzyme giải độc phản ứng oxy hóa là yếu tố quan trọng giúp cây tăng khả năng chịu mặn Nghiên cứu của Mishra et al (2013) cho thấy cây lúa chịu mặn có khả năng thích nghi tốt hơn nhờ vào việc tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa khi gặp tác động của muối.
Nghiên cứu enzyme catalase rất quan trọng để hiểu rõ cấu tạo, đặc điểm và hoạt tính của nó Việc này giúp con người ứng dụng và cải biến enzyme cho các mục đích khác nhau trong đời sống Do đó, bài báo cáo "Cấu tạo và vai trò của enzyme catalase" được thực hiện nhằm cung cấp thông tin thiết yếu về enzyme này.
Mục tiêu
Bài báo cáo này tập trung vào việc phân tích cấu tạo và vai trò của enzyme catalase, cùng với các hoạt tính sinh học của nó Ngoài ra, nghiên cứu cũng đề cập đến những ứng dụng thực tế của enzyme này trong các lĩnh vực khác nhau.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Nghiên cứu trong nước
Phạm Thu Hương, Lê Thị Thủy, Đinh Nho Thái và Nguyễn Thị Hồng Loan (2017) đã thực hiện nghiên cứu về việc tinh sạch và xác định một số tính chất của enzyme catalase từ vi khuẩn Bacillus subtilis PY79.
Nguyễn Hoàng An, Godagama G D Suminda, Nguyễn Thị Thu Phương, Đinh Nho Thái và Nguyễn Thị Hồng Loan (2018) đã thực hiện quá trình tinh sạch enzyme catalase từ gan bò bằng phương pháp cải tiến, đồng thời nghiên cứu một số tính chất của enzyme này.
Nghiên cứu ngoài nước
Nghiên cứu của Ankita Nandi, Liang-Jun Yan, Chandan Kumar Jana và Nilanjana Das vào năm 2019 đã chỉ ra tác động của catalase đối với các bệnh liên quan đến stress ôxy hóa và ảnh hưởng của quá trình lão hóa ở con người.
Ighodaro, O M and Akinloye, O A., 2018 đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase trong cơ chế bảo vệ đầu tiên chống lại ôxy hóa
Yonca Yuzugullu Karakus, 2020 đã nghiên cứu tổng hợp về cấu trúc và chức năng của enzyme catalase
Mohammad Golam Kibria, Mahmud Hossain, Yoshiyuki Murata, Md Anamul Hoque, 2017 đã nghiên cứu về ảnh hưởng của các enzyme chống ôxy hóa giúp cây chịu mặn
Umakanta Sarker and Shinya Oba, 2018 đã nghiên cứu về vai trò của enzyme catalase trong cơ chế chịu hạn ở loài Amaranthus tricolor
In 2015, researchers Courtney R Giordano, Robin Roberts, Kendra A Krentz, David Bissig, Deepa Talreja, Ashok Kumar, Stanley R Terlecky, and Bruce A Berkowitz investigated the application of catalase in treating oxidative stress-related diseases in patients with early-stage diabetic retinopathy.
Michael Baureder, Elisabeth Barane, Lars Hederstedt 2014 đã nghiên cứu về thí nghiệm tổng hợp catalase trong ống nghiệm
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
Cấu tạo enzyme catalase
3.1.1 Cấu trúc tổng thể của catalase
Cấu trúc enzyme Catalase bao gồm bốn tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị có bốn miền Cốt lõi mở rộng của mỗi tiểu đơn vị được hình thành bởi một β-barrel tám trục song song (b1-8), với các vòng β-barrel và vòng a9 giới hạn các kết nối lân cận Một miền helical ở một bên của β-barrel bao gồm bốn helice C-terminal (a16, a17, a18, a19) và bốn helice từ dư lượng giữa b4 và b5 (a4, a5, a6, a7) Cắt thay thế có thể tạo ra các biến thể protein khác nhau Các loại catalase được phân thành ba nhóm: catalase-peroxidase chứa heme (HPI), catalase chứa heme đơn chức (HPII) và catalase chứa mangan.
Hình 3.1: Cấu trúc tổng thể catalase ở S thermophilum (Hem có màu xanh lục)
Trong các catalaza, nhóm heme nằm sâu trong cấu trúc lõi, cách bề mặt phân tử khoảng 20Å Cấu trúc tyrosine gần heme (Tyr415 trong HPII) cùng với histidine và asparagine ở xa (His128 và Asn201 trong HPII) được cho là cần thiết cho quá trình xúc tác Ôxy của nhóm hydroxyl phenolic trong tyrosine là phối tử gần của heme sắt, có khả năng deproto hóa và mang điện tích âm, giúp ổn định trạng thái ôxy hóa cao của sắt Vòng imidazole của histidine xa được đặt gần như song song với heme.
