TỔNG QUAN
Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ
Sắc ký là kỹ thuật phân tích và tách biệt các thành phần trong hỗn hợp, dựa vào sự phân bố khác nhau giữa pha động và pha tĩnh Phương pháp này cho phép xác định và phân tích các chất một cách hiệu quả.
Pha tĩnh, hay còn gọi là pha cố định, là thành phần chất liệu hoặc dung dịch được giữ cố định trong quá trình sắc ký Vai trò của pha tĩnh là giữ lại các chất, từ đó giúp phân tách và phân tích các thành phần trong mẫu.
- Pha động (mobile phase): là phần khí hay dung dịch đi qua pha tĩnh, pha di động có tác dụng kéo các chất đi
Hai pha trong quá trình sắc ký luôn tiếp xúc nhưng không hòa trộn Các chất có ái lực cao với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn, trong khi các chất có ái lực thấp sẽ di chuyển nhanh hơn Hơn nữa, các phân tử lớn và nặng sẽ di chuyển chậm hơn trong cột và xuất hiện sau các phân tử nhỏ và nhẹ.
1.1.2 Sắc ký khí – khối phổ
Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là một phương pháp phân tích hiệu quả, kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ, nhằm xác định các thành phần hoạt chất trong mẫu thử Phương pháp này áp dụng cho các mẫu ở dạng hơi hoặc khí, mang lại độ chính xác cao trong việc phân tích.
Sắc ký khí là phương pháp phân tách các thành phần trong mẫu dựa trên sự tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh Các phân tử nhẹ hơn sẽ xuất hiện trước, trong khi các phân tử nặng hơn sẽ xuất hiện sau trên sắc ký đồ Bộ phận khối phổ có nhiệm vụ xác định định tính và định lượng các chất; các phân tử mẹ được chọn lọc trước khi ion hóa và phân tách thành các mảnh ion Các ion đặc trưng cho mỗi chất sẽ được chuyển đến bộ phận lọc, nơi chỉ cho phép các hạt có khối lượng trong một giới hạn nhất định đi qua Thiết bị cảm biến sẽ đếm số lượng các hạt cùng khối lượng, và thông tin này sẽ được gửi đến máy tính để tính toán và đưa ra kết quả khối phổ.
GC/MS là phương pháp tiêu chuẩn vàng trong việc xác định các hoạt chất nhờ vào độ nhạy và độ đặc hiệu cao Mỗi chất được nhận diện qua thời gian lưu và các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử của nó Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu, và các chất có trong mẫu thử chưa biết Với khả năng định tính và định lượng các chất ở thể khí, GC/MS có ngưỡng phát hiện đạt mức picrogram.
1.1.2.1 Cấu tạo của hệ thống GC/MS
Hình 1.1 Cấu tạo hệ thống sắc ký khí – khối phổ [19]
1 Nguồn cấp khí 2 Bộ điều khiển khí nén
3 Bơm tiêm mẫu 4 Lò cột
5 Cột 6 Kết nối sắc ký với khối phổ
7 Nguồn ion 8 Bộ phận phân tích khối lượng
9 Đầu dò 10 Hệ thống chân không
11 Bảng điều khiển điện tử
Bộ phận sắc ký khí
2 Bộ điều khiển khí nén
11 Bảng điều khiển điện tử
8 Bộ phân tích ion khối lượng
Cửa tiêm mẫu bao gồm một bơm tiêm mẫu tự động, nơi dung môi chứa hỗn hợp các chất được tiêm vào hệ thống Sau đó, mẫu sẽ được dẫn qua hệ thống cấp khí và điều khiển khí nén, thường sử dụng khí trơ như heli hoặc hydro Nhiệt độ tại cửa tiêm mẫu được nâng cao để chuyển đổi mẫu từ dạng lỏng sang dạng khí.
Vỏ ngoài: vỏ ngoài của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt (4)
Nhiệt độ của lò này dao động từ 40 o C cho đến 320 o C
Cột trong hệ thống GC là một ống nhỏ hình trụ được tráng bằng polymer đặc biệt, nơi các chất trong hỗn hợp được phân tách khi chạy dọc theo cột Quá trình phân tách diễn ra dựa trên ái lực khác nhau với pha tĩnh, sau đó các thành phần sẽ chuyển qua bộ phận kết nối đến khối phổ.
Nguồn ion cung cấp ion cần thiết để ion hóa các sản phẩm trong hỗn hợp sau khi đã được phân tách Các ion mẹ sau đó sẽ được chuyển đến bộ phận phân tích khối lượng để thực hiện các bước phân tích tiếp theo.
Bắn phá tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử của chất phân tích Những mảnh ion này được chọn lọc và phát hiện bằng đầu dò khối phổ rất đặc hiệu.
Hệ thống chân không: duy trì áp lực chân không trong bộ phận khối phổ
Bảng điều khiển điện tử: sử dụng để điều khiển hệ thống (11)
1.1.2.2 Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Theo nguyên lý kỹ thuật của Honour JW, quá trình thủy phân steroid liên hợp được thực hiện bằng enzym glucuronidase/sulphatase Sau đó, các steroid tự do được tách chiết và tạo dẫn xuất steroid bằng cách sử dụng methoxyamin và trimethylsilylimidazole (TMSI).
Trước khi bơm mẫu vào hệ thống sắc ký khí- khối phổ, cần tinh sạch steroid Trong máy, steroid sẽ được làm bay hơi ở nhiệt độ cao Sau khi được phân tách bởi bộ phận sắc ký khí, steroid sẽ được vận chuyển đến bộ phận khối phổ Tại đây, steroid được ion hóa và bắn phá, tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc của từng steroid, sau đó được phát hiện bằng đầu dò khối phổ.
Thủy phân steroid niệu kết hợp với acid glucuronic và acid sulphuric thông qua enzym glucuronidase và arylsulphatase ở nhiệt độ 37°C trong suốt đêm hoặc ở 55°C trong 3 giờ Sau đó, hoạt hóa cột Bond Elut bằng methanol và rửa sạch bằng nước cất.
Mẫu được đưa lên cột, và các steroid tự do được tách chiết, tinh sạch bằng cột Bond Elut C18, chỉ giữ lại steroid tại màng lọc Sau đó, steroid tự do được rửa giải bằng methanol và làm khô bằng cách bay hơi để loại bỏ methanol Để bảo vệ các nhóm chức –OH khỏi phân hủy do nhiệt độ cao trong quá trình làm hóa hơi, steroid được tạo dẫn xuất với methoxyamine và TMSI Sau khi tạo dẫn xuất và tách chiết, steroid được bơm trực tiếp vào máy sắc ký khí khối phổ, được vận chuyển trong cột sắc ký bằng khí trơ như heli Cuối cùng, các steroid được phân tách nhờ tương tác với pha rắn và được chuyển đến bộ phận khối phổ.
Dưới tác dụng của dòng điện, các steroid niệu sẽ được ion hóa và phá vỡ thành các mảnh ion đặc trưng, phản ánh cấu trúc phân tử của steroid.
Thẩm định phương pháp và thiết lập khoảng tham chiếu
Thẩm định phương pháp là quá trình cung cấp bằng chứng khách quan để xác nhận rằng một phương pháp đang sử dụng hoặc dự kiến sử dụng đáp ứng các yêu cầu cần thiết Việc thẩm định này cần thực hiện đối với các phương pháp chưa được nhà sản xuất kiểm định hoặc có sự thay đổi so với phiên bản ban đầu Ngược lại, xác nhận phương pháp là việc xác minh lại các giá trị mà nhà sản xuất công bố về kết quả thẩm định Hiện nay, có nhiều thuật ngữ như đánh giá phương pháp, định trị phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và phê duyệt phương pháp, tất cả đều ám chỉ đến khái niệm thẩm định và xác nhận phương pháp.
Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đánh giá sai số kỹ thuật của phương pháp phân tích trước khi đưa vào sử dụng hoặc sau khi hiệu chỉnh Các phương pháp đo lường thường bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống, với sai số hệ thống có xu hướng làm cho kết quả xét nghiệm lệch khỏi giá trị thực Để đảm bảo các tiêu chuẩn kỹ thuật đáp ứng yêu cầu chất lượng, cần thẩm định phương pháp thông qua các thực nghiệm thích hợp Đối với các phương pháp phân tích hóa sinh, các thông số cần thẩm định bao gồm độ đặc hiệu phân tích, độ nhạy phân tích, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lệch/độ đúng, độ chính xác/xác thực, và độ lặp/độ tập trung Sau khi các thông số thẩm định được xác định, cần thiết lập khoảng tham chiếu Việc lựa chọn các thông số thẩm định phụ thuộc vào kỹ thuật, yêu cầu phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng xét nghiệm.
Hướng dẫn của CLSI khuyến cáo sử dụng 3 thông số sau:
Giới hạn trắng (limit of blank - LOB) là giá trị đo lường cao nhất có thể quan sát từ mẫu trắng, thường được xác định bằng cách tính giá trị trung bình cộng với 1,65 lần độ lệch chuẩn (SD) của mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà phương pháp định lượng có khả năng phát hiện trong các điều kiện xác định.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể định lượng với độ lặp và độ tái lặp chấp nhận được, cụ thể là CV < 20% Độ lặp, hay còn gọi là độ chụm, thể hiện mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiện độc lập trên cùng một mẫu và trong cùng một điều kiện Để đánh giá độ lặp, thực nghiệm sẽ ước tính sai số ngẫu nhiên do các yếu tố khác nhau trong quá trình tiến hành phương pháp, đây là bước đầu tiên trong việc đánh giá một phương pháp mới.
Có hai loại độ lặp cần đánh giá trong phân tích: độ lặp ngắn hạn (độ lặp trong một lần chạy) và độ tái lặp (độ lặp giữa các lần chạy) Để xác định độ lặp, có thể sử dụng mẫu chuẩn, mẫu nội kiểm, hoặc mẫu bệnh phẩm, với mẫu trộn có chất nền tương tự như mẫu bệnh Số lần chạy lặp lại tối thiểu là 20 lần trong một ngày cho độ lặp lại và hơn 20 ngày cho độ tái lặp Tính toán độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) từ các kết quả chạy lặp lại và so sánh CV với tiêu chuẩn cho phép Độ xác thực hay độ chính xác được định nghĩa là mức độ gần đúng giữa kết quả đo và giá trị thật của phép đo, trong đó trị số thực là khái niệm lý tưởng khó đạt được trong thực tế.
Thực nghiệm so sánh phương pháp nhằm đánh giá độ xác thực và sai số hệ thống giữa phương pháp mới và phương pháp tham chiếu Phân tích các mẫu bệnh phẩm được thực hiện để xác định sai số hệ thống dựa trên sự khác biệt giữa hai phương pháp Nhiều thuật toán thống kê như đồ thị khác biệt, đồ thị so sánh, phân tích hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan có thể được áp dụng để phân tích kết quả Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b được thiết lập, trong đó y là kết quả của phương pháp mới, x là kết quả của phương pháp tham chiếu, a là độ dốc và b là giao điểm Độ dốc a cho biết sai số tỷ lệ giữa hai phương pháp, với giá trị lý tưởng là 1, trong khi giao điểm b cho biết sai số hằng định, lý tưởng là 0.
Sự khác biệt giữa phương pháp cần thẩm định và phương pháp tham chiếu cần được phân tích kỹ lưỡng Nếu sự khác biệt không đáng kể, hai phương pháp có thể được coi là tương đương về độ xác thực, cho phép phương pháp mới thay thế phương pháp tham chiếu Ngược lại, nếu sự khác biệt lớn và không thể chấp nhận về mặt y khoa, cần xác định phương pháp nào có độ xác thực cao hơn Các thực nghiệm đánh giá độ thu hồi và yếu tố nhiễu có thể cung cấp thông tin bổ sung quan trọng.
