(LUẬN án TIẾN sĩ) đánh giá tính đa hình vùng HV1, HV2 trên DNA ty thể ở một số dân tộc và bệnh nhân ung thư vú người việt nam

T Ổ NG QUAN TÀI LI Ệ U

DNA ty thể

Ty thể là bào quan có hình trụ dài, được bao bọc bởi hai lớp màng gồm protein và phospholipid kép Bên trong chứa chất nền, DNA ty thể và ribosom Là trung tâm hô hấp của tế bào, ty thể sản sinh ATP, cung cấp năng lượng cho tế bào Đặc biệt, ty thể có hệ gen độc lập, cho phép chúng tự sinh sản qua quá trình phân đôi.

DNA ty thể có cấu trúc sợi kép, mạch vòng, không liên kết với protein histon và chiếm khoảng 5% tổng số DNA của mỗi tế bào Trình tự DNA ty thể hoàn chỉnh của con người được công bố lần đầu vào năm 1981 và đã được chỉnh sửa vào năm 1999, hiện được gọi là “trình tự chuẩn Cambridge đã chỉnh sửa - rCRS” DNA ty thể có kích thước 16.569 bp, mã hóa cho 37 gen, trong đó có 13 gen mã hóa cho chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 gen mã hóa cho RNA vận chuyển và 2 gen mã hóa cho RNA ribosom Hệ gen ty thể người khá gọn gàng, với hầu hết các gen đều tham gia vào mã hóa Vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể là vùng điều khiển D-loop, chứa hai vùng HV1 và HV2.

Hình 1 1: Sơ đồ cấu tạo chi tiết của DNA ty thể người [11]

Phân tử DNA mạch vòng, kép có kích thước 16,569 bp chứa các gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptid, 2 RNA ribosom (12S và 16S) và 22 RNA vận chuyển Vị trí của các gen này được thể hiện rõ trong hình minh họa Vùng điều khiển D-loop bao gồm các điểm khởi đầu sao chép, promoter cho chuỗi nặng và nhẹ, cùng với các vùng siêu biến HV1 và HV2.

1.1.3 Vùng HV1 và HV2 trên DNA ty th ể

Vùng điều khiển D-loop có kích thước 1121bp, nằm trong khoảng từ vị trí 16024 đến 16569, giữa hai gen tRNA cho Phenylalanin và Prolin, chiếm khoảng 7% tổng lượng DNA ty thể Vùng này chứa các trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản DNA ty thể và các đoạn điều khiển cho quá trình phiên mã của các gen chức năng Đặc biệt, đây là vùng có tần số đột biến cao nhất, với tỷ lệ đột biến cao hơn các vùng khác trong hệ gen ty thể khoảng 4,4 lần.

Trình tự hoàn chỉnh vùng điều khiển D-loop trên DNA ty thể của nhiều dân tộc khác nhau đã được công bố trên trang MITOMAP, với hàng nghìn trình tự được ghi nhận Hơn 300 trình tự của hệ gen ty thể người từ các chủng tộc khác nhau đã được nghiên cứu và đăng ký trong các ngân hàng gen quốc tế như EMBL, Genbank và DDBJ Những công bố này chỉ ra rằng có sự khác biệt đáng kể trong trình tự hệ gen ty thể, đặc biệt là vùng D-loop, giữa các chủng tộc và dân tộc khác nhau Số lượng trình tự D-loop và toàn bộ hệ gen ty thể của các cá thể người trên thế giới vẫn đang tiếp tục gia tăng.

1.1.3.2 Vùng HV1, HV2 của DNA ty thể

Năm 1981, Anderson và các cộng sự đã phát hiện hai đoạn DNA trong vùng D-loop, được gọi là vùng siêu biến 1 (HV1) và vùng siêu biến 2 (HV2) Với tần số đột biến cao và nhiều điểm đa hình, vùng HV1 đã trở thành đối tượng nghiên cứu chủ yếu trong lĩnh vực này.

Hình 1.2: Hình trình bày vị trí hai vùng HV1 và HV2 trên DNA ty thể

DNA ty thể người dài 16,569 bp, trong đó hai vùng HV1 và HV2 thường xuất hiện các đoạn lặp lại nucleotid Cytosin, gọi là đoạn poly C Cụ thể, đoạn poly C ở vùng HV1 nằm từ vị trí 16183 - 16193 và ở vùng HV2 từ vị trí 303 - 327 Trình tự mtDNA đầu tiên được công bố vào năm 1981 cho thấy đoạn poly C ở vùng HV1 bị ngắt quãng bởi nucleotid Thymin tại vị trí 16189 Tuy nhiên, nhiều trình tự DNA ty thể có đột biến T16189C, dẫn đến chuỗi có 10 nucleotid Cytosin liên tiếp Đột biến T16189C được coi là có tốc độ cao nhất trong hệ gen ty thể của con người.

Nghiên cứu chỉ ra rằng trong tế bào, tồn tại nhiều loại DNA ty thể với chiều dài và trình tự đoạn poly C khác nhau, một hiện tượng được gọi là "dị tế bào chất" đoạn poly C Tỷ lệ phần trăm các phân tử DNA ty thể với các độ dài đoạn poly C khác nhau là ổn định ở mỗi cá thể, di truyền theo dòng mẹ và được tạo mới trong quá trình phát triển.

Phân tích đa hình di truyền DNA ty thể giúp làm rõ mối quan hệ di truyền giữa các cá thể và nghiên cứu mối liên quan của DNA ty thể với các bệnh di truyền theo dòng mẹ Nhiều nghiên cứu tập trung vào tính đa hình của vùng điều khiển D-loop, cho thấy mối liên hệ giữa các bệnh và trạng thái “dị tế bào chất” ở DNA ty thể Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hai vùng HV1 và HV2 gần đây, nhưng vẫn chưa xác định được mối liên quan giữa chúng Tốc độ đột biến của hai vùng này vẫn gây tranh cãi, và do DNA ty thể không tái tổ hợp, toàn bộ phân tử DNA có một lịch sử tiến hóa chung Tuy nhiên, sự khác biệt trong tốc độ đột biến giữa HV1 và HV2 có thể phản ánh các quá trình tiến hóa khác nhau nếu đủ lớn.