Trung bình khoảng 3,5A 0 trên vòng pyrrole III trong PMC hoặc vòng pyrrole IV trong PVC và HPII, cho thấy sự tương tác quan trọng trong cấu trúc Dư lượng histidine và asparagine ở phía xa của heme tạo ra một môi trường kỵ nước mạnh, điều này có thể ảnh hưởng đến hoạt động enzym Ngoài ra, dư lượng serine được bảo tồn (Ser167 trong HPII) liên kết hydro với N δ của histidine thiết yếu, có thể đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy cơ chế enzym.
3.1.3 Các kênh đến nhóm heme
Khả năng tiếp cận của catalase nhóm heme phụ thuộc vào sự có mặt của các kênh Heme của enzyme được kết nối với bề mặt bên ngoài thông qua ba kênh: kênh chính, kênh bên và kênh trung tâm Kênh chính được đặt vuông góc với bề mặt heme, trong khi kênh bên tiếp cận ngang và kênh trung tâm hướng từ phía xa.
Hình 3.2: Các kênh trong catalase của S thermophilum
Kênh chính là con đường chủ yếu để vận chuyển chất nền đến vị trí hoạt động, có hình phễu với chiều dài 30A 0 ở các catalaza nhỏ Trong khi đó, ở các catalaza lớn, kênh này được thay thế bằng một kênh kéo dài, bị thắt lại và có khả năng phân đôi, bao gồm miền tận cùng C của đơn vị con liền kề.
Kênh bên hoặc kênh phụ tiếp cận heme trên và dưới asparagin thiết yếu, xuất hiện trên bề mặt phân tử tại vị trí tương ứng với túi liên kết NADP (H) trong các catalaza liên kết một đồng yếu tố Chức năng của kênh này vẫn chưa được xác định, tuy nhiên, phân tích động lực học phân tử cho thấy nước có khả năng thoát ra khỏi protein qua kênh này.
Kênh trung tâm là một con đường phổ biến cho việc xâm nhập cơ chất, tuy nhiên, kích thước của nó có thể quá dài và hẹp, gây khó khăn trong việc giải phóng các sản phẩm phản ứng như nước và oxy phân tử.
Năm trung tâm chủ yếu có tính ưa nước, tạo điều kiện cho khoang trung tâm tiếp giáp với khối nước, từ đó cung cấp lối thoát cho O2 Sự thay thế các gốc axit amin mở rộng kênh chính trong các catalaza lớn cho phép oxy thoát ra qua kênh chính Thực tế cho thấy, oxy ưu tiên thoát qua kênh chính thay vì kênh trung tâm trong tất cả các catalaza heme loại b tại vị trí hoạt động Do đó, sự hiện diện của các kênh nhỏ có thể đóng vai trò là cơ chế thay thế để giải phóng nhanh các sản phẩm trong điều kiện H2O2 cao (Yonca Yuzugullu Karakus, 2020).
3.1.4 Cơ chế tác động của enzyme catalase
Catalase là một enzyme quan trọng, lần đầu tiên được xác định bởi Loew vào năm 1901, chuyên phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) Phản ứng của catalase diễn ra qua hai giai đoạn: giai đoạn đầu tiên là quá trình oxy hóa heme bằng hydrogen peroxide để tạo ra oxyferryl, trong khi giai đoạn thứ hai là sự khử hợp chất I bằng hydrogen peroxide thứ hai, tái tạo enzyme và sản sinh nước cùng oxy Ngoài vai trò chính, catalase còn hoạt động như peroxidase, chuyển hợp chất I thành hợp chất II, có thể bị oxy hóa để tạo hợp chất III không hoạt động Đối với các catalase liên kết NADPH, sự ức chế enzym qua hợp chất III có thể được ngăn chặn bằng cách điều chỉnh NADPH hoặc giải phóng hợp chất thế hệ II.
2H2O2 → 2H2O + O2 (1) Enz (Por-Fe III ) + H2O2 → Cpd I (Por +• -Fe IV =O) + H2O (2) Cpd I (Por +• -Fe IV =O) + H2O2 → Enz (Por-Fe III ) + H2O2 + O2 (3)
Cpd I (Por +• -Fe IV =O) + AH2 → Cpd II (Por-Fe IV -OH) + AH • (4)
Cpd II (Por-Fe IV -OH) + H2O2 → Cpd III (Por-Fe III -O2 -•) + H2O (5)
Catalaza đơn chức là nhóm catalaza lớn nhất và được nghiên cứu nhiều nhất, với tất cả các loại đều có cơ chế hai bước để khử hydrogen peroxide.