Trong nhiều trường hợp, phòng xét nghiệm không có phương pháp tham chiếu để so sánh với phương pháp thẩm định Do đó, thực nghiệm đánh giá độ xác thực có thể được thực hiện thông qua chương trình ngoại kiểm Việc so sánh kết quả từ phương pháp xét nghiệm tại phòng lab với kết quả từ chương trình ngoại kiểm là rất quan trọng Chương trình ngoại kiểm steroid niệu đóng vai trò thiết yếu trong việc so sánh và đánh giá kết quả giữa các phòng xét nghiệm khác nhau trên toàn cầu.
Thực nghiệm xác định độ thu hồi (recovery experiment)
Sử dụng hai mẫu, trong đó mẫu 1 thêm chất chuẩn và mẫu 2 thêm dung dịch pha loãng chất chuẩn với thể tích không vượt quá 10% Điều này nhằm đảm bảo không ảnh hưởng đến chất nền phân tích và giữ trong giới hạn tuyến tính của các chất phân tích Phân tích hai mẫu này, mỗi mẫu được đo lặp lại ít nhất 3 lần để tính độ thu hồi.
Công thức tính nồng độ thu hồi và % thu hồi như sau:
Để tính nồng độ chuẩn thêm vào, ta sử dụng công thức: Nồng độ chuẩn thêm vào = Nồng độ chuẩn x thể tích chuẩn thêm vào (mL) Nồng độ thu hồi được xác định bằng cách lấy nồng độ mẫu thêm chuẩn trừ đi nồng độ mẫu thêm nước cất Tỷ lệ thu hồi (%) được tính theo công thức: Thu hồi (%) = Nồng độ thu hồi / Nồng độ chuẩn thêm vào x 100.
Honour JW đã chỉ ra rằng phương pháp định lượng steroid niệu đạt độ thu hồi khoảng 90%, với độ lặp và độ tái lặp dưới 25% Độ nhạy của các xét nghiệm định lượng steroid khác nhau, và để phát hiện đỉnh trên sắc ký đồ, cần khoảng 10 ng steroid tiêm vào cột sắc ký hoặc 200 pg steroid tiêm vào cột khi sử dụng sắc ký khí – khối phổ chọn lọc ion (GC/MS-SIM).
1.2.2 Thiết lập khoảng tham chiếu
Khoảng tham chiếu là khoảng phân bố giá trị đặc trưng trong một quần thể sinh học, và nó là yếu tố cuối cùng được đánh giá trong quá trình thẩm định phương pháp Mặc dù không phải là yếu tố quyết định hiệu năng của phương pháp, việc thiết lập khoảng tham chiếu mới cho xét nghiệm hoặc xác nhận khoảng tham chiếu của nhà sản xuất là rất quan trọng để hỗ trợ diễn giải kết quả xét nghiệm cho người bệnh.
Hướng dẫn CLSI EP28A-C3 cung cấp quy trình chi tiết cho các phòng xét nghiệm để thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu Việc thiết lập khoảng tham chiếu là cần thiết cho mỗi kỹ thuật xét nghiệm mới, do sự khác biệt về giới tính, tuổi tác, chủng tộc và vùng địa lý Do đó, các chuyên gia y tế khuyến cáo rằng mỗi phòng xét nghiệm nên tự thiết lập giá trị tham chiếu riêng cho từng xét nghiệm theo các bước hướng dẫn.
Bước đầu tiên trong nghiên cứu là lựa chọn quần thể tham chiếu, bao gồm những người khỏe mạnh có nguy cơ thấp mắc các bệnh liên quan Quần thể này cần phải đại diện cho một nhóm lớn hơn Việc lựa chọn đối tượng tham chiếu để thiết lập khoảng tham chiếu dựa trên thông tin và các nghiên cứu trước đó là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của nghiên cứu.
Sinh tổng hợp hormon steroid và bệnh rối loạn tổng hợp steroid bẩm sinh 16 1 Tổng hợp hormon steroid
Cholesterol is transported into the mitochondria by the StAR protein (steroid acute response protein) Inside the mitochondria, cholesterol undergoes a transformation where a 5-carbon chain is removed by the enzyme desmolase, resulting in the production of pregnenolone, a crucial intermediate Pregnenolone then exits the mitochondria and enters the endoplasmic reticulum, where it is utilized to synthesize all three groups of steroid hormones.
Nhóm 1 gồm các hormon tham gia chuyển hóa muối nước như DOC, corticosterone, 18OH-corticosterone, aldosterone (nền màu xanh lá cây)
Nhóm 2 gồm các hormon tham gia chuyển hóa glucose như 11- deoxycortisol, cortisol, cortisone (nền màu cam)
Nhóm 3 gồm các hormon sinh dục nam như testosterone, 5α-DHT (nền màu xanh đậm) Hormon sinh dục nữ như oestrone, oestradiol (nền màu hồng)
Một số tiền chất đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ba nhóm hormone, đặc biệt là hormone sinh dục với nền màu xanh nhạt và tiền chất tổng hợp cortisol như progesterone và 17-OHP, có nền màu vàng.
Các gen CYP21A2, CYP11B1, HSD3B2, CYP11B2, CYP17A1… là gen quy định tổng hợp các enzym 21-OH, 11β-OH, 3β-HSD, 17α-OH…
Các sản phẩm chuyển hóa của steroid trong nước tiểu như THE
(tetrahydrocortisone), THF (tetrahydrocortisol), 5α-THF, THS (tetrahydro-11- deoxicortisol), THA (tetrahydroaldosterone), THB (tetrahydrocorticosterone), An (androsterone), Et (etiocholanolone), PD (pregnanediol), PTL (pregnanetriolone),
Hình 1.2 Sơ đồ sinh tổng hợp các hormon steroid [11]
1.3.2 Bệnh lý rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh
Các rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh bao gồm [1],[2]:
Nhóm 1: bất thường tổng hợp glucocorticoid gây tăng sản thượng thận bẩm sinh do tuyến thượng thận giảm hoặc mất khả năng tổng hợp cortisol
Nhóm 2: bất thường tổng hợp hormon chuyển hóa muối-nước và glucocorticoid gây mất cân bằng nước – điện giải
Nhóm 3: bất thường tổng hợp hormon sinh dục: giảm tổng hợp androgen hoặc estrogen gây rối loạn phát triển giới tính
Ngoài ra, có thể gặp các bất thường tại thụ thể của hormon steroid gây ra các triệu chứng giống với rối loạn tổng hợp hormon steroid
1.3.2.1 Rối loạn sinh tổng hợp hormon nhóm glucocorticoid gây tăng sản thượng thận bẩm sinh
Bệnh TSTTBS (Thiếu hụt steroid sinh dục bẩm sinh) lần đầu tiên được mô tả trong y văn vào năm 1865 bởi một nhà giải phẫu người Italia Đây là một bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, do đột biến gen gây thiếu hụt một trong năm enzym cần thiết cho tổng hợp cortisol hoặc bất thường trong protein vận chuyển cholesterol vào ty thể Khi nồng độ cortisol trong cơ thể thấp, tuyến yên sẽ tăng cường bài tiết ACTH, dẫn đến sự tăng sinh tế bào tuyến thượng thận, gây ra tình trạng tăng sản thượng thận và tăng tiết androgen, từ đó gây rối loạn phát triển giới tính ở nữ Các thể bệnh của TSTTBS bao gồm nhiều dạng khác nhau.
- TSTTBS do thiếu enzym 21-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 11β-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 3β-HSD type II
- TSTTBS do thiếu enzym 17α-hydroxylase/17,20 lyase
- TSTTBS thể lipid hóa (Lipoid adrenal hyperplasia) do bất thường
- Thiếu hụt Cyt P450-oxidoreductase (POR) gây giảm hoạt tính đồng thời một số enzym như 21-OH, 17α-hydroxylase, aromatase
Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển 17-OHP thành 11-deoxycortisol tiền chất để tổng hợp cortisol và xúc tác chuyển progesterone thành 11- deoxycorticosterone tiền chất để tổng hợp aldosterone Thiếu hụt enzym 21-OH thường gặp nhất trong số các rối loạn tổng hợp hormon steroid, gồm thể cổ điển mất muối, thể nam hóa đơn thuần và thể không cổ điển [28]:
Thể mất muối có triệu chứng thừa androgen từ trong bào thai, rối loạn nước và điện giải, chiếm khoảng 75% người bệnh mắc TSTTBS thể cổ điển
Thể nam hóa đơn thuần không rối loạn nước điện giải, chỉ thừa androgen từ trong bào thai, chiếm khoảng 25% người bệnh mắc TSTTBS thể cổ điển
Thể khởi phát muộn hay không cổ điển với dấu hiệu thừa androgen xuất hiện muộn sau khi sinh, không có rối loạn nước–điện giải Hơn 30 triệu trẻ sơ sinh đã được sàng lọc ở hơn 30 quốc gia và vùng lãnh thổ Tần suất mắc thiếu enzym 21-OH thể cổ điển khác nhau tùy theo từng chủng tộc và vùng địa lý, với mức trung bình ở Hoa Kỳ và châu Âu khoảng 1:15.000 đến 1:16.000 trẻ sơ sinh sống Tại New York, tần suất TSTTBS thiếu 21-OH thể cổ điển là 1:18.170, trong khi ở vùng Emilia thuộc Italia là 1:8.586.
Tần suất mắc TSTTBS cao nhất được ghi nhận ở người Yupik Eskimos tại Alaska (1:282) và người dân trên đảo Réunion (1:2.141) Tần suất thiếu enzym 21-OH thể không cổ điển cao hơn thể cổ điển, có thể đạt tới 3% tùy theo chủng tộc, với trung bình khoảng 1:100 ở người da trắng, cao nhất là 1:27 ở người Ashkenazi Jews và 1:53 ở chủng tộc Tây Ban Nha, trong khi thấp hơn ở một số nước châu Âu Mặc dù chi phí phát hiện TSTTBS khá cao, việc sàng lọc và phát hiện sớm đã trở thành quy trình thường quy ở nhiều quốc gia từ những năm 1980, giúp điều trị kịp thời cho người bệnh.
Triệu chứng chính của người thiếu enzym 21-OH cổ điển là sự gia tăng nồng độ androgen trong máu, dẫn đến các dấu hiệu nam hóa ở trẻ nữ xuất hiện từ khi mang thai và ngay sau sinh Cơ quan sinh dục nữ có sự biến đổi theo hướng giống bộ phận sinh dục nam, với hiện tượng phì đại âm vật tương tự như dương vật, được phân loại theo thang Prader từ độ I đến V Trong khi đó, các cơ quan sinh dục bên trong như tử cung, vòi trứng và buồng trứng ở bé gái vẫn phát triển bình thường, và trẻ nam không có dấu hiệu bất thường nào ở bộ phận sinh dục.
Rối loạn nước – điện giải thường gặp ở bệnh nhân mắc TSTTBS thể 21-OH cổ điển, với khoảng 75% trường hợp có sự giảm aldosterone Tình trạng này dẫn đến hạ natri, tăng kali và các dấu hiệu mất nước mạn tính như giảm cân, da khô, nhăn, thóp lõm, li bì, chậm chạp, thậm chí có thể hôn mê.