Trong vùng điều khiển của DNA ty thể, có nhiều loại đột biến như thay thế, mất đoạn và thêm đoạn, nhưng phổ biến nhất là đột biến thay thế nucleotid Tốc độ đột biến cao nhất diễn ra ở vùng D-loop, đặc biệt là tại hai khu vực HV1 và HV2, và tốc độ này thay đổi tùy thuộc vào vị trí của các nucleotid Một số vị trí nucleotid trong vùng điều khiển thường xuyên bị đột biến hơn, được gọi là điểm nóng đột biến (mutational hotspots).

Nghiên cứu hệ gen ty thể và giải mã trình tự nucleotid vùng điều khiển D-loop cùng với các gen khác trong DNA ty thể đã dẫn đến việc giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của nhiều đại diện dân tộc trên thế giới Các nghiên cứu về đặc điểm và tính đa hình của vùng HV1 và HV2 sẽ cung cấp dữ liệu quan trọng cho các lĩnh vực y học, di truyền học và nhiều lĩnh vực liên quan khác.

Đặc điểm di truyền DNA ty thể

Hệ gen người bao gồm hai phần chính: hệ gen trong nhân và hệ gen ty thể Hệ gen trong nhân có nhược điểm như tần số đột biến thấp, di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua các thế hệ Ngược lại, gen ty thể có những ưu điểm nổi bật như di truyền theo dòng mẹ, tần số đột biến cao, số lượng bản sao nhiều và không tái tổ hợp, khiến DNA ty thể trở thành đối tượng nghiên cứu phổ biến trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y học và di truyền Thông tin về các trình tự nucleotid trên DNA ty thể cũng rất quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh di truyền liên quan đến ty thể.

DNA trong nhân có cấu trúc mạch thẳng không bền và dễ phân hủy, gây khó khăn trong phân tích Ngược lại, DNA ty thể có dạng mạch vòng, kích thước nhỏ và bền lâu trong các mô khó phân hủy như xương, răng và tóc, giúp việc tách chiết dễ dàng hơn, đặc biệt với mẫu bệnh phẩm cũ Đáng chú ý, 99,99% DNA ty thể ở động vật có vú được di truyền theo dòng mẹ.

Trong quá trình thụ tinh, tinh trùng chỉ cung cấp hệ gen trong nhân cho hợp tử, không đóng góp hệ gen ty thể Ty thể của tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi xâm nhập vào trứng, có thể do quá trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin.

DNA ty thể thường được truyền từ mẹ, điều này hỗ trợ nghiên cứu xác định một số bệnh di truyền theo dòng mẹ.

DNA ty thể hiếm khi xảy ra hiện tượng tái tổ hợp, do đó có thể coi rằng DNA ty thể gần như hoàn toàn giống với DNA ty thể của mẹ ban đầu.

Hệ gen ty thể có đặc điểm nổi bật như không có histon bảo vệ và phân bố gần chuỗi phosphoryl oxy hóa, dẫn đến khả năng bị đột biến cao hơn nhiều so với DNA trong nhân Các đột biến DNA ty thể thường mang tính trung tính và đặc hiệu theo quần thể, với tốc độ đột biến thay thế gấp 10-100 lần so với DNA nhân Tốc độ đột biến cao nhất xuất hiện ở các vùng điều khiển, đặc biệt là ở hai vùng HV1 và HV2 Nguyên nhân của tốc độ đột biến này có thể là do lỗi trong quá trình sao chép và sự thiếu hụt cơ chế sửa chữa sai sót như ở DNA nhân.

Ty thể là nơi diễn ra quá trình oxy hóa, sản sinh ra các chất oxy hóa mạnh như gốc tự do, gây tác động đến hệ gen của ty thể và dẫn đến các đột biến Các đột biến này có thể xảy ra ngẫu nhiên ở bất kỳ nucleotid nào trong hệ gen ty thể, bao gồm cả vùng mã hóa và không mã hóa Mỗi tế bào chứa hàng trăm đến hàng nghìn DNA ty thể, do đó, các đột biến gen ty thể có hại có thể xảy ra ở tất cả các mô, bao gồm mô sinh dưỡng và sinh dục Đột biến ở mô sinh dưỡng làm giảm sản xuất năng lượng tế bào, trong khi đột biến ở tế bào sinh dục của mẹ có thể được di truyền cho thế hệ sau, tạo ra đa hình DNA ty thể Với nhiều DNA ty thể trong mỗi tế bào, các gen bị đột biến có thể cùng tồn tại với các gen không bị đột biến, dẫn đến hiện tượng không đồng nhất DNA ty thể có thể đồng nhất khi tất cả các bản sao giống nhau, nhưng trong nhiều trường hợp, các đột biến không đồng nhất không gây ra biểu hiện lâm sàng hay hóa sinh cho đến khi đạt ngưỡng đột biến.

DNA ty thể được di truyền qua dòng mẹ, dẫn đến sự tích lũy các đột biến và phân bố theo dòng mẹ Đặc tính chọn lọc gần như vô tính giúp các dạng DNA ty thể khác nhau không bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc, từ đó trở nên phổ biến nhờ sự trôi dạt di truyền Kết quả là, tính đa hình của DNA ty thể hình thành, tạo ra các nhóm kiểu đơn có mối quan hệ với nhau, được gọi là nhóm đơn bội (Haplogroup).