Lớp catalaza lớn nhất gồm 6 thành viên có thể được phân loại dựa trên kích thước tiểu đơn vị, với tiểu đơn vị lớn (75-84 kDa) chứa heme d và tiểu đơn vị nhỏ (55-69 kDa) chứa heme b Các enzym tiểu đơn vị nhỏ đều có NADP(H) bị ràng buộc, trong khi các enzym lớn hơn thể hiện độ ổn định cao trước nhiệt độ và phân giải protein Catalase-peroxidase, lớp ít phổ biến hơn, có hoạt tính peroxidatic đáng kể và được tìm thấy trong vi khuẩn, vi khuẩn khảo cổ và nấm, với khối lượng phân tử từ 120-340 kDa Catalase chứa mangan, ít phổ biến hơn, đã được mô tả từ một số vi khuẩn axit lactic và vi khuẩn ưa nhiệt, được gọi là pseudo-catalase do vị trí hoạt động chứa mangan thay vì heme Cấu trúc tinh thể của catalaza mangan cho thấy sự hiện diện của nhóm dimangan trong tâm xúc tác Mặc dù vai trò chính của catalase được cho là loại bỏ hydro peroxit, nhưng gần đây đã có nghi ngờ về tính hạn chế của vai trò này, khi một catalase từ S thermophilum được chứng minh có hoạt tính phenolic oxidase không chọn lọc Các enzym đa chức năng như vậy có thể phổ biến hơn, với bằng chứng về hoạt tính oxidase/peroxidase trong enzym catalase từ các sinh vật khác nhau như Bacillus pumilus và Thermobifida fusca.
3.1.5 Điều hòa biểu hiện gen catalase
Nghiên cứu về phản ứng của vi khuẩn đối với stress oxy hóa đã làm sáng tỏ cách kiểm soát tổng hợp catalase trong các tế bào khác nhau Cụ thể, nghiên cứu với E.coli và Salmonella typhimurium cho thấy có hai con đường điều hòa biểu hiện catalase E.coli sản xuất hai loại catalase, bao gồm hydroperoxidase HPI và catalase đơn chức HPII, được tổng hợp độc lập HPI được kích thích bởi H2O2 trong môi trường, trong khi HPII được tạo ra trong giai đoạn phát triển pha tĩnh Gen KatG mã hóa HPI và được điều chỉnh bởi cơ chế OxyR, phản ứng với stress oxy hóa Protein OxyR, thuộc họ protein điều hòa LysR, thay đổi cấu trúc từ dạng khử sang dạng oxy hóa, cho phép nó cảm nhận ứng suất oxy trong tế bào.
Quá trình oxy hóa dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và chuyển ứng suất oxy hóa thành RNA polymerase, trong đó hệ thống điều hòa gen katE, mã hóa HPII, yêu cầu gen katF hoạt động như một tác nhân tích cực Mức HPII biểu hiện cao khi tế bào ở pha tĩnh và không bị ảnh hưởng bởi hydrogen peroxide hoặc vi khuẩn kỵ khí Yếu tố quan trọng nhất cho sự cảm ứng HPII là σ S, như đã được xác nhận qua các nghiên cứu về sự tham gia của các yếu tố phiên mã bổ sung (Yonca Yuzugullu Karakus, 2020).
Nhóm giả của enzym catalase gan ngựa được phân lập lần đầu bởi Stern vào năm 1935, xác định là protoheme (hematin) với một nguyên tử sắt và vòng porphyrin Nhóm chân giả heme nằm bên trong protein, cách bề mặt khoảng 20Å trong hầu hết các catalase chứa hem Mặc dù có điểm tương đồng trong túi liên kết heme, catalase từ các nguồn khác nhau chứa các nhóm chân tay giả khác nhau Các catalase tiểu đơn vị nhỏ chứa protoporphyrin IX sắt không liên kết cộng hóa trị (heme b), trong khi hầu hết catalase tiểu đơn vị lớn chứa heme d, một dạng oxy hóa của protoporphyrin IX Heme d được tìm thấy trong các vị trí hoạt động của Penicillium vitale catalase (PVC) và HPII từ E coli, với cấu trúc đặc trưng liên quan đến định hướng heme b trong catalase tiểu đơn vị nhỏ như catalase gan bò (BVC) Sự chuyển đổi giữa heme b và heme d đã được nghiên cứu, với các nhà khoa học đề xuất rằng quá trình oxy hóa heme trong HPII có thể được xúc tác bởi chính HPII Các gốc ở trung tâm hoạt động của các enzym khác nhau cho thấy sự khác biệt giữa protoheme và heme d Catalase tiểu đơn vị nhỏ có khả năng liên kết với đồng yếu tố NADP(H), không cần thiết cho hoạt động catalase, nhưng giúp bảo vệ enzym khỏi sự hình thành chất trung gian không hoạt động xúc tác (cpd II).