Khoảng 25% bệnh nhân thiếu hụt 21-OH cổ điển chỉ có biểu hiện rối loạn giới tính mà không kèm theo rối loạn điện giải Các dấu hiệu nam hóa thường xuất hiện ngay sau khi trẻ nữ sinh ra.
Thể không cổ điển hay thể khởi phát muộn của hội chứng thừa androgen có thể xuất hiện sau khi sinh Trường hợp TSTTBS thể khởi phát muộn đầu tiên được ghi nhận vào năm 1957 ở một phụ nữ có dấu hiệu rậm lông và mụn trứng cá Ở nam giới, dấu hiệu này do testosterone được sản xuất tại tuyến thượng thận thay vì tinh hoàn, dẫn đến giảm sinh tinh trùng và tinh hoàn kém phát triển.
Xét nghiệm máu có thể phát hiện rối loạn nước-điện giải ở bệnh nhân TSTTBS thể mất muối, với nồng độ natri thấp, kali cao, hoạt tính aldosterone thấp và hoạt tính hệ renin tăng cao Nồng độ cortisol có thể thấp hoặc bình thường, nhưng ACTH thường tăng ở mọi lứa tuổi Đối với thể thiếu hụt 21-OH cổ điển, nồng độ 17-OHP, DHEA, androstenedione và testosterone tăng cao trong máu ở thanh thiếu niên và người trưởng thành Trong thể không cổ điển, nồng độ 17-OHP tăng trước và sau 30-60 phút khi thực hiện nghiệm pháp kích thích bằng ACTH.
Xét nghiệm di truyền cho thấy thiếu enzym 21-OH là bệnh rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh, do đột biến gen lặn trên gen CYP21A1 tại nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3) Một số đột biến nặng (null) làm giảm hoạt tính enzym 21-OH xuống dưới 1%, dẫn đến tình trạng TSTTBS thể mất muối và rối loạn nước điện giải trong tháng đầu đời Các đột biến khác gây giảm hoạt tính enzym còn 1-10% gây ra hiện tượng nam hóa đơn thuần, với các dấu hiệu xuất hiện ngay khi sinh Ngoài ra, những đột biến làm giảm hoạt tính enzym khoảng 30-50% chỉ gây thể không cổ điển Hiện đã phát hiện hơn 140 đột biến trên CYP21A2, trong đó chỉ có khoảng 10-12 đột biến thường gặp.
Enzym 11β-OH đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi 11-deoxycortisol thành cortisol và chuyển DOC thành corticosterone tại lớp bó và lớp lưới của vỏ thượng thận Sự thiếu hụt enzym này dẫn đến giảm tổng hợp cortisol, làm tăng nồng độ 11-deoxycortisol và DOC Tình trạng thiểu năng tuyến thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) do thiếu hụt 11β-OH chiếm từ 5-8% tổng số trường hợp, đứng thứ hai sau thiếu hụt 21-OH Tần suất TSTTBS cổ điển do thiếu hụt 11β-OH ước tính khoảng 1:100.000 đến 1:200.000 trẻ sơ sinh sống.
Tại châu Âu, tỷ lệ thiếu 11β-OH thể cổ điển chỉ chiếm khoảng dưới 5% tổng số bệnh nhân TSTTBS Tuy nhiên, tần suất thiếu 11β-OH thể cổ điển lại cao hơn đáng kể ở các cộng đồng người Hồi giáo và Do Thái tại Israel và Trung Đông, với tỷ lệ có thể lên tới 1:5.000 đến 1:7.000 trẻ sơ sinh, chiếm khoảng 15% tổng số bệnh nhân TSTTBS.
Thiếu 11β-OH được chia thành hai thể: cổ điển và không cổ điển Thể cổ điển thường có triệu chứng tăng tiết androgen, gây nam hóa trẻ nữ và cơ quan sinh dục ngoài không rõ ràng, kèm theo tăng natri, hạ kali, tăng huyết áp và đau đầu Trong khi đó, thể không cổ điển xuất hiện dấu hiệu thừa androgen sau sinh nhưng không có rối loạn nước – điện giải, và thường ít được công bố do thiếu dấu hiệu lâm sàng rõ ràng Chẩn đoán thể không cổ điển cần định lượng 11-deoxycortisol trước và sau khi kích thích bằng ACTH hoặc phân tích gen CYP11B1.
Nghiên cứu về rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở Việt Nam 41 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh đã được nghiên cứu tại Việt Nam từ những năm 1970, với trọng tâm trước năm 1999 là các đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm máu liên quan đến suy thượng thận Chẩn đoán rối loạn này ở trẻ em dựa vào các dấu hiệu lâm sàng và nồng độ 17-OHP trong máu, cùng với sự gia tăng progesterone, kali, testosterone, 17-ketosteroid và hạ natri.
Chẩn đoán dựa trên các tiêu chuẩn không đặc hiệu có thể gây ra nhầm lẫn trong việc xác định TSTTBS, dẫn đến khả năng bỏ sót do nồng độ 17-OHP và testosterone không đạt mức cao.
Người bệnh TSTTBS cần được theo dõi và điều trị bằng 17-OHP để phát hiện các biến chứng suy thượng thận cấp, có nguy cơ gây tử vong Từ ngày 1/1/2006 đến 31/12/2010, khoa Nội tiết- Chuyển hóa- Di truyền đã tiếp nhận 52 trường hợp suy thượng thận cấp do TSTTBS.
Từ năm 1999, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các đột biến gen ở bệnh nhân TSTTBS, bao gồm đột biến mất đoạn 8 nucleotid ở exon 3 trên gen CYP21 và một số đột biến điểm khác Tuy nhiên, việc sử dụng ít cặp mồi để phát hiện các đột biến thường gặp mà không giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 đã dẫn đến chỉ 24 trong số 43 bệnh nhân (55,8%) được phát hiện có đột biến, trong khi 19 bệnh nhân (44,2%) có triệu chứng TSTTBS vẫn chưa được xác định đột biến gen CYP21.
Vào năm 2017, Vũ Chí Dũng và nhóm nghiên cứu đã công bố kết quả phân tích gen CYP21A2 trên 212 bệnh nhân có đột biến, nhằm chẩn đoán tình trạng thiếu 21-hydroxylase (21-OH) Trong số đó, 11 bệnh nhân được phát hiện có tình trạng thiếu 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-OH), và 3 bệnh nhân thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase II (3β-HSD II).
[13] Một trường hợp TSTTBS do thiếu 21-OH không được chẩn đoán, điều trị sớm và đầy đủ được phát hiện có u vỏ thượng thận [114]
Năm 2012, Phạm Thu Nga đã nghiên cứu 695 bệnh nhân rối loạn phát triển giới tính, trong đó 51,7% là nữ với nhiễm sắc thể 46,XX, chủ yếu do TSTTBS chiếm 91,9% Bên cạnh đó, 25% bệnh nhân có nhiễm sắc thể 46,XY, trong đó 8,1% gặp tình trạng không nhạy cảm với androgen.
Từ năm 2012 đến nay, đã có nhiều công bố về việc phát hiện đột biến gen CYP11B1, đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh nhân mắc TSTTBS do thiếu 11β-OH, trong đó có một số đột biến mới được ghi nhận.
Số lượng bệnh nhân mắc TSTTBS và rối loạn phát triển giới tính ngày càng gia tăng, với 50-70 trường hợp được khám và điều trị hàng năm tại Bệnh viện Nhi Trung ương Sự gia tăng này yêu cầu áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác để theo dõi điều trị và phân biệt các thể bệnh khác nhau Mặc dù đã có kỹ thuật phân tích gen giúp chẩn đoán thiếu 21-OH và 11β-OH, vẫn còn nhiều bệnh lý khác, đặc biệt là rối loạn phát triển giới tính ở người mang nhiễm sắc thể 46,XY, chưa được chẩn đoán xác định tại Việt Nam, như thiếu 5α-reductase type 2 và thiếu 3β-HSD.
II nên phải hợp tác và gửi mẫu phân tích ra nước ngoài như Nhật Bản, Pháp [116],[117]
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
269 trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày tuổi đến 11 tuổi chia làm 4 nhóm tuổi, đảm bảo số mẫu trong mỗi nhóm đạt ≥ 39 [25]:
Nhóm 1: 64 trẻ từ 1 ngày đến 28 ngày tuổi
Nhóm 2: 61 trẻ từ 1 tháng (≥ 29 ngày) đến < 2 tuổi
Nhóm 3: 74 trẻ từ 2 tuổi đến < 8 tuổi
Giới tính: nam và nữ tương đương nhau
Tiêu chuẩn lựa chọn trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày đến 11 tuổi, bao gồm trẻ sơ sinh đủ tháng theo tiêu chuẩn WHO với tuổi thai từ 37-42 tuần và cân nặng khi sinh trên 2500g Tất cả trẻ em phải không có dấu hiệu mắc TSTTBS hoặc RLPTGT như sạm da, mất nước, và bất thường ở bộ phận sinh dục Ngoài ra, cần có tiền sử gia đình không có trẻ mắc TSTTBS và RLPTGT, không sử dụng thuốc corticoid trong vòng 1 tháng trước đó, và được sàng lọc thông qua phiếu điều tra (mẫu trong phụ lục 2a).
Trẻ và hoặc gia đình cam kết tự nguyện tham gia nghiên cứu (theo mẫu trong phụ lục 1)
Tiêu chuẩn loại trừ trong nghiên cứu bao gồm gia đình hoặc trẻ không đồng ý tham gia, trẻ có dấu hiệu lâm sàng nghi ngờ mắc TSTTBS hoặc rối loạn phát triển giới tính, và những trẻ đã được chẩn đoán TSTTBS hoặc RLPTGT trong gia đình Ngoài ra, trẻ được điều trị bằng corticoid trong vòng 1 tháng trước khi lấy mẫu cũng bị loại trừ Mẫu được thu thập tại các địa điểm cụ thể: trẻ sơ sinh tại Khoa Sản Bệnh viện Đa khoa tỉnh Vĩnh Phúc, trẻ dưới 2 tuổi tại trung tâm y tế xã hoặc phường tại Vĩnh Phúc trước khi tiêm chủng, trẻ từ 2-5 tuổi tại các trường mẫu giáo ở Vĩnh Phúc, và trẻ từ 6-11 tuổi tại trường Tiểu học Kim Liên (Đống Đa – Hà Nội).
Khoảng 200 bệnh nhân nghi ngờ mắc rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh, dẫn đến tình trạng TSTTBS và RLPTGT, đã được các bác sĩ tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền chẩn đoán Các chẩn đoán này được thực hiện tại phòng khám và khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền của Bệnh viện Nhi Trung ương, cũng như tại khoa Phẫu thuật Nhi của Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
Tiêu chuẩn lựa chọn khi có một hoặc nhiều dấu hiệu sau:
Người bệnh TSTTBS: Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm dựa vào tiêu chuẩn của New MI công bố [3]
Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân bao gồm bộ phận sinh dục không rõ ràng, khó phân biệt giữa nam và nữ, với các dấu hiệu như phì đại âm vật, môi lớn nhăn nheo và sẫm màu, không thấy tinh hoàn, và lỗ đái thấp Trẻ nam có thể xuất hiện dấu hiệu dậy thì sớm, bao gồm dương vật to lên nhanh chóng, mọc lông mu, có mùi cơ thể và thay đổi giọng nói Cả nam và nữ đều có dấu hiệu sạm da và mất nước, thể hiện qua da khô, thóp lõm, chậm hoặc không tăng cân, giảm cân, nôn mửa và tiêu chảy.