Năm 1987, Cann và các đồng tác giả đã tiến hành nghiên cứu đa hình DNA ty thể bằng kỹ thuật RFLP trên 147 cá thể thuộc các chủng tộc khác nhau trên thế giới Nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu DNA ty thể đều có nguồn gốc từ một tổ tiên chung, ước tính sống cách đây khoảng 200.000 năm tại khu vực cận Sahara ở Đông Phi Từ đó, nghiên cứu về hệ gen ty thể người đã bùng nổ, được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như mối quan hệ di truyền, hình sự, pháp y và y học.

Hệ gen ty thể, mặc dù chỉ chiếm một phần nhỏ trong tổng thể hệ gen người, đã cung cấp những thông tin quan trọng về cơ chế phát sinh một số bệnh Những dữ liệu từ DNA ty thể giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

Các nghiên cứu đầu tiên về đa hình DNA ty thể người, thông qua kỹ thuật RFLP và trình tự đoạn HV1, HV2 trên vùng điều khiển D-loop, cho thấy rằng các loại DNA ty thể khác nhau có thể được phân loại thành các nhóm đơn bội dựa trên sự hiện diện hoặc vắng mặt của các băng khi cắt bằng enzym giới hạn Mỗi nhóm đơn bội sở hữu một bộ đa hình đơn nucleotid (SNP) đặc trưng Việc phân loại và sắp xếp các nhóm đơn bội không chỉ giúp phân tích dòng DNA ty thể theo phả hệ mà còn hỗ trợ trong việc xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền liên quan đến các bệnh có liên quan đến DNA ty thể.

DNA ty thể của người Phi được phân thành bốn nhóm đơn bội: L0, L1, L2 và L3, trong đó ba nhóm L0, L1, L2 chiếm 76% dân số châu Phi Tại Đông Bắc Phi, hai dòng DNA ty thể M và N xuất hiện từ nhóm L3 khoảng 65.000 năm trước, trở thành tổ tiên của tất cả các dòng DNA ty thể trên lục địa Á và Âu Ở châu Âu, nhóm L3 và N tạo thành chín nhóm đơn bội: H, I, J, K, T.

U, V, W, X Ở châu Á, hai nhóm đơn bội lớn là M và N phân ly tạo nên các nhóm đơn bội nhỏ hơn A, B, C, D, F, M, G, Z [30]

Hình 1.3 : Sơ đồ mô tả quá trình di cư của các nhóm đơn bội DNA ty thể người [30]

Phân loại DNA ty thể thành các nhóm đơn bội là một quá trình phức tạp Dưới đây là sơ đồ phân nhóm đơn bội dựa trên các đa hình đặc trưng của DNA ty thể, được công bố trong Genbase Tutorials vào tháng 7 năm 2015.

Hình 1.4 : Sơ đồ phân nhóm đơn bội mtDNA theo các vị trí đa hình đặc trưng [31]

Năm 2002, theo nghiên cứu của Yao và cộng sự, các nhóm đơn bội (Haplogroup) của các dân tộc Trung Quốc đã được phân chia dựa trên các vị trí đa hình đặc trưng trên hai vùng HV1 và HV2 Thông tin chi tiết về các nhóm đơn bội cùng với vị trí đa hình đặc trưng của chúng trên hai vùng này được trình bày trong bảng dưới đây.

B ả ng 1 1: Phân chia các nhóm đơn bộ i DNA ty th ể d ự a vào v ị trí đa hình đặc trưng trên vùng HV1 và HV2 [32]

Chú thích: 249DelA: mất A ở vị trí 249 trên vùng HV2

Ngày nay, sự phát triển của phương pháp PCR và xác định trình tự DNA tự động đã thúc đẩy nghiên cứu hệ gen ty thể Việc đọc trình tự nucleotid ở các vùng HV1, HV2 của vùng điều khiển D-loop cùng với các gen chức năng khác giúp giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của nhiều đại diện dân tộc khác nhau Điều này cung cấp dữ liệu về các bộ SNP, từ đó phân loại các nhóm đơn bội một cách chính xác và chi tiết hơn.

Nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotid

Đa hình đơn nucleotid (SNP) là biến đổi di truyền phổ biến nhất, đại diện cho sự khác biệt một nucleotid trong hệ gen người Sự khác biệt này xuất phát từ sự đa hình của các gen, dẫn đến sự khác nhau về trình tự DNA giữa các cá thể trong một loài hoặc giữa các cặp nhiễm sắc thể của một người Bộ gen người chứa khoảng 3 tỷ base, trong đó có khoảng 10 triệu vị trí base có SNPs xảy ra thường xuyên Dự án HapMap, khởi động năm 2003, nhằm xác định các mô hình biến đổi trình tự DNA trong hệ gen con người, giúp dễ dàng tra cứu thông tin HapMap hỗ trợ khám phá các biến thể DNA ảnh hưởng đến bệnh, phát triển công cụ chẩn đoán và nâng cao khả năng lựa chọn mục tiêu cho can thiệp điều trị.

Các nhà nghiên cứu hy vọng rằng việc lập bản đồ SNPs và tần số xuất hiện của chúng trong các quần thể khác nhau sẽ giúp tăng cường hiệu quả của thuốc điều trị theo từng dạng di truyền Mục tiêu chính của HapMap là sắp xếp SNPs để dễ dàng thực hiện các phân tích Các nhà di truyền đang tìm kiếm mối quan hệ giữa các SNP, tức là khi một SNP xuất hiện, sẽ có khả năng cao SNP khác cũng xuất hiện Bước tiếp theo là giải mã dữ liệu để lập bản đồ SNP và nghiên cứu mối liên hệ giữa chúng, từ đó làm sáng tỏ nguyên nhân của một số rối loạn di truyền Mặc dù sự khác biệt di truyền giữa các quần thể ở các khu vực địa lý khác nhau là rất nhỏ, vẫn có khuynh hướng di truyền thể hiện sự khác biệt giữa các nhóm tộc người Ví dụ, một nhóm SNP có thể liên kết khác nhau ở quần thể người châu Á và châu Âu Khi xem xét toàn bộ hệ gen, sự khác biệt giữa cá thể vẫn lớn hơn sự khác biệt giữa các nhóm tộc người, nhưng việc so sánh sự khác biệt giữa các chủng người vẫn hữu ích trong nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Tuy nhiên, không phải mọi người trong cùng một chủng tộc đều có chung kiểu mẫu SNP, do đó sự hiện diện hay vắng mặt của các marker di truyền là rất quan trọng.