Chu trình xúc tác không yêu cầu hình thành hợp chất II và không cần liên kết NADP(H) NADP(H) được phát hiện là cần thiết cho quá trình khử các peroxit nhỏ, bao gồm cả hydro peroxit Các catalase có kích thước tiểu đơn vị lớn có miền đầu cuối C với cấu trúc liên kết tương tự flavodoxin Mặc dù có sự khác biệt này, các dư lượng NADPH trong catalase gan bò vẫn được bảo tồn trong HPII Chỉ có hai gốc ion hóa tương tác với NADP(H) trong catalase của bò (Asp212 và His304) khác với HPII (Glu270 và Glu362), nhưng đột biến của chúng không thúc đẩy liên kết nucleotide trong trình tự của bò (Yonca Yuzugullu Karakus, 2020).
Hình 3.3: Cấu trúc của hem b (a) và hem d (b)
Thí nghiệm tổng hợp catalase trong ống nghiệm
Các chủng vi khuẩn E faecalis được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 1 Tế bào được nuôi ở 37°C trên thạch Todd Hewitt hoặc trong nước đậu nành thử nghiệm (TSB2 không có dextrose, Difco) bổ sung 1% glucose (TSBG) Khi cần, 10 µg/ml cloramphenicol được thêm vào môi trường Khi hemin (Sigma-Aldrich) được chỉ định, nó được thêm vào TSBG từ dung dịch gốc 10 mM trong dimetyl sulfoxit (DMSO) Nồng độ hemin trong dung dịch gốc được xác định bằng trọng lượng và xác nhận bằng phương pháp pyridin hemochromogen Escherichia coli được nuôi ở 37°C trong LB hoặc trên đĩa thạch LB (LA) mà không thêm 12,5 µg/ml cloramphenicol.
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn được sử dụng
Strain or plasmid Relevant characteristics
The EMB4 katA82 cydC:Tn vector is a Tet r pAM401 shuttle vector for E coli and E faecalis It includes the Cm r pLUF15 katA(His)6 construct within pAM401 Additionally, the Cm r pLUMB29 katA is incorporated in the pCR-Blunt II-TOPO system Furthermore, the Kan r pLUMB31A katA82 is present in pAM401, alongside the Cm r pLUMB38 katA(Strep-tag II) also within pAM401.
Tiến hành xác định cấu tạo plasmid pLUMB29 và pLUMB31A, sau đó phân tích chiết xuất tế bào để tìm KatA và tách chiết RNA tổng số, định lượng RT-PCR Tiến hành tinh sạch Apocatalase và Holocatalase gắn với Hexahistidyl từ tế bào E faecalis, đồng thời sản xuất và tinh chế Apocatalase và Holocatalase gắn StrepII từ tế bào E faecalis Phân tích KatA82 và kiểm tra độ ổn định của katA polypeptide Cuối cùng, thực hiện thử nghiệm catalase tấm Microtiter, chạy sắc ký thấm gel và đo lường hoạt động của catalase.
Vai trò của enzyme catalase
Catalase là enzyme quan trọng có mặt trong peroxisome của hầu hết các tế bào sinh vật hiếu khí, đóng vai trò trung tâm trong quá trình khử độc Enzyme này ngăn chặn sự hình thành H2O2 bằng cách xúc tác phân giải H2O2 thành nước (H2O) và oxy (O2) Bài báo cáo này sẽ phân tích các vai trò điển hình của enzyme catalase.
3.3.1 Enzyme catalase tham gia vào cơ chế bảo vệ chống ôxy hóa gây ra bởi stress mặn ở lúa
3.3.1.1 Nguyên liệu và phương pháp
Nghiên cứu đã khảo sát bốn kiểu gen lúa, bao gồm một giống nhạy cảm với mặn (BRRI dhan 28) và ba giống chịu mặn (BRRI dhan 47, BINA dhan 8 và BINA dhan 10), dưới tác động của các mức NaCl khác nhau (0, 20, 40 và 60 mmol/L) Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu khối hoàn chỉnh ngẫu nhiên với bốn lần lặp lại, đảm bảo khoảng cách đáng kể giữa các chậu để thuận tiện cho việc quản lý.
3.3.1.2 Chiết xuất enzyme và thử nghiệm các enzyme chống oxy hóa
Một phần lá tươi (0,5 g) được trộn đều với 5 mL dung dịch đệm Tris-HCl 50 mmol/L (pH 8,0) để chuẩn bị cho thử nghiệm hoạt động của enzym catalase (EC: 1.11.1.6) Sau đó, hỗn hợp này được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút, và phần dịch nổi được thu thập để tiến hành các thử nghiệm enzym theo phương pháp đã được mô tả bởi Islam và cộng sự.