Người bệnh rối loạn phát triển giới tính không do TSTTBS theo phân loại Chicago 2006 [118]:
Người bệnh có thể gặp phải các triệu chứng bất thường ở bộ phận sinh dục như dương vật nhỏ, lỗ đái thấp, ẩn tinh hoàn, hoặc không có dương vật Ngoài ra, họ có thể có dấu hiệu nữ hóa như phát triển vú và có kinh nguyệt ở những người có ngoại hình nam Đối với nữ, có thể xuất hiện dấu hiệu bất thường như vô kinh tiên phát và thiếu dấu hiệu dậy thì Một số người bệnh có thể mang đặc điểm giới tính nam và nữ trên cùng một cơ thể.
Gia đình và/hoặc người bệnh nghi ngờ mắc TSTTBS và RLPTGT chấp thuận và ký phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu (phụ lục 1)
Các đối tượng nghiên cứu không đồng ý tham gia nghiên cứu
Người bệnh rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid mắc phải như Cushing, Addison, hội chứng Conn, khối u tuyến thượng thận.
Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu
- Máy sắc ký khí – khối phổ: GC 7890A –MS 5975 của hãng Agilent Cột sắc ký HP-5MS dài 30m, đường kính trong 0,25 mm, chiều dày film 0,25 àm (Agilent)
Máy hóa sinh tự động Beckman Coulter 2700 được sử dụng để định lượng creatinine trong niệu và đo nồng độ các chất điện giải như natri, kali, và clo trong huyết tương, dựa trên nguyên lý sử dụng điện cực chọn lọc.
- Máy miễn dịch tự động Cobas e601 của hãng Roche dùng trong định lượng cortisol, ACTH, testosterone theo nguyên lý phản ứng miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA
- Manifold để tách chiết ở pha lỏng của steroid niệu sau thủy phân
- Máy lắc IKA vortex Genius 3
- Máy trộn Roller-Mixer của DAIHAN Scientific
- Máy Multivortex của THOMAS Scientific
- Cân phân tích CPA3235 của SARTORIUS để cân hóa chất cần pha
- Máy đo pH dung dịch ORION 3 STAR pH Benchop để đo pH dung dịch đệm acetat 2M dùng trong thủy phân steroid liên hợp trong nước tiểu
- Tủ sấy Manheim của Đức dùng tạo dẫn xuất steroid ở 80 0 C và 110 0 C
- Thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ để loại bỏ methanol trong mẫu sau khi rửa giải loại Dry block heater của Ratek
- Máy ly tâm, tủ lạnh 2-8 o C, -20 o C, pipette, tủ hút hóa chất
- Các trang thiết bị cần thiết trong phòng xét nghiệm: găng tay, khẩu trang
Hệ thống sắc ký khí – khối phổ Agilent, được sử dụng tại khoa Hóa sinh của Bệnh viện Nhi Trung ương, là một thiết bị quan trọng cho nghiên cứu này.
2.2.2 Hoá chất và vật tư tiêu hao
Hóa chất định lượng steroid niệu gồm:
- Chất chuẩn steroid niệu (Standard steroid urine) dạng đông khô của SKML (Hà Lan), chứa nồng độ xác định các steroid cần định lượng như An,
Các steroid như Et, DHEA, 11keto An, 11OH An, 11OH Et, PD, PT, A’3, THE, THF, 5a-THF, α-cortolone, β-cortolone, α-cortol, và β-cortol được sử dụng để xây dựng đường chuẩn trong quá trình định lượng steroid Việc này giúp xác định nồng độ steroid niệu trong mẫu thử một cách chính xác.
- Steroid tinh khiết (pure steroid của Steraloids/Sigma): các steroid tinh khiết
99% được sử dụng để xác định thời gian lưu và mảnh ion đặc hiệu trong mẫu thử nghiên cứu các steroid niệu Các steroid tinh khiết được sử dụng bao gồm An, Et, DHEA, 11-OH An, PD, PT, THE, THF và 5α-THF.
Chuẩn nội Androstanol (5α-ANDROSTAN-3β-OL) của IsoSciences, dạng đông khô với trọng lượng 100mg (mã hóa chất 14283), được pha với methanol và thêm vào mỗi mẫu thử với lượng bằng nhau Điều này giúp hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình xét nghiệm, đảm bảo độ chính xác và tin cậy cho kết quả phân tích.
- Acid acetic bình dung tích 2,5L của Merck loại đậm đặc 100% dùng để pha dung dịch đệm acetat 2M (mã số hóa chất 1.00063.2500)
- HCl (hydrochloric acid fuming 37%) của hãng Merck- sản xuất tại Đức
Hóa chất dạng dung dịch, chai 1L, (mã hóa chất 1.00317.1000)
- Methanol dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức, (mã hóa chất
10909809 742) Dùng để hoạt hóa cột Bond Elut, rửa giải và pha chuẩn nội, steroid tinh khiết
- Enzym β-Glucuronidase/arylsulphatase của hãng KURA loại dung dịch 10mL hoặc 25mL để thủy phân steroid liên hợp
- Nitrogen có độ tinh khiết rất cao, mã số UN 1066, nồng độ ≥99,999% dùng làm khô sản phẩm steroid sau tách chiết
- Helium có độ tinh khiết cao, mã số UN 1046 dùng để sắc ký khí
- Methoxyamine hydrochloride độ tinh khiết 98%, lọ 5G dạng bột của hãng Sigma Aldrich, (mã 101397955) dùng để tạo dẫn xuất với steroid
- Pyridine dạng dung dịch chai 1L của hãng Sigma Aldrich có độ tinh khiết
≥99,5% (mã hóa chất 33553), sử dụng để pha methoxyamine
- Sodium acetate anhydrous dạng bột, loại 1000G của Merck dùng để pha đệm acetat 2M trong quá trình thủy phân steroid liên hợp
- Sodium -L-ascorbate (vitamin C), (mã hóa chất A4034), lọ 100G dạng bột của hãng Sigma Aldrich có độ tinh sạch ≥98% nhằm ổn định các steroid tự do
- Iso-octan dạng dung dịch 1L của hãng Sigma Aldrich dùng để tách chiết steroid sau khi đã thủy phân và tạo dẫn xuất
- TMSI (n-Trimethylsilylimidazole) dạng dung dịch, lọ 25mL của SUPELCO, sản xuất tại Hoa Kỳ, (mã hóa chất 33068U)
- Nước cất tinh khiết dành cho sắc ký: dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức dùng để pha hóa chất, chất chuẩn
Vật tư tiêu hao bao gồm: Lọ thủy tinh 2 mL có nắp, ống nghiệm thủy tinh chịu nhiệt loại 7mL và 10mL của Kimax hoặc Pirex
Cột Bond-Elut C18 dùng để tách chiết, tinh sạch các steroid tự do
Bảng 2.1: Các sản phẩm steroid niệu được định lượng
Steroid niệu Thời gian lưu (phút)
5α-THF 24,1 562 472 α-Cortolone 24,4 449 359 β-Cortol 24,5 343 243 β-Cortolone 24,8 449 359 α-Cortol 25,1 343 243
THS là steroid có trong mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để bán định lượng THS trong mẫu thử do mẫu chuẩn không có nồng độ cho THS
- Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khỏe mạnh và người bệnh nghi mắc TSTTBS, RLPTGT Yêu cầu của mẫu nước tiểu:
Không sử dụng chất bảo quản
Thể tích cần thiết > 3mL nước tiểu
Bảo quản: mẫu nước tiểu sau khi lấy được bảo quản tạm thời ở 2 - 8 o C tối đa được 2 tuần Bảo quản ở -20 o C đến khi phân tích (tối đa được 6 tháng)
Thời gian thu thập mẫu: 10/2015-7/2018.
Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả, cắt ngang
2.3.1 Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
2.3.1.1 Quy trình định lượng steroid niệu
Quy trình chuẩn bị mẫu hoàn toàn thủ công, được cải tiến từ kỹ thuật của Honour JW [14], mất khoảng 28 giờ trước khi mẫu được bơm tự động vào máy GC/MS.
A Chuẩn bị hoá chất, thuốc thử:
Để pha dung dịch chuẩn steroid niệu từ dạng đông khô, cần thêm 15 mL nước cất vào lọ chuẩn và để ổn định trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, trộn đều và chia nhỏ thành các ống Eppendorf 2mL, bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
Chuẩn bị hỗn hợp steroid tinh khiết:
Cân chính xác 8 mg mỗi loại steroid tinh khiết và hòa tan trong 100 mL methanol trong tủ hút hóa chất Để hỗn hợp ở bể ấm 37°C cho đến khi tan hoàn toàn và sau đó bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
Chuẩn nội Androstanol: cân khoảng 10 mg chuẩn nội, hoà tan trong 100 mL methanol, thao tác thực hiện trong tủ hút hóa chất, bảo quản ở 4 o C
Chúng tôi đã chuẩn bị mẫu nội kiểm chất lượng (QC) bằng cách thu thập nước tiểu từ người khỏe mạnh để tạo mẫu trộn bình thường và từ người bệnh mắc TSTTBS đã được chẩn đoán để tạo mẫu trộn bệnh lý Các mẫu này được chia nhỏ mỗi ống 3 mL và được bảo quản ở nhiệt độ -20 o C để đảm bảo độ chính xác trong kiểm tra chất lượng.
The External Quality Assessment (EQA) materials from SKML (Stichting Kwaliteitsbewaking Medische Laboratoriumdiagnostiek) in Nijmegen, Netherlands, play a crucial role in the international UCLH Urine Steroid Profile EQA Scheme organized by University College London Hospitals in the UK This program involves participation from 28 laboratories worldwide, with each assessment cycle consisting of 12 freeze-dried samples, allowing for one sample to be tested each month.
Đệm acetat 2M với pH 5,0 - 5,2 được pha chế từ dung dịch acetat 2M và acid acetic 2M với thể tích xác định Việc đo pH và điều chỉnh pH là cần thiết để tối ưu hóa hoạt tính của enzym thủy phân steroid liên hợp.
Cân 100 mg methoxyamine hydrochloride và hòa tan trong 3 mL pyridine để tạo dung dịch 3% Quá trình này cần được thực hiện trong tủ hút hóa chất để đảm bảo an toàn.
Ascorbate: pha 10 mg/1mL nước cất sử dụng ngay mỗi lần phân tích
B Các bước chuẩn bị mẫu: thuỷ phân, tách chiết steroid niệu và tạo dẫn xuất
Để chuẩn bị mẫu nội kiểm và ngoại kiểm cùng với chất chuẩn và mẫu bệnh, hãy cho vào mỗi ống thủy tinh 10mL đệm acetat các thành phần sau: mẫu bệnh phẩm, chuẩn nội, enzym glucuronidase/sulphatase và ascorbate đã pha chế.
Thủy phân steroid liên hợp được thực hiện bằng cách trộn đều các mẫu và sử dụng enzym β-glucuronidase/arylsulfatase Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong suốt đêm Sau quá trình thủy phân, mẫu sẽ được ly tâm ở tốc độ 4000 rpm trong 5 phút.
Bảng 2.2: Cách thức tiến hành định lượng steroid niệu Ống Loại mẫu Thể tích mẫu
Chuẩn nội Đệm acetat Enzym Ascorbate
2 Steroid tinh khiết 0,2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
3 Mẫu trộn bình thường 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
4 Mẫu trộn bệnh lý 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
Để tách chiết steroid tự do, sử dụng cột Blond – Elut C18, đầu tiên đánh số các cột và đặt lên manifold Tiếp theo, cho 3mL methanol vào mỗi cột để kích hoạt Sau khi methanol đã chảy hết, rửa cột bằng 5mL nước cất tinh khiết Sau đó, cho bệnh phẩm đã thủy phân steroid vào cột và chờ cho đến khi chất lỏng chảy xong Để làm sạch, cho thêm 3mL nước cất vào mỗi cột, rồi cuối cùng, tách steroid tự do bằng cách cho 3mL methanol vào mỗi cột.