SNP (biến thể đơn nucleotide) là hiện tượng phổ biến, xuất phát từ các đột biến điểm thay thế một cặp nucleotide Sự khác biệt giữa đột biến và SNP được xác định dựa trên tần số xuất hiện trong cộng đồng; nếu một đột biến xảy ra thường xuyên trong quần thể, nó được coi là SNP.

1% trong quần thể dân cư được xem là SNP, với gần 19 triệu SNPs trong bộ gen người theo dữ liệu NCBI tính đến tháng 6/2012 Các đa hình đơn nucleotid mang tính chủng tộc, với cùng một SNP nhưng tỷ lệ biến thể khác nhau giữa các tộc người, thậm chí có thể tồn tại hoặc không tồn tại trong bộ gen của các nhóm dân cư khác nhau.

Hình 1.5 : Mô phỏng hiện tượng đa hình đơn nucleotid [34]

Đa hình đơn nucleotid (SNP) có thể xuất hiện ở vùng mã hóa, vùng không mã hóa protein hoặc giữa hai khu vực này SNP có khả năng thay đổi mã di truyền hoặc không, với một số SNP làm thay đổi acid amin, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng protein Ngược lại, các SNP không làm thay đổi mã di truyền, được gọi là Silent SNP, không thay đổi trình tự acid amin nhưng có thể tác động đến chức năng sinh học của gen nếu nằm trong các vùng chức năng quan trọng.

Các SNP (biến thể đơn nucleotide) đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực như xác định huyết thống, điều tra tội phạm, và nghiên cứu pháp y Chúng được sử dụng để xác định mối quan hệ di truyền, xây dựng cây phát sinh tiến hóa giữa các quần thể người, và xác định các gen liên quan đến bệnh tật SNP cũng giúp theo dõi sự di truyền của bệnh và có thể là các dạng đột biến gen tạo nên sự đa dạng di truyền giữa các cá thể Ngoài ra, chúng có thể là yếu tố nguy cơ cao liên quan đến bệnh tật và phản ứng với thuốc điều trị Việc nghiên cứu SNP là rất cần thiết, vì chúng đang được áp dụng trong y học, dược học, hình sự, và nghiên cứu di truyền, tiến hóa người.

1 3.2 Đa hình trên vùng HV1 và HV2 c ủ a DNA ty th ể

Hệ gen ty thể cũng chứa các trình tự đa hình giống như hệ gen trong nhân, với sự khác biệt về chuỗi DNA giữa các cá thể, nhóm hoặc quần thể Đa hình bao gồm đa hình đơn (SNP), chuỗi lặp, thêm đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp, có thể là kết quả của tiến hóa hoặc yếu tố bên ngoài như virus hoặc chiếu xạ Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về tính đa hình gen ty thể, chủ yếu tập trung vào các SNP, đặc biệt là ở hai vùng HV1 và HV2 thuộc vùng điều khiển D-loop Các vị trí đa hình phổ biến trên vùng HV1 đã được công bố trên MITOMAP, bao gồm các vị trí 16189 (T-C) và 16192 (C-T).

16304 (T-C), trên vùng HV2 như 73(A-G), 263(A-G), 309 (thêm C), vị trí

The most common polymorphisms are nucleotide substitutions, which can occur as transitions—mutations that replace a nucleotide with another of the same purine (A-G) or pyrimidine (C-T)—or as transversions, where a purine is replaced with a pyrimidine or vice versa (A-T, C-G).

Nghiên cứu của Shamnamole K và cộng sự năm 2013 cho thấy trong tổng hợp dữ liệu DNA ty thể từ 675 quần thể với 5231 cá nhân, phần lớn các đa hình là các thay thế đồng hoán, với 4293 thay thế đồng hoán (transition) so với chỉ 575 thay thế dị hoán.

Hình 1.6: C ác biến đổi đồng hoán và dị hoán trên mtDNA [35]

The frequency of transitions, which are nucleotide substitutions involving the same purine (A-G) or pyrimidine (C-T) base, is significantly higher, with a count of 4,293, compared to transversions, which involve substitutions between purines and pyrimidines (A-T, C-G) and total only 575.

Trong những năm qua, công nghệ di truyền phân tử đã mở ra kỷ nguyên mới cho nghiên cứu mối liên quan giữa bệnh tật với tính đa hình và đột biến DNA Các chỉ thị DNA như RFLP, nhiễm sắc thể Y, DNA ty thể và SNP đã được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, dược học và y học, giúp làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh, mức độ nguy cơ và đáp ứng với điều trị Nghiên cứu gần đây cho thấy đa hình gen ty thể liên quan đến nhiều bệnh như ung thư, bệnh lão hóa và bệnh di truyền ty thể Đồng thời, nghiên cứu SNP trên DNA ty thể đã làm rõ sự khác biệt về trình tự gen, có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu lịch sử mẫu hệ con người và xác định mối quan hệ chủng tộc cũng như vùng địa lý Những khác biệt này còn cho thấy ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên đến tiến hóa của bộ gen ty thể.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng trình tự DNA ty thể của các chủng tộc khác nhau có sự khác biệt rõ rệt Do đó, DNA ty thể được xem là một công cụ quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền, tiến hóa và mối quan hệ giữa các quần thể người.