3.3.2 Enzyme catalase tham gia vào cơ chế chịu hạn ở cây Amaranthus tricolor
3.3.2.1 Nguyên liệu và phương pháp
Nghiên cứu đã lựa chọn hai giống Amaranthus tricolor, bao gồm giống chịu hạn VA13 và giống nhạy cảm với hạn VA15, dựa trên các phân tích hình thái và sinh lý trước đó Hai giống này được trồng trong chậu tại khu vực thử nghiệm có mái che mưa của Đại học Nông nghiệp Bangabandhu Sheikh Mujibur Rahman, Bangladesh, tọa độ AEZ-28 (24°23' vĩ độ bắc, 90°08' kinh độ đông, độ cao 8,4 msl) Khu vực thử nghiệm được bảo vệ khỏi mưa, và lớp đất mặt được lấy từ độ sâu 30 cm, có thành phần đất là đất sét pha bùn với độ pH 6,4 và hàm lượng chất hữu cơ thấp (0,87%).
Hàm lượng N (0,09%) và K trao đổi được (0,13 cmol kg -1) trong đất cho thấy sự cân bằng dinh dưỡng Hàm lượng S đạt mức tới hạn, trong khi P và Zn đều vượt mức tối thiểu (P, S và Zn có mức tới hạn lần lượt là 14, 14 và 0,2 mg kg -1; K là 0,2 cmol kg -1) Hạt giống được gieo trong bầu nhựa với kích thước 22 cm chiều cao, 60 cm chiều dài và 40 cm chiều rộng, với khoảng cách hàng 20 cm và cây cách cây 5 cm Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố: mức độ khô hạn và kiểu gen, có bốn lần lặp lại cho mỗi giống.
Bài nghiên cứu này chia thành 4 phần và áp dụng 3 nghiệm thức xử lý stress do hạn hán, bao gồm đối chứng với độ ẩm 100% (FC), căng thẳng khô hạn vừa phải với độ ẩm 60% (MDS) và căng thẳng khô hạn nghiêm trọng với độ ẩm 30% (SDS).
3.3.2.2 Chiết xuất enzyme và thử nghiệm các enzyme chống oxy hóa
Sau đó cân 1g mẫu lá được làm đông lạnh trong nitơ lỏng, sau đó nghiền trong
Để chuẩn bị dịch chiết enzym, sử dụng 10 mL đệm phosphat 0,1 M, pH 7,5, chứa 0,5 mM EDTA Sau khi lọc các chất đồng nhất, ly tâm ở 4°C trong 20 phút, thu thập phần nổi phía trên để thực hiện các thử nghiệm hoạt động enzym Tất cả các bước chuẩn bị đều được thực hiện ở 4°C Hoạt tính catalase được kiểm tra bằng cách đo sự giảm H2O2, cụ thể là 0,5 mL của 75 mM H2O2 được thêm vào 1,5 mL dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 7) cùng với 50 µL dịch chiết enzym trong 3 mL hỗn hợp phản ứng, theo dõi sự giảm độ hấp thụ ở bước sóng 240 nm.
11 trong 1 phút và hoạt động của enzym được tính toán bằng cách tính lượng H2O2 bị phân hủy
3.3.3 Vai trò của catalase trong một số bệnh do căng thẳng oxy hóa và tuổi tác ở người
Bệnh tiểu đường, một căn bệnh phổ biến hiện nay, được gây ra bởi rối loạn chuyển hóa dẫn đến mức glucose cao trong máu do sự bài tiết hoặc hoạt động không đúng của insulin Bệnh có thể gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như tổn thương thần kinh, mù lòa, bệnh tim, đột quỵ và bệnh thận Hiện nay, tiểu đường có hai loại: type 1 và type 2, trong đó tiểu đường type 2 chiếm khoảng 90% tổng số ca Nguyên nhân chủ yếu của tiểu đường type 2 là do sản xuất insulin thấp và sự kháng insulin ở các tế bào Stress oxy hóa, đặc biệt là do hydrogen peroxide, đã được xác định là yếu tố quan trọng trong sự tiến triển của bệnh Nghiên cứu cho thấy nồng độ hydrogen peroxide ở bệnh nhân tiểu đường type 2 tăng gấp 4 lần so với người khỏe mạnh, và hoạt động của catalase thấp trong tế bào β cũng được quan sát Catalase có vai trò phân hủy hydrogen peroxide, và thiếu hụt enzyme này có thể góp phần vào sự phát triển của bệnh tiểu đường Các tế bào β rất nhạy cảm với oxy hóa, và sự gia tăng nồng độ ti thể trong các tế bào này cũng là một yếu tố nguy cơ.