Làm khô dung dịch methanol chứa steroid bằng thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ ở 70 o C
Tạo dẫn xuất với methoxyamin: cho 100 μL methoxyamin/pyridin 3% đã pha, votex và ủ ở 80 o C trong 1,5 giờ
Tạo dẫn xuất silyl: cho 100 μL TMSI votex rồi ủ ở 110 o C trong 3,5 giờ
Tách chiết bằng iso – octan thu được mẫu để phân tích trên GC/MS: cho
400 μL HCl 1M và 600 μL iso-octan, votex 10 phút, để lắng tự nhiên rồi hút dịch nổi vào glass-insert là mẫu để phân tích trên hệ thống GC/MS
C Phân tích steroid bằng hệ thống GC/MS sau chuẩn bị mẫu
- Sử dụng hệ thống GC 7890A –MS 5975 (Agilent), cột sắc ký HP-5MS, bơm bằng bơm tự động Agilent 7693 Chương trình nhiệt độ lò cột từ 180 đến
Nhiệt độ 300 độ C trong 30 phút với tốc độ khí heli 1 mL/phút được sử dụng để rửa giải các steroid Các steroid này được phát hiện bằng phương pháp phổ khối SIM (selected ion monitoring), trong đó mỗi ion đặc hiệu được áp dụng cho từng steroid cần phát hiện.
Để xây dựng đường chuẩn cho việc phân tích nồng độ steroid, cần thực hiện phân tích mẫu chuẩn chứa 16 sản phẩm steroid đã biết, song song với mẫu người bệnh và các mẫu kiểm tra nội và ngoại Mỗi chất phân tích sẽ có đường chuẩn riêng, được thiết lập dựa trên nồng độ của từng steroid trong mẫu chuẩn Sau khi hoàn tất việc thiết lập đường chuẩn cho từng steroid, phần mềm ChemStation sẽ được sử dụng để xác định nồng độ steroid trong các mẫu thử, mẫu nội kiểm và mẫu ngoại kiểm.
Mẫu steroid tinh khiết được sử dụng như mẫu chuẩn để xác định thời gian lưu của các steroid trong mẫu chuẩn và mẫu bệnh.
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Thực nghiệm xác định giới hạn định lượng (LoQ) được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn pha loãng 5 lần ở 5 nồng độ khác nhau Mục tiêu là xác định giới hạn nhỏ nhất của mỗi steroid có thể phát hiện được Mỗi dung dịch chuẩn pha loãng được đo lặp lại 4 lần trong một mẻ chạy để tính toán giá trị chính xác.
SD và CV Giới hạn định lượng là nồng độ chất chuẩn ở mức thấp nhất được phát hiện mà CV ≤ 20% giữa các lần phân tích
Thực nghiệm đánh giá độ lặp (precision):
Độ lặp lại của kết quả phân tích nước tiểu được xác định bằng cách so sánh hai mẫu nước tiểu bình thường và mẫu nước tiểu bệnh lý, thực hiện 20 lần trong cùng một ngày.
- Độ tái lặp được đánh giá bằng cách phân tích hai mẫu nước tiểu bình thường và bệnh lý > 20 lần trong > 20 mẻ phân tích khác nhau
Phân tích và xử lý số liệu
Mục tiêu của thẩm định phương pháp là tính toán giá trị trung bình (X), độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) để đánh giá độ chụm của kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS thông qua phần mềm Excel Đồng thời, việc đánh giá sự tương quan và tương đồng giữa kết quả ngoại kiểm của phòng xét nghiệm với giá trị trung vị của các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm sẽ được thực hiện bằng phần mềm Method Validator.
Mục tiêu của nghiên cứu là thiết lập giá trị tham chiếu cho nồng độ steroid niệu ở trẻ sơ sinh bằng phương pháp GC/MS, sử dụng phần mềm IBM SPSS 22.0 để phân tích dữ liệu Kết quả cho thấy sự phân bố nồng độ steroid niệu không tuân theo quy luật Gaussian, do đó, phương pháp thống kê phi tham số được áp dụng để xác định khoảng tham chiếu cho từng chất phân tích Sau khi loại bỏ các giá trị bất thường, khoảng tham chiếu được thiết lập dựa trên giá trị thấp nhất và cao nhất của 95% phân bố, từ phân vị thứ 2,5 đến 97,5.
Mục tiêu chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp steroid ở trẻ em là phát hiện các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán TSTTBS và RLPTGT Việc này được thực hiện dựa vào khoảng tham chiếu đã được xây dựng cho nhóm chứng.
- Giá trị p 0,05)
3.2.1 Sự phân bố các steroid niệu
Tất cả 16 sản phẩm chuyển hóa của steroid niệu không tuân theo quy luật chuẩn (Gaussian) Việc xử lý số liệu và so sánh được thực hiện thông qua các thuật toán thống kê dựa vào giá trị trung vị, giá trị thấp nhất và giá trị cao nhất Khoảng tham chiếu được xác định với 95% giá trị nằm ở giữa, được lấy từ điểm cắt phân vị thứ 2,5 và 97,5 cho mỗi kết quả định lượng steroid niệu.
Biểu đồ 3.6 Sự phân bố nồng độ An ở trẻ nam 8 - ≤11 tuổi
Sự phân bố nồng độ An ở trẻ nam trong độ tuổi 8 - ≤11 không theo quy luật chuẩn, phần lớn dữ liệu tập trung ở bên trái biểu đồ
3.2.2 Khoảng tham chiếu nồng độ các steroid niệu
Bảng 3.6 So sánh nồng độ steroid niệu giữa các nhóm tuổi
Giá trị trung vị (min-max)
Có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ các sản phẩm steroid niệu theo nhóm tuổi với p ≤ 0,001 (kiểm định Kruskal – Wallis)
Biểu đồ 3.7 Nồng độ Cortolone và Cortol theo tuổi
Biểu đồ 3.8 Nồng độ An, Et, DHEA, 11Keto An theo tuổi
Et: Etiocholanolone 11Keto An: 11keto Androsterone
Nồng độ Steroid niệu theo nhóm tuổi a-Cortolone b-Cortol b-Cortolone a-Cortol
Nồng độ steroid niệu theo tuổi
An Et DHEA 11Keto An
Biểu đồ 3.9 Nồng độ 11OH An, 11OH Et, PD, PT theo tuổi
11OH An: 11OH-Androsterone PD: Pregnanediol 11OH Et: 11OH-Etiocholanolone
Biểu đồ 3.10 Nồng độ A’3, THE, THF, 5α-THF theo tuổi
Sự biến đổi nồng độ steroid niệu theo độ tuổi cho thấy nồng độ A'3, DHEA và 11keto An cao ở trẻ sơ sinh giảm dần từ 1 tháng đến 2 tuổi, sau đó tăng cao ở trẻ trên 8 tuổi Đồng thời, nồng độ THE, THF và 5α-THF tăng dần ở trẻ trên 2 tuổi.
Nồng độ Steroid niệu theo tuổi
11OH An 11OH ET PD PT
Nồng độ Steroid niệu theo nhóm tuổi
Tuổi àmol/ mmol àmol/ mmol
Bảng 3.7 Khoảng tham chiếu steroid niệu ở trẻ sơ sinh
Giá trị trung vị (min-max)
(μmol/mmol creatinine) Khoảng tham chiếu
11 Keto-An 0,09(0,01 – 0,71) 0,09(0,01 – 1,25) 0,393 0,01 – 0,58 11OH-An 0,03(0 – 0,22) 0,02(0 – 0,18) 0,706 0 – 0,20 11OH Et 0,02(0 – 0,10) 0,03(0,01 – 0,20) 0,058 0 – 0,14
PT 0,05(0,01–1,03) 0,04(0 – 0,13) 0,156 0 – 0,25 A’3 1,74(0,06 – 123,6) 0,47(0,04 – 12,4) 0,211 0,05 – 18,9 THE 0,77(0,09 – 14,4) 0,92(0,31 – 1,84) 0,310 0,16 – 2,76 THF 0,19(0,01 – 4,11) 0,16(0,01 – 0,90) 0,389 0,01 – 0,87 5α-THF 0,3(0,04 – 15,7) 0,36(0,01 – 4,13) 0,893 0,02 – 4,0 α-Cortolone 0,03(0,01 – 0,33) 0,03(0 – 0,09) 0,357 0 – 0,20 β-Cortol 0,02(0 – 0,43) 0,02(0 – 0,05) 0,404 0 – 0,12 β-Cortolone 0,19(0,01 – 3,54) 0,2(0,03 – 0,42) 0,609 0,02 – 0,68 α-Cortol 0,03(0 – 0,72) 0,02(0 – 0,53) 0,170 0 – 0,53 THS 0,01(0 – 0,20) 0,01(0 – 0,1) 0,552 0 – 0,10
* Kiểm định Mann-Withney cho biến phân bố không theo quy luật chuẩn
Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt về nồng độ các steroid niệu giữa nam và nữ ở trẻ sơ sinh (p > 0,05) Mẫu nước tiểu của trẻ sơ sinh chứa các steroid như DHEA, A’3, THE, THF, 5α-THF và β-cortolone, trong khi nồng độ các steroid niệu khác rất thấp.
Bảng 3.8 Khoảng tham chiếu steroid niệu của trẻ 1 tháng - < 2 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu
11 Keto-An 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,28) 0,473 0 – 0,26 11OH-An 0,02(0 – 0,79) 0,04(0 –1,05) 0,278 0 – 0,70 11OH Et 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,18) 0,493 0 – 0,17
Nữ: 0,01–0,25 A’3 0,15(0 – 6,89) 0,17(0 – 5,5) 0,942 0 – 5,42 THE 0,93(0,05 – 22,1) 0,97(0,1 – 6,76) 0,634 0,08 – 6,6 THF 0,15(0,02 – 0,91) 0,11(0,02 – 1,46) 0,507 0,02 – 0,9 5α-THF 0,22(0,02 – 1,93) 0,17(0,02 – 3,33) 0,428 0,02 – 2,47 α-Cortolone 0,15(0 – 0,71) 0,15(0 – 3,47) 0,540 0 – 1,15 β-Cortol 0,05(0 – 0,71) 0,03(0 – 0,18) 0,660 0 – 0,19 β-Cortolone 0,28(0,01 – 1,09) 0,22(0,02 – 12,3) 0,729 0,01 – 1,17 α-Cortol 0,04(0 – 0,71) 0,05(0 – 2,05) 0,398 0 – 0,67 THS 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,10) 0,702 0 – 0,10
* Kiểm định Mann-Withney cho biến phân bố không theo quy luật chuẩn
Không có sự khác biệt nồng độ các steroid niệu giữa nam và nữ (p > 0,05), ngoại trừ PT ở nữ cao hơn nam (p = 0,024) Nồng độ các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu rất thấp ở trẻ từ 1 tháng đến dưới 2 tuổi.
