Steroid niệu Thời gian
lưu (phút) Ion đích (m/z) Ion định lượng (m/z) Chuẩn nội 13,3 243 258 An 16,9 270 360 Et 17,1 270 360 DHEA 18,2 268 358 11 keto An 18,7 300 315 11-OH An 19,6 448 358 11-OH Et 19,8 448 358 PD 20,4 269 284 PT 20,8 435 255 A’3 21,4 432 329 THE 23,4 578 488 THF 23,9 562 472 5α-THF 24,1 562 472 α-Cortolone 24,4 449 359 β-Cortol 24,5 343 243 β-Cortolone 24,8 449 359 α-Cortol 25,1 343 243 THS* 21,8 474 564
THS là steroid có trong mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để bán định lượng THS trong mẫu thử do mẫu chuẩn khơng có nồng độ cho THS.
2.2.3. Chất liệu nghiên cứu
- Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khỏe mạnh và người bệnh nghi mắc TSTTBS, RLPTGT. Yêu cầu của mẫu nước tiểu:
Không sử dụng chất bảo quản.
Thể tích cần thiết > 3mL nước tiểụ
Bảo quản: mẫu nước tiểu sau khi lấy được bảo quản tạm thời ở 2 - 8oC tối đa được 2 tuần. Bảo quản ở -20oC đến khi phân tích (tối đa được 6 tháng).
Thời gian thu thập mẫu: 10/2015-7/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả, cắt ngang.
2.3.1. Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
2.3.1.1. Quy trình định lượng steroid niệu
Quy trình chuẩn bị mẫu được thực hiện hồn tồn thủ cơng, cải tiến dựa trên kỹ thuật của Honour JW [14]. Tổng thời gian chuẩn bị mẫu khoảng 28 giờ trước khi được bơm tự động vào máy GC/MS.
Ạ Chuẩn bị hoá chất, thuốc thử:
Pha dung dịch chuẩn steroid niệu từ dạng đông khô: thêm 15 mL nước cất vào lọ chuẩn, để ổn định 15 phút ở nhiệt độ phòng, trộn đều và chia nhỏ ra các eppendorf mỗi ống 2mL, bảo quản ở -200C.
Chuẩn bị hỗn hợp steroid tinh khiết:
Cân khoảng 8 mg mỗi loại steroid tinh khiết, ghi lại chính xác khối lượng được cân và hồ tan trong bình định mức với 100 mL methanol, thao tác trong tủ hút hóa chất. Để ở bể ấm 37oC cho tan hoàn toàn, bảo quản ở -20oC.
Chuẩn nội Androstanol: cân khoảng 10 mg chuẩn nội, hoà tan trong 100 mL methanol, thao tác thực hiện trong tủ hút hóa chất, bảo quản ở 4oC.
Vật liệu kiểm tra chất lượng (QC: Quality control): do khơng có mẫu nội kiểm thương mại trên thị trường nên chúng tôi sử dụng mẫu nội kiểm tự chuẩn bị bằng cách thu thập mẫu nước tiểu của người khỏe mạnh làm mẫu trộn bình thường và mẫu nước tiểu người bệnh mắc TSTTBS đã chẩn đoán xác định làm mẫu trộn bệnh lý. Chia nhỏ mẫu trộn bình thường và mẫu trộn bệnh lý mỗi ống 3 mL và bảo quản ở -20oC.
Vật liệu ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) của SKML (Stichting Kwaliteitsbewaking Medische Laboratoriumdiagnostiek - Nijimegen, Netherlands) trong chương trình ngoại kiểm steroid niệu quốc tế UCLH Urine Steroid Profile External Quality Assesment Scheme tổ chức bởi University College London Hospitals (London-United Kingdom), có sự tham gia của 28 phịng xét nghiệm trên thế giớị Mỗi chu kỳ ngoại kiểm có 12 mẫu dạng đơng khô: thực hiện 1 mẫu/ 1 tháng.
Đệm acetat 2M; pH 5,0 - 5,2 pha từ dung dịch acetat 2M và acid acetic 2M với thể tích nhất định. Đo pH và điều chỉnh pH đạt yêu cầu để tối ưu hoạt tính enzym thủy phân steroid liên hợp.
Methoxyamine hydrochloride trong pyridine: Cân 100 mg methoxyamine hydrochloride và hoà tan trong 3 mL pyridine để tạo dung dịch 3%. Thao tác kỹ thuật cần được thực hiện trong tủ hút hóa chất.
Ascorbate: pha 10 mg/1mL nước cất sử dụng ngay mỗi lần phân tích.
B. Các bước chuẩn bị mẫu: thuỷ phân, tách chiết steroid niệu và tạo dẫn xuất.
Cách chuẩn bị mẫu nội kiểm và ngoại kiểm, chất chuẩn, mẫu bệnh: cho vào mỗi ống thủy tinh loại 10mL đệm acetat, mẫu bệnh phẩm, chuẩn nội, enzym glucuronidase/ sulphatase, ascorbate đã pha như sau:
Thủy phân steroid liên hợp: Trộn đều các mẫu để thủy phân các steroid liên hợp bằng enzym β-glucuronidase/ arylsulfatasẹ Ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC qua đêm. Sau khi thủy phân, ly tâm mẫu 4000 rpm x 5 phút.