Ở những bệnh nhân bị tăng huyết áp hoặc hạ huyết áp, stress oxy hóa kéo dài với mức độ thấp có thể gây tích tụ tổn thương oxy hóa trong tế bào β, từ đó khởi phát bệnh tiểu đường.
Bệnh Alzheimer là một trong những nguyên nhân chính gây ra sa sút trí tuệ ở người lớn, với khoảng 5,5 triệu người mắc bệnh tại Hoa Kỳ vào năm 2017, và dự báo sẽ tăng lên 13,8 triệu vào năm 2050 Bệnh được đặc trưng bởi sự lắng đọng của các mảng amyloid β peptide trong não, gây độc cho tế bào thần kinh Nghiên cứu in vitro cho thấy amyloid β làm tăng nồng độ hydrogen peroxide trong môi trường nuôi cấy tế bào thần kinh, có thể do sự liên kết trực tiếp với enzyme catalase, dẫn đến giảm hoạt động của enzyme này Những phát hiện này gợi ý rằng tương tác giữa amyloid β và catalase có thể làm gia tăng tình trạng stress oxy hóa trong tế bào, từ đó góp phần vào sự tích tụ amyloid β và sự phát triển của bệnh Alzheimer.
Bệnh Parkinson là một rối loạn thần kinh liên quan đến tuổi tác, bắt đầu với triệu chứng run tay và tiến triển làm giảm chất lượng cuộc sống Các biểu hiện lâm sàng bao gồm rối loạn vận động, cứng cơ, run khi nghỉ ngơi và mất ổn định tư thế Bệnh khởi phát với run rẩy nhịp nhàng ở tay chân, đặc biệt trong thời gian nghỉ ngơi hoặc ngủ Khi bệnh phát triển, người bệnh gặp khó khăn trong việc kiểm soát vận động do cứng cơ Nguyên nhân chính của bệnh là sự cạn kiệt dopamine do tổn thương tế bào thần kinh ở vùng đệm (SNpc), với khoảng 100-200 tế bào thần kinh bị tổn thương mỗi ngày Cơ chế bệnh sinh phức tạp, liên quan đến di truyền, độc tố môi trường, stress oxy hóa và rối loạn chức năng ty thể Đặc biệt, protein alpha (α) synuclein có vai trò quan trọng trong bệnh lý của Parkinson, với đột biến gen sản xuất α-synuclein dẫn đến sự lắng đọng dopamine trong tế bào chất.
Đột biến α-synuclein gây rò rỉ dopamine vào tế bào chất, dẫn đến sự tự oxy hóa và tạo ra hydrogen peroxide, superoxide, cùng với các loại dopamine-quinone độc hại, gây stress oxy hó Protein α-synuclein đột biến còn ức chế biểu hiện và hoạt động của catalase, có thể do cản trở hoạt động phiên mã của thụ thể peroxisome tăng sinh γ (PPAR γ), điều chỉnh gen CAT Do đó, hoạt độ catalase thấp và sản xuất hydrogen peroxide cao trong bệnh Parkinson có thể là hệ quả của việc ức chế biểu hiện catalase bởi α-synuclein.
Bạch tạng là một bệnh rối loạn sắc tố mãn tính, xảy ra khi các tế bào hắc tố không thể sản xuất melanin do hư hại Nghiên cứu cho thấy nồng độ catalase trong lớp biểu bì của bệnh nhân bạch biến thấp hơn so với nhóm đối chứng khỏe mạnh, trong khi nồng độ hydrogen peroxide lại tăng cao Các gốc hydroxyl có thể hình thành từ hydrogen peroxide thông qua phản ứng Haber-Weiss, dẫn đến oxy hóa lipid trong màng tế bào Điều này có thể gây tổn thương cho tế bào sừng và tế bào hắc tố trong lớp biểu bì da Hơn nữa, sự ức chế của hydrogen peroxide hoặc biến đổi alen của gen CAT cũng góp phần làm giảm hoạt động của catalase.
Nghiên cứu ứng dụng catalase điều chỉnh sinh lý bệnh do stress ôxy hóa gây ra trong bệnh tiểu đường biến chứng tới võng mạc
Tất cả động vật được chăm sóc theo Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ và Tuyên bố của Hiệp hội Nghiên cứu Thị giác và Nhãn khoa (ARVO) về việc sử dụng động vật trong nghiên cứu Chúng được nuôi dưỡng trong điều kiện ánh sáng phòng thí nghiệm với chu kỳ sáng-tối 12 giờ:12 giờ.