Sơ lược về bệnh ung thư vú

Tỷ lệ mắcung thư vú ở Việt Nam

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, bao gồm cả các nước phát triển và đang phát triển Tại Việt Nam, theo số liệu năm 2012, ung thư vú có tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trung bình là 29,9/100.000 dân, đứng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới Dự báo đến năm 2020, tỷ lệ này sẽ tăng lên 38,1/100.000 dân.

Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú

Cho đến nay, nhiều yếu tố nguy cơ đã được xác định là nguyên nhân gây ung thư vú, nhưng cơ chế chuyển đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư vẫn chưa được hiểu rõ Nguyên nhân có thể liên quan đến yếu tố di truyền, yếu tố môi trường, hoặc sự kết hợp của cả hai.

Theo Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, các yếu tố nguy cơ ung thư vú liên quan đến di truyền bao gồm tiền sử gia đình mắc bệnh, đột biến gen BRCA1, BRCA2, TP53, u xơ vú lành tính, và các yếu tố sinh sản như mức hormon nội sinh cao, tuổi có kinh nguyệt sớm, mãn kinh muộn, cùng tình trạng mang thai và cho con bú.

Các yếu tố nguy cơ liên quan đến môi trường và lối sống bao gồm việc sử dụng hormon sau mãn kinh, ít vận động, chế độ ăn uống nhiều chất béo và ít chất xơ, béo phì, uống rượu, hút thuốc lá và sử dụng thuốc tránh thai Ngoài ra, phơi nhiễm với phóng xạ và ô nhiễm môi trường cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú Tỉ lệ mắc và tử vong vì ung thư vú tăng theo độ tuổi, với nữ giới có nguy cơ mắc bệnh cao hơn so với nam giới.

Các xét nghiệm cận lâm sàng dùng trong chẩn đoán ung thư vú

Các xét nghiệm hiện nay dùng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư vú bao gồm kháng nguyên ung thư CA15-3, CA27-29, thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và thụ thể HER2/NEU Để sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, việc thăm khám vú lâm sàng định kỳ, chụp nhũ ảnh và siêu âm là rất cần thiết.

Tỷ lệ tử vong do ung thư vú cao chủ yếu là do bệnh thường được chẩn đoán muộn Báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2012 cho thấy nếu ung thư vú được phát hiện sớm, nguy cơ tử vong có thể giảm xuống 1/3 so với tỷ lệ mắc Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vú trong việc kéo dài sự sống cho bệnh nhân.

Biến đổi di truyền là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự phát triển của ung thư vú Ngoài các đột biến trong nhân tế bào, đột biến trên DNA ty thể, đặc biệt là ở vùng điều khiển D-loop, cũng được phát hiện ở nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vú.

Đa hình gen ty thể và mối liên quan đến bệnh

Những đặc điểm của hệ gen ty thể được công bố từ đầu những năm

Từ năm 1980 đến 1988, những đột biến đầu tiên liên quan đến bệnh lý đã được phát hiện, đặc biệt là các bệnh về DNA ty thể Bệnh này ảnh hưởng đến nhiều hệ thống trong cơ thể như thần kinh trung ương, cơ xương, tim, thận, gan, tụy, vú, tuyến nội tiết và hệ hô hấp Triệu chứng của bệnh có thể rất đa dạng, bao gồm mất kiểm soát cơ bắp, yếu cơ, đau, rối loạn tiêu hóa, bệnh tim, bệnh gan, tiểu đường, co giật, và các vấn đề về thị giác và thính giác Mặc dù các bệnh này đã được mô tả rõ ràng qua biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa sinh, nhưng việc nhận diện bệnh thường gặp khó khăn do triệu chứng rất biến đổi và khởi phát âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn trẻ nhỏ.

Hiện nay, nhờ sự tiến bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định các bệnh lý ty thể đã trở nên khả quan hơn Nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh phổ biến liên quan đến đột biến gen ở người, với tỷ lệ 12,48/100.000 cá nhân ở Đông Bắc nước Anh có bệnh DNA ty thể hoặc có nguy cơ phát triển bệnh này Hơn 250 đột biến DNA ty thể đã được phát hiện gây ra các bệnh ở người, có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc sống, từ sơ sinh đến người trưởng thành Đặc biệt, đột biến DNA ty thể được di truyền theo dòng mẹ, cho phép chẩn đoán cho nhiều thế hệ trong gia đình.

Sự tích lũy các loại oxy phản ứng (ROS) và tác nhân oxy hóa liên quan đến nhiều bệnh lý như thoái hóa thần kinh, tiểu đường, ung thư và lão hóa sớm ROS và gốc tự do gây ra đột biến gen, làm tăng sự hình thành và tích lũy đột biến DNA ty thể trong quá trình lão hóa Các loại oxy phản ứng từ ty thể kích hoạt tổn thương DNA ty thể và apoptosis, góp phần vào sự phát triển của xơ phổi, ung thư phổi và bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính.

Y học tiến hóa cho rằng các biến thể di truyền của tổ tiên đã giúp họ thích ứng với môi trường, ảnh hưởng sâu sắc đến xu hướng bệnh tật hiện nay Đột biến DNA ty thể, kết hợp với kiểm soát môi trường và lượng calo không giới hạn, dẫn đến mất cân bằng năng lượng cá nhân Mất cân bằng giữa di truyền DNA ty thể và lượng calo góp phần vào sự gia tăng các bệnh hiện đại như béo phì, đái tháo đường, bệnh thoái hóa thần kinh, bệnh tim mạch và ung thư Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đa hình gen ty thể liên quan đến các bệnh chuyển hóa và lão hóa như đái tháo đường, Alzheimer và Parkinson.