Bảng 3.9 Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 2 - < 8 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu Nam (nC) Nữ (n1) p*
11 Keto-An 0,03(0 – 0,34) 0,02(0 – 1,32) 0,383 0 – 0,29 11OH-An 0,09(0 – 0,78) 0,08(0 – 0,52) 0,900 0 – 0,28 11OH Et 0,02(0 – 0,11) 0,01(0 – 0,43) 0,759 0 – 0,10
PT 0,04(0 – 0,23) 0,05(0,01 – 0,87) 0,159 0 – 0,18 A’3 0,03(0 – 0,42) 0,02(0 – 0,76) 0,755 0 – 0,30 THE 1,88(0,02 – 4,46) 1,75(0,02 – 18,2) 0,943 0,02 – 4,34 THF 0,5(0,01 – 1,31) 0,45(0,03 –5,24) 0,529 0,03 – 1,14 5α-THF 0,77(0,02 – 2,87) 0,64(0,03 – 12,4) 0,352 0,03 – 2,43 α-Cortolone 0,46(0,01 – 2,87) 0,49(0,01 – 16,1) 0,822 0,01 – 2,74 β-Cortol 0,15(0,01 – 0,46) 0,15(0 – 3,9) 0,726 0,01 – 0,33 β-Cortolone 0,3(0 – 0,89) 0,32(0,01 – 8,7) 0,714 0 – 0,82 α-Cortol 0,1(0 – 0,83) 0,09(0 – 4,0) 0,697 0 – 0,6 THS 0,01(0 – 0,10) 0,01(0 – 0,04) 0,136 0 – 0,04
Kiểm định Mann-Whitney cho biến phân bố không theo quy luật chuẩn cho thấy, ở trẻ em từ 2 đến dưới 8 tuổi, mức độ các sản phẩm steroid của androgen (An, Et) còn thấp, trong khi các sản phẩm steroid của cortisol (THE, THF, 5α-THF, cortolone và cortol) có xu hướng tăng cao hơn so với nhóm tuổi nhỏ hơn.
Bảng 3.10 Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 8 - ≤11 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu
Kiểm định Mann-Whitney được áp dụng cho các biến có phân bố không chuẩn Nghiên cứu cho thấy, ở trẻ em từ 8 đến 11 tuổi, nồng độ steroid niệu ở nhóm tuổi này cao hơn so với nhóm tuổi trước Đặc biệt, nồng độ An, Et, 11Keto An, 11OH Et, PD và PT ở nữ giới cao hơn so với nam giới với p < 0,05.
3.2.3 Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán
Sự phân bố các tỷ lệ chẩn đoán không theo quy luật chuẩn, vì vậy giá trị trung vị, giá trị thấp nhất và giá trị cao nhất được sử dụng để so sánh giữa các khoảng tuổi.
Bảng 3.11 So sánh tỷ lệ chẩn đoán giữa các nhóm tuổi
Tỷ lệ chẩn đoán Giá trị trung vị, (min-max) p*
An/Et Không xác định
Et/An Không xác định
*Kiểm định Kruskal-Wallis giữa 4 nhóm
Có sự khác biệt giữa các nhóm tuổi của các tỷ lệ với p< 0,01
Bảng 3.12 Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ sơ sinh
Tỷ lệ chẩn đoán Giá trị trung vị, (min-max) Khoảng tham chiếu
Tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) ở trẻ sơ sinh nam cao hơn so với nữ (p 0,05).
Sự phân bố của số liệu tham chiếu cho thấy 17 thông số định lượng steroid niệu và các tỷ lệ chẩn đoán quan trọng không tuân theo quy luật chuẩn, với sự khác biệt rõ rệt giữa giá trị trung bình và giá trị trung vị, như thể hiện trong biểu đồ 3.6 Do đó, phương pháp thống kê phi tham số được áp dụng để phân tích dữ liệu Tất cả số liệu được sắp xếp theo thứ tự tăng dần, trong đó x đại diện cho thứ tự quan sát, với giá trị nhỏ nhất là x = 1 và giá trị lớn nhất là x = n Giới hạn dưới của khoảng tham chiếu được xác định bởi x0,025 (2.5 th percentile) tương ứng với 0,025 (n + 1), trong khi giới hạn trên được xác định bởi x0,975 (97.5 th percentile) tương ứng với 0,975 (n + 1).
Trong nghiên cứu này, mẫu nước tiểu ngẫu nhiên được sử dụng, đặc biệt phù hợp cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ do tính dễ thu thập, tương tự như nghiên cứu của Lucas-Herald AK và cộng sự Đối với người trưởng thành, mẫu nước tiểu 24 giờ thường được áp dụng để chẩn đoán rối loạn tổng hợp steroid, nhưng việc thu thập mẫu này ở trẻ em gặp nhiều khó khăn và bất tiện Do đó, nước tiểu ngẫu nhiên là lựa chọn hợp lý, với bằng chứng cho thấy nó có thể thay thế mẫu 24 giờ Để đảm bảo độ chính xác, cần điều chỉnh kết quả phân tích bằng cách sử dụng nồng độ creatinine, một chất được bài tiết với tỷ lệ ổn định trong nước tiểu Các sản phẩm steroid niệu thường được báo cáo theo tỷ lệ trên nồng độ creatinine, nhưng hiện chưa có một đơn vị quốc tế thống nhất cho kết quả này, dẫn đến khó khăn trong việc so sánh giữa các nghiên cứu khác nhau.
Trong nghiên cứu về giá trị thu được từ định lượng steroid niệu ở 269 trẻ em bình thường từ sơ sinh đến 11 tuổi, chúng tôi phát hiện sự khác biệt nồng độ steroid niệu theo tuổi với p ≤ 0,001, phân chia thành bốn nhóm: trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ dưới 2 tuổi, trẻ từ 2-8 tuổi và trẻ lớn từ 8-11 tuổi Các nghiên cứu trước đó như của Homma K và Caulfield MP đã thiết lập khoảng tham chiếu cho trẻ sơ sinh, trong khi Nasser AD đã xác định khoảng tham chiếu cho các tuần tuổi khác nhau trong năm đầu đời, cho thấy sản phẩm steroid niệu từ thượng thận thai nhi đạt đỉnh vào tuần thứ 3 và giảm dần theo thời gian Từ năm 1989, Weykamp CW và cộng sự đã công bố giá trị tham chiếu cho 13 sản phẩm steroid niệu theo đơn vị (μmol/L), bao gồm các tỷ lệ như Et/An, THE/THF, và THF/5α-THF cho trẻ em đến 11 tuổi Do đó, chúng tôi đã xây dựng khoảng tham chiếu cho trẻ em ≤ 11 tuổi tại Bệnh viện Nhi, nơi phần lớn bệnh nhân là trẻ nhỏ.
Sự biến đổi nồng độ các steroid theo nhóm tuổi được thể hiện rõ trong các biểu đồ từ 3.7 đến 3.10 Nồng độ An và Et thấp ở trẻ dưới 8 tuổi, nhưng bắt đầu tăng lên ở trẻ trên 8 tuổi Nồng độ DHEA cao nhất ở trẻ sơ sinh do DHEA là sản phẩm steroid chủ yếu từ mẹ qua rau thai sang con Tuy nhiên, nồng độ DHEA giảm thấp ở trẻ trên 1 tháng tuổi Nồng độ 11OH An chỉ tăng dần ở trẻ từ 8 tuổi trở lên và rất thấp ở trẻ dưới độ tuổi này.
Nồng độ 11OH Et ở trẻ em từ sơ sinh đến 12 tuổi thường thấp, nhưng các chỉ số THE, THF và 5α-THF có xu hướng tăng lên ở trẻ em trên 2 tuổi, đặc biệt là ở những trẻ trên 8 tuổi.
Khoảng tham chiếu cho nồng độ các steroid niệu
Chúng tôi đã xây dựng khoảng tham chiếu cho trẻ sơ sinh đủ cân và đủ tháng theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và trẻ khỏe mạnh đến 11 tuổi, nhằm hỗ trợ chẩn đoán cho phần lớn trẻ em Tuy nhiên, hiện tại chúng tôi chưa có khoảng tham chiếu cho trẻ sơ sinh nhẹ cân, thiếu tháng và trẻ trên 11 tuổi.
Nghiên cứu về steroid niệu ở trẻ sơ sinh từ 1 đến 28 ngày tuổi cho thấy không có sự khác biệt giữa nam và nữ với p > 0,05 Nồng độ DHEA và A’3 ở trẻ sơ sinh cao hơn so với các steroid niệu khác, điều này có thể do sự trao đổi qua nhau thai của DHEA từ mẹ sang con Các steroid niệu khác như An, Et, 11-OH An cũng được đề cập trong nghiên cứu này.
Nghiên cứu của Nasser AD và cộng sự cho thấy nồng độ DHEA, PT, THS, 17OHPN, PT, PTL ở trẻ sơ sinh rất thấp và giảm dần trong những ngày đầu, với sự giảm rõ rệt sau 30 ngày Do đó, việc xây dựng khoảng tham chiếu cho trẻ sơ sinh là cần thiết, vì sau 1 tháng có sự khác biệt về nồng độ của một số sản phẩm chuyển hóa steroid niệu.
Nồng độ steroid niệu ở trẻ em có xu hướng giảm dần sau 1 tháng tuổi do sự giảm sản phẩm chuyển hóa steroid từ tuyến thượng thận bào thai và steroid mẹ truyền sang con qua rau thai Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ từ 1 tháng đến dưới 2 tuổi cho thấy chỉ có PT là có sự khác biệt giữa nam và nữ.
Trong độ tuổi này, nồng độ các sản phẩm chuyển hóa của androgen như An và Et rất thấp, trong khi nồng độ A’3 và DHEA còn thấp hơn cả thời kỳ sơ sinh Đồng thời, nồng độ THE cao hơn THF và 5α-THF, và nồng độ cortolone cũng cao hơn cortol.
Nghiên cứu của Nasser AD và cộng sự chỉ ra rằng nồng độ steroid niệu giảm đáng kể từ tháng thứ nhất đến tháng thứ sáu, với hầu hết các steroid chỉ còn khoảng 20% so với thời kỳ sơ sinh vào tuần thứ 25 Trong giai đoạn này, mẫu nước tiểu của trẻ thường rất loãng do lượng sữa tiêu thụ cao, gây khó khăn trong việc định lượng steroid niệu Một số tác giả đã chọn phương pháp cô đặc nước tiểu bằng tách chiết lần đầu trước khi thủy phân một lượng nước tiểu tương ứng với 75 µg creatinine Tuy nhiên, kỹ thuật định lượng steroid niệu rất nhạy, có thể đạt độ chính xác đến khoảng 0,1 µmol/L, đảm bảo kết quả định lượng với phần lớn các steroid niệu trong mẫu nước tiểu có nồng độ creatinine lớn hơn 0,5 mmol/L.
Nồng độ 17 sản phẩm chuyển hóa steroid niệu ở trẻ từ 2 đến dưới 8 tuổi không có sự khác biệt giữa nam và nữ Các sản phẩm chuyển hóa androgen như An và Et, DHEA vẫn ở mức thấp, trong khi nồng độ sản phẩm chuyển hóa cortisol như THE, THF, 5α-THF, α và β-cortolone, α và β-cortol lại cao hơn so với các nhóm tuổi trước Sau 2 tuổi, trẻ em tham gia nhiều hoạt động hơn, dẫn đến tuyến thượng thận tiết ra nhiều cortisol và aldosterone Đồng thời, nồng độ testosterone ở trẻ từ 2 đến 8 tuổi vẫn thấp, khiến cho các sản phẩm chuyển hóa testosterone như An và Et cũng ở mức rất thấp.
Một số trẻ nữ từ 8-11 tuổi bắt đầu có dấu hiệu dậy thì với sự gia tăng hormone sinh dục nữ, trong khi trẻ nam thường bắt đầu dậy thì muộn hơn 1-2 năm Do đó, nồng độ steroid niệu của trẻ từ 8-≤11 tuổi cho thấy sự tăng cao rõ rệt của An và Et, 11OH-An so với nhóm trẻ dưới 8 tuổi.