Các dòng tế bào võng mạc được nuôi cấy trong môi trường Eagle đã sửa đổi của Dulbecco (DMEM; MIO-M1) hoặc DMEM: Hỗn hợp dinh dưỡng F-12 (DMEM: F12) với nồng độ glucose bình thường (NG; 5 mM) hoặc glucose cao (HG; 17,5 mM) Sau 10 lần truyền trong môi trường có bổ sung nồng độ NG hoặc HG, tế bào NG hoặc HG mãn tính được thu nhận.
Peroxisomal catalase (CAT-SKL) enzyme delivery is utilized to monitor cellular infiltration, with the molecule being bio-labeled on primary amines The cells are treated with this enzyme for effective tracking.
Trong nghiên cứu này, CAT-SKL được sử dụng làm dấu sinh học với nồng độ 100 nM trong các khoảng thời gian 0, 1, 2 và 4 giờ, sau đó mẫu được thu hoạch Protein được tách bằng phương pháp SDS-PAGE và chuyển sang màng nitrocellulose Màng này được chặn bằng sữa không béo 5% và được thăm dò bằng streptavidin-alkaline phosphatase với tỷ lệ pha loãng 1:1000 Các protein phản ứng được phát hiện thông qua Giải pháp 1 bước NBT/BCIP từ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA.
Tế bào cơ Muller võng mạc và tế bào biểu mô sắc tố ở người đã tiếp xúc lâu dài với mức đường huyết bình thường và cao, đồng thời được điều trị bằng dẫn xuất xuyên tế bào của enzyme peroxisomal catalase Mức độ hydro peroxit (H2O2) được đo bằng xét nghiệm định lượng dựa trên huỳnh quang Trong các nghiên cứu in vivo, chuột C57Bl/6 mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin (STZ) được tiêm CAT-SKL dưới da hàng tuần trong 3 đến 4 tháng, trong khi chuột không bị tiểu đường và chuột tiểu đường không được điều trị cũng được nghiên cứu MEMRI được sử dụng để đánh giá hiệu quả điều trị CAT-SKL đối với stress oxy hóa liên quan đến đái tháo đường in vivo Các phân tích tương tự cũng được thực hiện với difluoromethylornithine (DFMO), một chất ức chế không thể đảo ngược của ornithine decarboxylase.
Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase (Đối tượng được sử dụng là Bacillus subtilis PY79)
sử dụng là Bacillus subtilis PY79)
3.5.1 Vật liệu và phương pháp
Chủng vi khuẩn B subtilis PY79 được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting từ Đại học Hoàng Gia Holloway London, Vương quốc Anh Các vật liệu như Gel Q-sepharose Fast Flow và CM-sepharose Fast Flow được mua từ GE Healthcare (Mỹ), H2O2 từ Sigma Aldrich (Mỹ), và thang chuẩn protein từ Thermo Scientific (Mỹ) Tất cả các hóa chất khác đều được mua từ các nhà cung cấp uy tín, đảm bảo độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
Vi khuẩn B subtilis được cấy từ môi trường thạch vào năm môi trường lỏng khác nhau, bao gồm LB (Tryptone 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 1%), DSM (Nutrient Broth 8% g; MgSO4 1 mM; MnCl2 10 mM; CaCl2 1 mM; FeSO4 1 mM), PYS (Peptone 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%), TBS (Peptone 1,5%, tryptone 0,5%, cao nấm men 1%, NaCl 0,5%) và môi trường MT5 (Glucose 3%, peptone 0,5%, cao nấm men 0,2%, NaH2PO4.2H2O 0,61%, K2HPO4.3H2O 0,61%, (NH4)2SO4 0,3%, MgSO4.6H2O 0,3%) Quá trình nuôi cấy được thực hiện bằng cách lắc 200 vòng/phút tại 37℃ trong thời gian 14-16 giờ để trẻ hóa tế bào.
Trong quá trình nghiên cứu, mật độ tế bào A600 được điều chỉnh ở mức 0,05 trong 1 lít môi trường Vi khuẩn sinh catalase được cảm ứng bằng cách bổ sung các nồng độ khác nhau của H2O2, thực hiện 4 lần cảm ứng, mỗi lần cách nhau 10 phút trong pha sinh trưởng Sau 0,5-3 giờ, tế bào vi khuẩn được thu hồi bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút tại 4℃ trong 10 phút Dịch chiết tế bào được thu nhận bằng cách hòa tan vi khuẩn trong 50 ml đệm phosphat 50 mM, pH 7,0 và thực hiện siêu âm phá tế bào 4 lần, mỗi lần 30 giây tại 4℃ Cuối cùng, dịch siêu âm được ly tâm ở 4℃ với tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu dịch nổi cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2 Tinh sạch enzyme catalase từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis
Catalase được tinh sạch từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis thông qua quá trình kết tủa với (NH4)2SO4 ở nồng độ 30-60% Sau khi ủ ở 4℃ trong 3 giờ, dịch nổi được loại bỏ và tủa được thu bằng ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút tại 4℃ Phần tủa sau đó được hòa tan trong đệm A, và phần lớn catalase được xác định trong phân đoạn tủa.