Trình tự DNA ty thể là công cụ quan trọng trong giám định gen và xác định huyết thống Các đột biến DNA ty thể gây bệnh, bao gồm đột biến điểm, mất đoạn và thêm đoạn, đã được nghiên cứu rộng rãi Những đột biến này liên quan đến các bệnh di truyền ty thể phổ biến như hội chứng Leigh, bệnh thần kinh thị giác Leber, bệnh LHON, hội chứng Kearns-Sayre, hội chứng Pearson, hội chứng MERRF và NARP.

Đa hình gen ty thể và bệnh ung thư vú

Các đột biến DNA ty thể đã được liên kết với quá trình hình thành khối u, vì tế bào cần năng lượng lớn để phát triển và tăng sinh trong điều kiện hạn chế.

Ty thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis), một quá trình sinh học thiết yếu giúp tế bào chết một cách có kiểm soát Apoptosis không chỉ quan trọng trong sự phát triển của ung thư mà còn ảnh hưởng đến cách tế bào đáp ứng với các liệu pháp chống ung thư.

DNA ty thể dễ bị tổn thương do quá trình oxy hóa, vì nó nằm gần nguồn gốc của các gốc tự do oxy (ROS), dẫn đến tỉ lệ đột biến của DNA ty thể tăng từ 10 đến 100 lần so với DNA nhân Khác với DNA nhân, DNA ty thể không có protein histon bảo vệ và có cơ chế sửa chữa DNA kém hiệu quả, làm tăng khả năng xảy ra sai sót trong quá trình sao chép Tỉ lệ đột biến ở DNA ty thể ước tính cao hơn từ 19 đến 220 lần so với gen nhân.

Trong tế bào, sự tồn tại của nhiều bản sao DNA ty thể dẫn đến hiện tượng dị tế bào chất (heteroplasmy), nơi các phân tử DNA ty thể bị đột biến có thể cùng tồn tại với các phân tử DNA bình thường Ngược lại, trong trạng thái đồng tế bào chất (homoplasmy), chỉ có một dạng DNA duy nhất hiện diện Mức độ biểu hiện bệnh của các đột biến DNA ty thể phụ thuộc vào tỷ lệ giữa DNA bị đột biến và DNA bình thường Khi tỷ lệ dị tế bào chất vượt qua ngưỡng từ 50% - 90%, tùy thuộc vào loại đột biến và mô, các triệu chứng lâm sàng sẽ xuất hiện.

Tế bào ung thư cần sản xuất lượng lớn ATP để đáp ứng nhu cầu năng lượng và tổng hợp nucleotid, lipid, protein cho sự tăng sinh nhanh chóng Ty thể cung cấp năng lượng cho tế bào thông qua hai con đường chính: phosphoryl oxy hóa (OXPHOS) và chu trình acid citric Trong đó, phosphoryl oxy hóa là nguồn năng lượng chính cho sinh vật hiếu khí, tạo ra năng lượng gấp 10 lần so với chu trình acid citric và đường phân.

Các nguyên nhân ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp năng lượng từ con đường phosphoryl oxy hóa có thể dẫn đến giảm sản xuất năng lượng, tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS), thay đổi trạng thái oxy hóa khử và mất cân bằng nội môi canxi Sự suy giảm hiệu quả của con đường này có thể gây rối loạn sinh học ty thể, làm tăng sản xuất ROS và suy giảm chức năng ty thể, dẫn đến tổn thương mtDNA và đột biến soma, từ đó làm giảm thêm chức năng của ty thể Khi chức năng ty thể giảm xuống dưới ngưỡng năng lượng sinh học của mô, các triệu chứng bệnh như thoái hóa, chuyển hóa, lão hóa và ung thư sẽ xuất hiện Trong tế bào bình thường, con đường phosphoryl oxy hóa tạo ra khoảng 90% năng lượng ATP, trong khi đường phân chỉ chiếm khoảng 10% Otto Warburg đã phát hiện rằng tế bào ung thư tiêu thụ glucose nhiều hơn và giải phóng lactat thay vì CO2, cho thấy tế bào ung thư sử dụng con đường phosphoryl oxy hóa ít hơn, với khoảng 50% ATP từ con đường này và 50% từ đường phân, hiện tượng này được gọi là “Hiệu ứng Warburg”.

Một số nghiên cứu cho thấy con đường phosphoryl oxy hóa đóng góp từ 40-80% tổng lượng ATP được tạo ra trong tế bào khi môi trường có nhiều glucose Thiếu oxy, thiếu oxy máu gián đoạn và thiếu glucose có thể khiến các tế bào ung thư chuyển sang sử dụng đường phân hoặc hô hấp không phụ thuộc glucose để sản xuất đủ ATP cần thiết.

Vai trò của các đột biến DNA ty thể trong chức năng phosphoryl oxy hóa đã được chứng minh rõ ràng, ảnh hưởng đến quá trình phát sinh ung thư và tiến triển thành ác tính Các thay đổi trong DNA ty thể, bao gồm giảm số bản sao và giảm biểu hiện gen, cũng như biến đổi hoạt tính enzym, có thể góp phần vào sự phát triển này Thiếu hụt phosphoryl hóa oxy hóa dẫn đến giảm nguồn cung cấp năng lượng và gia tăng sản sinh các loại oxy phản ứng, gây ra các đột biến và tổn thương oxy hóa cho DNA ty thể.

Giải mã toàn bộ hệ gen ty thể người đã phát hiện một số biến đổi DNA ty thể liên quan đến nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư biểu mô dạ dày, ung thư gan, ung thư tụy, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư phổi.

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình/đột biến của DNA ty thể, đặc biệt là ở vùng HV1, với bệnh ung thư vú Nghiên cứu của Tan và cộng sự đã phát hiện ra rằng 74% (14 trong số 19) khối u vú có ít nhất một đột biến mtDNA soma, với tổng cộng 27 đột biến soma được ghi nhận, trong đó 22 đột biến xảy ra tại khu vực điều khiển D-loop Dưới đây là hình ảnh minh họa cho sự phát hiện đột biến soma trong khối u vú.