Kết quả steroid niệu ở người bệnh rối loạn tổng hợp hormon steroid 117 4.4 Ứng dụng định lượng steroid trong chẩn đoán ở người bệnh nghi mắc
Nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương và Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức với 200 bệnh nhân cho thấy 126 người mắc 4 nhóm bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid Cụ thể, có 106 bệnh nhân thiếu 21-OH, 5 bệnh nhân thiếu 11β-OH, 14 bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 và 1 bệnh nhân thiếu 3β-HSD II Đây là lần đầu tiên tại Việt Nam, số lượng bệnh nhân mắc các thể thiếu 21-OH, 11β-OH, 3β-HSD II và rối loạn phát triển giới tính do thiếu 5α-reductase type 2 được chẩn đoán dựa trên định lượng steroid niệu Tuy nhiên, 74 trong số 200 bệnh nhân (37%) vẫn chưa được chẩn đoán do không có mẫu hình đặc trưng đủ tiêu chuẩn, đặc biệt tỷ lệ cao nhất ở nhóm trẻ sơ sinh với 17/44 trẻ.
Tuổi chẩn đoán lần đầu sớm nhất là từ 1 ngày tuổi (6 giờ) đối với thiếu 21-OH, 3 tháng với thiếu 11β-OH và 6 tháng tuổi với thiếu 5α-reductase type
2 Kết quả này cũng tương tự như các nghiên cứu đã công bố trước đây của các tác giả trong và ngoài nước là định lượng steroid niệu giúp chẩn đoán TSTTBS thể thiếu 21-OH, thiếu 11β-OH ở trẻ sơ sinh nhưng chỉ có thể chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2 ở trẻ sau 3 tháng tuổi [8],[64] Đặc điểm steroid niệu ở người bệnh thiếu 21-OH chưa điều trị Độ tuổi làm xét nghiệm định lượng steroid niệu cho trẻ từ 1 ngày tuổi đến
Trong số 37 bệnh nhân, 29,73% được chẩn đoán trong tháng đầu, với trường hợp sớm nhất chỉ sau 6 giờ sinh Đáng chú ý, 24,32% bệnh nhân được chẩn đoán trong độ tuổi từ 1 tháng đến dưới 2 tuổi, trong khi 4 bệnh nhân được chẩn đoán muộn sau 8 tuổi, chủ yếu là người dân tộc H’mông ở Lào Cai, Hà Giang, do không có điều kiện khám và điều trị sớm Những bệnh nhân này thuộc thể nam hóa đơn thuần, không có rối loạn điện giải, vì vậy không nguy hiểm đến tính mạng, dẫn đến việc điều trị muộn Tuy nhiên, bệnh TSTTBS cần được phát hiện và điều trị sớm để tránh biến chứng nghiêm trọng như cơn suy thượng thận cấp, với khoảng 35% bệnh nhân mắc TSTTBS gặp phải tình trạng này Do đó, nhiều bệnh nhân được điều trị ngay khi vào viện với nghi ngờ mắc TSTTBS dù chưa có chẩn đoán xác định.
Kết quả phân tích steroid niệu ở 37 bệnh nhân mắc thiếu 21-OH chưa điều trị cho thấy sự xuất hiện rõ ràng của đỉnh 17OHPN và PTL, là những chỉ số quan trọng trong chẩn đoán thiếu 21-OH Tình trạng này dẫn đến tăng tổng hợp androgen, gây ra triệu chứng nam hóa ở trẻ nữ và dậy thì sớm ở trẻ trai, với nồng độ testosterone thường cao Nồng độ PT ở bệnh nhân thiếu 21-OH cao gấp khoảng 100 lần so với nhóm chứng, và PT là sản phẩm chuyển hóa của 17-OHP, tiền chất để tổng hợp cortisol Việc giảm tổng hợp cortisol do thiếu 21-OH làm tăng 17-OHP và bài tiết PT ra nước tiểu, từ đó nồng độ PT cao trở thành chỉ dấu quan trọng trong chẩn đoán bệnh Bên cạnh đó, nồng độ An và Et ở bệnh nhân thiếu 21-OH cũng cao hơn nhóm chứng do tăng sản phẩm chuyển hóa của androgen.
Tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) ở 100% bệnh nhân thiếu 21-OH cao hơn mức tham chiếu, như thể hiện trong bảng 3.20 Nồng độ PT và tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) vượt quá khoảng tham chiếu, kết hợp với sự xuất hiện của đỉnh PTL và 17OHPN trên sắc ký đồ, được coi là tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu 21-OH Đặc biệt, tất cả bệnh nhân thiếu 21-OH đều có tỷ lệ THS/(THE + THF) cao.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 35,1% bệnh nhân thiếu 21-OH chưa điều trị cho thấy tỷ lệ DHEA/(THE+THF+5α-THF) cao hơn mức tham chiếu Điều này có thể do DHEA là tiền chất tổng hợp cortisol, và khi thiếu 21-OH, nồng độ 17OHP và DHEA sẽ tăng lên Thiếu enzym 21-OH dẫn đến việc tăng cường sinh tổng hợp hormon thượng thận qua con đường androgen, làm tăng nồng độ DHEA Đặc biệt, một bệnh nhân được chẩn đoán thiếu 21-OH ở tuổi 17 có tỷ lệ DHEA/(THE+THF+5α-THF) rất cao (6,54 so với 0,17 là giới hạn trên của khoảng tham chiếu) Do đó, độ đặc hiệu của tỷ lệ DHEA/(THE+THF+5α-THF) trong nghiên cứu đạt khoảng 70-90%.
Xét nghiệm 17-OHP được làm cho 18/37 người bệnh thiếu 21-OH chưa điều trị kết quả có 16/18 người bệnh cao hơn khoảng tham chiếu ở phụ lục 7
Mặc dù có 18 người bệnh, nhưng chỉ có 2 người có nồng độ 17-OHP trong giới hạn bình thường Điều này cho thấy việc sử dụng 17-OHP để chẩn đoán thiếu hụt 21-OH có thể dẫn đến việc bỏ sót 2 trong số 18 trường hợp.
Nồng độ cortisol được đo vào lúc 8-10 giờ ở 8/37 bệnh nhân, trong đó 7/8 bệnh nhân có kết quả bình thường Nguyên nhân có thể do nồng độ cortisol không giảm tại thời điểm lấy mẫu, hoặc do kỹ thuật định lượng cortisol bằng phương pháp miễn dịch bị ảnh hưởng bởi nồng độ 17-OHP cao ở bệnh nhân thiếu 21-OH, dẫn đến phản ứng chéo với thuốc thử Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự nhiễu này có thể làm tăng giả tạo nồng độ cortisol trong máu Thêm vào đó, nồng độ cortisol có thể tăng do stress hoặc lo lắng khi lấy máu, ảnh hưởng đến kết quả Do đó, nồng độ cortisol không nên được sử dụng làm tiêu chuẩn chẩn đoán TSTTBS do thiếu 21-OH.
Trong một nghiên cứu về nồng độ ACTH, 8 trong số 37 bệnh nhân được kiểm tra, trong đó 6 bệnh nhân có nồng độ ACTH cao hơn mức tham chiếu, chỉ có 2 bệnh nhân nằm trong giới hạn bình thường Nồng độ ACTH cao thường là dấu hiệu của suy tuyến thượng thận ở những người mắc TSTTBS do thiếu 21-OH Tuy nhiên, những bệnh nhân được phát hiện và chẩn đoán sớm trước khi xuất hiện triệu chứng suy thượng thận thường có nồng độ ACTH trong giới hạn bình thường.
Có 15 người bệnh mắc thiếu 21-OH chưa điều trị có kết quả natri và kali máu, 11/15 người bệnh có kết quả bình thường là những người bệnh được chẩn đoán muộn sau 2 tuổi nên những bệnh này thường không mắc rối loạn nước điện giải Những người bệnh mắc TSTTBS thể mất muối thường là trẻ nhỏ < 2 tháng tuổi, được điều trị hydrocortisone ngay khi vào viện nên thuộc nhóm lấy mẫu nước tiểu sau khi điều trị hydrocortisone Để đỏnh giỏ giỏ trị chẩn đoỏn của nồng độ PT (àmol/mmol creatinine) và tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) trong chẩn đoán thiếu 21-OH, chúng tôi phân tớch đường cong ROC Nồng độ PT là 1,875 (àmol/mmol creatinine) cú độ đặc hiệu 95,9%, giá trị dự đoán dương tính 89,4% với TSTTBS do thiếu 21-OH Với điểm cắt 0,025 thì tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) có độ nhạy 77,1% độ đặc hiệu 61%, giá trị dự đoán dương tính là 59,6% với TSTTBS do thiếu 21-OH
Nghiên cứu của Lucas-Herald AK và cộng sự lại lấy điểm cắt là tại phân vị thứ
95 của khoảng tham chiếu nên các tỷ lệ chẩn đoán đều có độ nhạy 100%, nhưng độ đặc hiệu chỉ là 25% với tỷ lệ PT/(THE+THF+ 5α-THF) [27]
Mẫu hình sắc ký đồ của bệnh nhân thiếu 21-OH có đặc điểm nổi bật với đỉnh 17OHPN, PT và PTL cao, tương tự như những gì đã được công bố bởi Chan.
Các sản phẩm đặc trưng cho tình trạng thiếu 21-OH được mô tả qua các mảnh ion trong biểu đồ 3.13 (17OHPN) và biểu đồ 3.14 (PTL) Thời gian lưu được công bố trong bảng 2.1 cũng là công cụ hữu ích để phân tích sắc ký đồ, giúp phát hiện bệnh nhân mắc chứng thiếu 21-OH.
Phân tích đột biến gen CYP21A2 là tiêu chuẩn quan trọng trong chẩn đoán thiếu hụt 21-OH, đặc biệt hữu ích cho trẻ sơ sinh Tuy nhiên, kỹ thuật này yêu cầu thiết bị chuyên dụng, nhân lực có trình độ, chi phí cao và thời gian chờ kết quả lâu, không phù hợp để theo dõi điều trị Trong số 37 bệnh nhân thiếu hụt 21-OH chưa được điều trị, 13 người đã được phân tích gen CYP21A2 và xác nhận có đột biến gây bệnh.
Tại Việt Nam, chẩn đoán TSTTBS chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng như nam hóa ở trẻ nữ, dậy thì sớm ở trẻ nam, sạm da, mất nước, và cơn suy thượng thận cấp Các xét nghiệm máu cho thấy tăng nồng độ 17-OHP, testosterone, progesterone, ACTH, natri và kali cũng được sử dụng Tuy nhiên, việc chỉ dựa vào các xét nghiệm này không đủ để xác định chính xác bệnh nhân mắc TSTTBS, cũng như không thể khẳng định TSTTBS do thiếu enzym 21.
Kỹ thuật phân tích gen CYP21 đã giúp chẩn đoán xác định TSTTBS do thiếu 21-OH, nhưng vẫn còn nhiều bất cập như chi phí cao và thời gian phân tích lâu Một số trường hợp không phát hiện được đột biến gen mặc dù có dấu hiệu lâm sàng điển hình, cho thấy không có sự tương ứng hoàn toàn giữa kiểu gen và mức độ biểu hiện lâm sàng Kết quả phân tích gen không được sử dụng để theo dõi hiệu quả điều trị hoặc phát hiện quá liều hydrocortisone Do đó, khi triển khai kỹ thuật định lượng steroid niệu, chúng tôi thực hiện đồng thời xét nghiệm máu và nước tiểu, với những trường hợp chẩn đoán rõ ràng sẽ được kết luận, còn những trường hợp chưa rõ ràng sẽ được đề nghị làm lại xét nghiệm hoặc phân tích gen.