Dịch hoà tủa 50% ammonium sulfate được thẩm tích qua đêm ở 4℃ trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 và sử dụng cho các bước tinh sạch tiếp theo Dịch thẩm tích được đưa lên cột Q-sepharose (2,5x4 cm) đã cân bằng với đệm B, với tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút Sau khi rửa các phân đoạn protein không gắn cột bằng đệm B, protein gắn cột được rửa chiết bằng gradient NaCl (0-0,7 M) trong đệm B Các phân đoạn (1 ml) sau đó được xác định hoạt tính của catalase và đo lượng protein tại A280 nm Các phân đoạn có hoạt tính catalase được dồn lại, cô đặc bằng amplicon 10 kDa và thẩm tích ở 4℃ qua đêm trong đệm CH3COONa 20 mM, pH 4,8 Dịch cô và thẩm tích được đưa lên cột CM-sepharose (1x2 cm) đã cân bằng bằng đệm C Sau khi rửa các protein không gắn hoặc gắn không đặc hiệu, protein gắn cột được rửa chiết bằng đệm C với 0,1 M, 0,3 M và 0,5 M NaCl Các phân đoạn có hoạt tính catalase được dồn lại và thẩm tích loại muối ở 4℃ trong đệm A, sau đó bảo quản ở -20℃ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3 Xác định hoạt độ của catalase
Hoạt độ của catalase được xác định bằng khả năng phân giải H2O2 ở nhiệt độ 37℃, sử dụng máy quang phổ ở bước sóng 240 nm Lượng H2O2 phân giải mỗi phút được tính theo định luật Lambert Beer, với hệ số hấp thụ của H2O2 là 43,6 M -1 cm -1 tại bước sóng này Một đơn vị hoạt độ của catalase tương ứng với việc phân giải 1 µmol H2O2 trong một phút ở 37℃ và pH 7,0.
3.5.4 Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng định luật Lambert Beer với hệ số hấp thụ của catalase ở bước sóng 280 nm là 40,75 M -1 cm -1
3.5.5 pH tối thích và ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của catalase Để xác định pH hoạt động tối thích, catalase tinh sạch từ B subtilis PY79 (212U) đã được đo hoạt tính ở các dung dịch đệm có pH 4-12 tại nồng độ 50 mM các đệm:
Các loại đệm được sử dụng để xác định độ ổn định pH của catalase bao gồm CH3COONa (pH 4-5), Kali phosphate (pH 6-7), Tris-HCl (pH 8), glycine-NaOH (pH 9-10) và đệm Na2HPO4-NaOH (pH 11-12) Enzyme tinh sạch được pha trong các đệm này và ủ ở 37°C trong 30 phút Hoạt độ của catalase được xác định theo mục 3.5.3, với hoạt độ cao nhất thể hiện 100% hoạt tính của enzyme.
3.5.6 Nhiệt độ tối thích và ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của catalase Để xác định nhiệt độ tối thích cho hoạt động của catalase, enzyme tinh sạch (212 U) được xác định hoạt độ tại dải nhiệt độ từ 20 – 80℃ Để xác định độ ổn định nhiệt độ củacatalase tinh sạch, enzyme được ủ ở 4–80℃ trong 30 phút Xác định hoạt độ của catalase như mục 3.5.3 và hoạt độ còn lại cao nhất của catalase được xác định là 100% hoạt tính
3.5.7 Ảnh hưởng của một số chất đến hoạt động của enzyme Ảnh hưởng của các chất ức chế (NaN3) và ion kim loại (MnCl2, MgSO4, FeCl3, FeSO4, NaCl) lên hoạt động của catalase được xác định bằng cách đo hoạt tính còn lại của enzyme ở các nồng độ khác nhau của các chất Catalase được xem là còn 100% hoạt tính khi trong phản ứng không có mặt của các chất nghiên cứu
3.5.8 Động học của catalase tinh sạch
Hằng số động học Km và Vmax của catalase tinh sạch từ B subtilis PY79 được xác định thông qua mối quan hệ giữa tốc độ thuỷ phân H2O2 và nồng độ cơ chất, sử dụng phương trình Lineweaver - Burk Nồng độ H2O2 trong thí nghiệm dao động từ 6 đến 30 mM.