Hình 1.7 : Phát hiện đột biến C16147T (trên vùng HV1 của DNA ty thể ) trong khối u vú [62]

A: phát hiện ra đột biếndị hợp tử trong khối u nl: bình thường; tu: khối u.

B: phân tích trình tự cho thấy đột biến dị hợp tử C16147T/C

Biến đổi giảm số bản sao DNA ty thể đã được xác định ở bệnh ung thư vú Nghiên cứu của Sultana và cộng sự (2012) chỉ ra rằng hai đa hình phổ biến nhất trong vùng HV1 của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú là SNP 16290insT và 16293delA, xuất hiện lần lượt trong 95% và 75% trường hợp bệnh, trong khi chỉ dưới 5% ở nhóm chứng.

Hình 1.8: Hình ảnh đa hình 16290insT và 16293delA vùng HV1 mtDNA trên bệnh nhân ung thư vú người Bangladesh [70]

Năm 2011, Chuanzhong Ye và cộng sự phát hiện đột biến tại vị trí đa hình MnlI trong vùng HV1 của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú nguyên phát, cho thấy đột biến này có thể ảnh hưởng đến sinh bệnh học của ung thư vú Nghiên cứu của Fang và cộng sự trên 104 bệnh nhân ung thư vú người Trung Quốc cho thấy haplogroup M có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn các nhóm đơn bội khác với tỷ lệ odds ratio (OR) là 1,77.

Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa đa hình đơn nucleotide (SNP) của DNA ty thể và các yếu tố trong nhân có thể góp phần vào sự hình thành khối u, với khoảng tin cậy 95% là (1,03-3,07) và giá trị p = 0,04 Đặc biệt, sự kết hợp của SNP T16362C và G16129A trong vùng HV1 ảnh hưởng đến quá trình sao chép của DNA ty thể.

Nghiên cứu của Zhu và cộng sự trên bệnh nhân ung thư vú đã phát hiện 54 đột biến trong vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể, với các đột biến ở vị trí 16293 trên vùng HV1 và ở vị trí 204, 207 trên vùng HV2 có thể gợi ý nguy cơ mắc bệnh ung thư vú Ngoài ra, 42 đột biến trong vùng D-loop của DNA ty thể cũng được tìm thấy trong các mô ung thư vú Đột biến soma của DNA ty thể đã được chứng minh xuất hiện trong nhiều loại khối u, bao gồm ung thư vú Phân tích cho thấy 30% bệnh nhân ung thư vú có đột biến soma ở vùng điều khiển D-loop của mtDNA, và sự xuất hiện của những đột biến này có liên quan đến tuổi khởi phát bệnh.

Nghiên cứu cho thấy bệnh nhân 50 tuổi có đột biến trong vùng D-loop của mtDNA (p = 0,042) có tỷ lệ sống sót thấp hơn đáng kể so với những người không có đột biến Phân tích hồi quy đa biến chỉ ra rằng đột biến trong vùng điều khiển D-loop của mtDNA là một dấu hiệu quan trọng, độc lập với các biến lâm sàng khác, và có thể được sử dụng để đánh giá tiên lượng của bệnh nhân.

Sốlượng đột biến soma trong vùng điều khiển D-loop của mtDNA là một chỉ sốtiên lượng xấu với bệnh ung thư vú [75]

Một số đặc điểm dân tộc của người Việt Nam

Việt Nam là một quốc gia đa dân tộc với 54 dân tộc anh em, trong đó dân tộc Kinh chiếm 87% dân số Các dân tộc thiểu số như Mường, Khmer, Tày, Mông và Thái có số dân trên một triệu người và phân bố rải rác trên toàn quốc Hình thái cư trú giữa các dân tộc ngày càng gia tăng, cho thấy sự hòa nhập và gắn kết trong đời sống xã hội Các dân tộc không có lãnh thổ và nền kinh tế riêng, nhưng sự thống nhất giữa các dân tộc và quốc gia đang được củng cố trên mọi mặt.

Do sự ảnh hưởng của điều kiện tự nhiên, xã hội và các chế độ áp bức trong lịch sử, trình độ phát triển kinh tế - văn hóa giữa các dân tộc Việt Nam còn chênh lệch và khác biệt Mỗi dân tộc đều có nền văn hóa cộng đồng và đời sống văn hóa mang bản sắc riêng, góp phần làm phong phú thêm nền văn hóa chung của cả dân tộc.

Dựa theo ngôn ngữ, 54 dân tộc Việt Nam được chia thành 8 nhóm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn bốn dân tộc thuộc ba nhóm ngôn ngữ khác nhau: dân tộc Kinh và Mường thuộc nhóm ngôn ngữ Việt-Mường, dân tộc Khmer thuộc nhóm ngôn ngữ Môn-Khmer, và dân tộc Chăm thuộc họ ngôn ngữ Nam Đảo Lý do lựa chọn này là vì dân tộc Kinh là dân tộc chiếm đa số, trong khi dân tộc Mường và Khmer là các dân tộc thiểu số với số dân đông đảo Đặc biệt, dân tộc Khmer và Chăm vẫn duy trì chế độ mẫu hệ trong xã hội.

Dân tộc Kinh, hay còn gọi là người Việt, là nhóm dân cư chủ yếu tại Việt Nam, với khoảng 73.594.427 người, chiếm 86,83% tổng dân số quốc gia Họ sinh sống rộng rãi trên toàn quốc, tập trung chủ yếu ở các vùng đồng bằng và thành phố lớn như Hà Nội và TP Hồ Chí Minh.