Kết quả định lượng steroid niệu ở các trường hợp chưa xác định
Nghiên cứu này ghi nhận 74 bệnh nhân chưa được xác định, trong đó nhiều người có triệu chứng lâm sàng của rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh (TSTTBS), rối loạn điện giải và dậy thì sớm Tuy nhiên, một số bệnh nhân đã được điều trị bằng hydrocortisone trước khi lấy mẫu nước tiểu, dẫn đến việc thiếu các dấu hiệu điển hình cho chẩn đoán Do chưa có phân tích gen cho những bệnh nhân này, nguyên nhân bệnh vẫn chưa được xác định Vì vậy, việc lấy mẫu nước tiểu trước khi điều trị là cần thiết để đảm bảo giá trị chẩn đoán cho xét nghiệm định lượng steroid niệu, từ đó hạn chế các trường hợp âm tính giả do điều trị trước khi lấy mẫu.
Một số nguyên nhân dẫn đến kết quả âm tính trong xét nghiệm có thể bao gồm tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh không hoàn toàn đặc hiệu cho rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid, việc người bệnh đã được điều trị trước khi lấy mẫu, và một số trường hợp rối loạn phát triển giới tính do nguyên nhân khác.
Năm bệnh nhân thiếu 21-OH và 11β-OH đã được xác nhận qua phân tích gen và điều trị bằng hydrocortisone, hiện không còn dấu hiệu điển hình qua GC/MS Nhiều bệnh nhân khác được chẩn đoán là TSTTBS và rối loạn điện giải cũng đã được điều trị hormone thay thế.
Một số bệnh nhân bị rối loạn điện giải không phải do bệnh lý tuyến thượng thận, như rối loạn tiêu hóa hoặc đái nhạt, vì tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh trong nghiên cứu này dựa trên các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu.
Một số trẻ sơ sinh không thể hiện dấu hiệu đặc trưng do chưa xác định được mức steroid đặc hiệu cho trẻ Nhiều bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS nhưng không có dấu hiệu rõ ràng trong kết quả định lượng steroid niệu, và phân tích gen CYP21A2 cho kết quả âm tính.
Rối loạn phát triển giới tính là tình trạng do bất thường trong quá trình biệt hóa cơ quan sinh dục trong thời kỳ bào thai, dẫn đến sự hiện diện của cả cơ quan sinh dục nam và nữ Tình trạng này xảy ra trên cơ thể có tử cung, buồng trứng và tinh hoàn, cùng với dương vật, được gọi là thể ovotesticular.
Hai bệnh nhân mắc rối loạn phát triển giới tính do bất thường nhiễm sắc thể, bao gồm một bệnh nhân 45,XO và một bệnh nhân có chuyển đoạn hòa nhập tâm giữa nhiễm sắc thể 13 và 14 Các trường hợp bất thường nhiễm sắc thể gây bệnh Turner thể khảm đã được công bố, cho thấy đây là nguyên nhân chính gây ra rối loạn phát triển giới tính.
Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS đã được triển khai thành công tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương, với kết quả thẩm định phương pháp đáp ứng các tiêu chuẩn về độ chính xác và xác thực Kỹ thuật này đã được ứng dụng hiệu quả trong chẩn đoán nhiều bệnh rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid, bao gồm thiếu 21-OH, thiếu 11β-OH, thiếu 3β-HSD II và thiếu 5α-reductase type 2, ở cả bệnh nhân chưa điều trị và một số bệnh nhân đã điều trị hydrocortisone Một số trường hợp chưa xác định cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ hơn.
1.Kết quả thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng GC/MS và thiết lập khoảng tham chiếu cho trẻ em ≤ 11 tuổi
1.1 Các thông số thẩm định phương pháp
- Giới hạn định lượng đạt 0,05-0,16 (àmol/L) với phần lớn cỏc steroid niệu
- Độ thu hồi các steroid niệu đạt 90-115%
- Độ lặp lại có CV 1,01-7,72 (%) ở mẫu trộn bình thường và 0,78-9,72 (%) ở mẫu trộn bệnh lý
- Độ tái lặp đạt CV 10,16-14,53 (%) ở mẫu trộn bình thường và 12,51-16,95 (%) ở mẫu trộn bệnh lý
- Tương quan chặt chẽ giữa kết quả ngoại kiểm của Phòng xét nghiệm với giá trị trung vị với hệ số tương quan r đạt 0,970 - 0,999
1.2 Giá trị khoảng tham chiếu steroid niệu
- Khoảng tham chiếu 17 steroid niệu và 8 tỷ lệ chẩn đoán được thiết lập cho
4 nhóm tuổi Tỷ lệ THF/5α-THF, 5α-THF/THF, Et/An và An/Et được xây dựng riêng cho nam nhằm chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2
- Không có sự khác biệt nồng độ steroid niệu giữa nam và nữ ở trẻ < 8 tuổi ngoại trừ PT ở trẻ 1 tháng đến 2 tuổi
- Nồng độ An, Et, 11keto An, 11OH Et, PD, PT ở nữ cao hơn nam có ý nghĩa thống kê với trẻ 8 - ≤11 tuổi
- Tỷ lệ PT/(THE +THF +5α-THF) trẻ sơ sinh ở nam cao hơn nữ trong khi ở trẻ 8 -≤11 tuổi ở nữ cao hơn nam (p< 0,05)
- Không có sự khác biệt tỷ lệ THS/(THE +THF +5α-THF) và DHEA/(THE +THF +5α-THF) giữa nam và nữ ở các nhóm tuổi
2 Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS giúp chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid
2.1 Chẩn đoán thiếu enzym 21-hydroxylase
106 người bệnh được chẩn đoán thiếu 21-OH, trong đó 37 người bệnh chưa điều trị hydrocortisone có đặc điểm:
Sự xuất hiện của đỉnh 17OHPN và PTL là tiêu chuẩn định tính quan trọng trong chẩn đoán thiếu 21-OH Nồng độ PT và tỷ lệ PT/(THE + THF + 5α-THF) cao hơn so với khoảng tham chiếu ở bệnh nhân có dấu hiệu TSTTBS, trong khi tỷ lệ THS/(THE + THF + 5α-THF) vẫn nằm trong giới hạn bình thường.
- Nồng độ các steroid niệu An, Et, PD, PT, DHEA ở người bệnh thiếu enzym 21-OH cao hơn nhóm chứng
5 người bệnh được chẩn đoán thiếu 11β-OH, trong đó 3 người bệnh chưa điều trị hydrocortisone có đặc điểm:
- Nồng độ THS và tỷ lệ THS/(THE + THF + 5α-THF) cao hơn khoảng tham chiếu là tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu 11β-OH
- Nồng độ An, Et, PT, THS cao hơn khoảng tham chiếu
3.3 Chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2
14 người bệnh là nam, rối loạn phát triển giới tính được chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2 khi chưa điều trị có đặc điểm:
- Tỷ lệ THF/5α-THF cao hơn khoảng tham chiếu là tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2
- Tỷ lệ An/Et thấp hơn khoảng tham chiếu gặp ở người bệnh thiếu 5α- reductase type 2 sau 8 tuổi
3.4 Chẩn đoán thiếu 3β-HSD type II
Một người bệnh được chẩn đoán thiếu 3β-HSD II có đặc điểm sau:
- Tỷ lệ DHEA/(THE + THF + 5α-THF) cao hơn khoảng tham chiếu
- Tỷ lệ PT/ (THE + THF + 5α-THF) và THS/(THE + THF + 5α-THF) trong giới hạn bình thường
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Việc triển khai định lượng các steroid niệu quan trọng như PTL, THA, THB, và THS sẽ hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý liên quan đến rối loạn sinh tổng hợp hormone steroid, từ đó cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán TSTTBS.
Xây dựng thêm khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ em > 11 tuổi, người trưởng thành, nhằm chẩn đoán cho người bệnh > 11 tuổi
Bác sĩ lâm sàng nên thực hiện định lượng steroid niệu cho những trường hợp nghi ngờ mắc TSTTBS, rối loạn phát triển giới tính (RLPTGT) và rối loạn điện giải Việc này giúp chẩn đoán các nguyên nhân gây rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid một cách chính xác.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển, Vũ Chí Dũng
Năm 2017, bài báo trình bày về ba trường hợp bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 21-hydroxylase được điều trị muộn tại Bệnh viện Việt Đức Nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Y học Việt Nam, tập 457, tháng 8, số 1, trang 53-57.
2 Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Việt Hoa, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển,
Bài viết của Vũ Chí Dũng (2017) trình bày hai trường hợp rối loạn phát triển giới tính hiếm gặp đã được điều trị phẫu thuật tại Bệnh viện Việt Đức Nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Y học Việt Nam, tập 457, tháng 8, số 1, trang 150-154.
3 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển (2017) Thẩm định quy trình định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ Tạp chí
Y học TP Hồ Chí Minh, tập 21, số 3: 73-78
4 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển, Vũ Chí Dũng
(2017) Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ trong chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh Tạp chí Y học
5 Mai Thi Chi Tran, Ngoc Anh Thi Tran, Phuong Mai Nguyen, Chi Dung Vu, Minh Dien Tran, Diem Ngoc Ngo, Huy Hoang Nguyen, Ronda F Greaves
(2018) 11β-Hydroxylase deficiency detected by urine steroid metabolome profiling using gas chromatography-mass spectrometry Clinical Mass Spectrometry 7: 1-5
6 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển, Ronda F Greaves
(2018) Định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ và ứng dụng lâm sàng Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, tập 22, số 3: 37-43
7 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển, Vũ Chí Dũng, Ronda F Greaves (2018) Định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ trong chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh và rối loạn phát triển giới tính Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, tập 22, số 3: 196-203
8 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Nguyễn Việt Hoa, Trần Minh Điển,
Vũ Chí Dũng, Ronda F Greaves (2019) Thiết lập khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ em bằng kỹ thuật sắc ký khí – khối phổ Tạp chí Y học TP Hồ
9 Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Nguyễn Việt Hoa, Trần Minh Điển, Vũ Chí Dũng, Ronda F Greaves (2019) Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn đoán rối loạn phát triển giới tính do thiếu enzym 5α- reductase type 2 Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, phụ san 23, số 3: 445-452
1 Miller W.L, Auchus R.J (2011) The molecular biology, biochemistry, and physiology of human steroidogenesis and its disorders Endocrine Reviews, 32 (1): 81-151
2 Biason–Lauber A, Zachmann M (1996) Disorders of Steroid synthesis and metabolism, Physician’s Guide to the laboratory diagnosis of metabolic diseases, Second edition, Springer, 551-572
3 New M.I, Oksana L, Karen L.S, Alan P et al (2013) Congenital Adrenal Hyperplasia, Genetic Steroid Disorders, Elsevier, San Diego, CA
4 Wong T, Shackleton C.H.L, Thomas R.C and Ellis G (1992)
Indentification of the steroids in neonatal plasma that interfere with 17α- hydroxyprogesterone radioimmunoassays Clin Chem, 38, 1830-1837
5 Pang S.Y, Wallace M.A, Hofman L, Thuline H.C et al (1988) Worlwide experience in newborn screening for classical congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency Pediatrics, 81, 866-874