Người Kinh (người Việt) có tiếng nói và chữ viết riêng Tiếng Việt nằm trong nhóm ngôn ngữ Việt - Mường (ngữ hệ Nam Á)

Người Kinh là dân tộc chiếm đa số tại Việt Nam, nhưng ở một số tỉnh như Hòa Bình, họ lại trở thành dân tộc thiểu số, nơi người Mường chiếm khoảng 64% tổng dân số.

Theo truyền thống của người Kinh thì người đàn ông là trụ cột gia đình

Các con đều lấy họ bốvà được coi là nối nghiệp tông đường Dòng họ của bố là "họ nội" còn dòng họ bên mẹ là "họ ngoại"

Dân tộc Mường có hơn 1.200.000 người, chủ yếu sinh sống ở miền núi phía Bắc Việt Nam, với số lượng đông đảo nhất tại tỉnh Hòa Bình và các huyện miền núi của tỉnh Thanh Hóa Tại Hòa Bình, người Mường chiếm khoảng 64% tổng dân số của tỉnh.

Tiếng Mường thuộc nhóm ngôn ngữ Việt - Mường(ngữ hệ Nam Á)

Người Mường có mối quan hệ gần gũi với người Kinh, được cho là có nguồn gốc chung từ người Việt-Mường cổ Trong thời kỳ Bắc thuộc, người Mường sống ở miền núi ít bị Hán hóa, giữ gìn lối sống truyền thống Họ định canh định cư tại những vùng núi có đất sản xuất màu mỡ, nơi lúa nước là cây lương thực chủ yếu Người Mường sinh sống trong những ngôi nhà sàn, tập trung thành các làng xóm ở chân núi hoặc sườn đồi, với mỗi làng có khoảng vài chục nóc nhà gần sông suối.

Người Chăm, còn được gọi là người Chàm hay người Chiêm (Chiêm Thành), là một dân tộc từng sở hữu một quốc gia độc lập và hùng mạnh trong lịch sử Họ có nền văn hóa phát triển và là hậu duệ của cư dân nền văn hóa Sa Huỳnh từ thời kỳ đồ sắt Tại Việt Nam, người Chăm có mối liên hệ gần gũi với các dân tộc khác thuộc họ ngôn ngữ Nam Đảo như Gia Rai, Ê Đê, Ra Glai và Chu Ru.

Người Chăm là cư dân bản địa lâu đời tại khu vực duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, nơi họ đã sinh sống và phát triển văn hóa trong suốt nhiều thế kỷ.

Trải qua hàng ngàn năm và nhiều biến cố lịch sử, người Chăm không còn chỉ cư trú ở khu vực duyên hải Nam Trung Bộ mà đã phân bố rộng rãi khắp các tỉnh phía Nam Việt Nam và một số quốc gia khác Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, cộng đồng người Chăm hiện nay có sự phân bố đa dạng và phong phú.

Việt Nam có dân số khoảng 161.729 người,sống rải rác ở các tỉnh phía Nam trong đó riêng hai tỉnh Ninh Thuận và Bình Thuận chiếm khoảng trên 60%

Người Chăm ở Việt Nam được phân chia thành ba nhóm cộng đồng chính: Chăm H'roi, Chăm Ninh Thuận - Bình Thuận và Chăm Nam Bộ, dựa trên đặc điểm cư trú, tính chất tôn giáo và sắc thái văn hóa vùng miền.

Chế độ mẫu hệ và tín ngưỡng nữ thần vẫn giữ vai trò quan trọng trong văn hóa người Chăm Theo phong tục của người Chăm, con cái theo họ mẹ, với họ bên mẹ được xem là gần gũi Chỉ con gái được quyền thừa kế tài sản, trong đó con gái út nhận di sản nhà để thờ cúng tổ tiên và có trách nhiệm nuôi dưỡng cha mẹ già.

Người Khmer ở Việt Nam, hay còn gọi là Khmer Krom, là một bộ phận dân tộc Khmer sinh sống chủ yếu tại đồng bằng sông Cửu Long Mặc dù phần lớn người Khmer cư trú tại Campuchia, cộng đồng Khmer Krom vẫn giữ gìn bản sắc văn hóa và truyền thống độc đáo của mình tại Việt Nam.

Tiếng nói và chữ viết của người Khmer thuộc nhóm ngôn ngữ Môn- Khmer (ngữ hệ Nam Á)

Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, dân số người Khmer tại Việt Nam đạt 1.260.600 người, trong đó người Khmer ở Sóc Trăng chiếm 30,7% tổng dân số tỉnh này và 31,5% tổng số người Khmer trên toàn quốc.

Xã hội người Khmer vẫn còn lưu giữ nhiều tàn dư của mẫu hệ, với gia đình nhỏ thường gồm một vợ một chồng và có thể sống độc lập hoặc cùng chung với 3-4 thế hệ Hôn nhân thường do cha mẹ sắp đặt, nhưng vẫn có sự đồng thuận từ con cái, trải qua ba bước: làm mối, dạm hỏi và lễ cưới, thường diễn ra tại nhà gái Sau lễ cưới, người chồng thường sống tại nhà vợ trong một thời gian, và sau vài năm hoặc khi có con, họ sẽ ra ở riêng nhưng vẫn duy trì mối quan hệ với gia đình bên ngoại.

Tình hình nghiên cứu về DNA ty thể người Việt Nam

Nghiên cứu về hệ gen ty thể ở Việt Nam đang phát triển, nhưng việc phân tích trình tự và đa hình tại vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể vẫn còn mới mẻ Nghiên cứu đầu tiên về DNA ty thể của người Việt do Ballinger SW và cộng sự thực hiện vào năm 1992 với phương pháp PCR-RFLP, tuy nhiên, do số lượng mẫu nhỏ và không rõ nguồn gốc, kết quả thu được còn hạn chế Đến năm 1999, Ivanova và cộng sự đã nghiên cứu sự đa hình DNA ty thể của 50 người Kinh tại Hà Nội, kết luận rằng người Kinh có nguồn gốc kép từ người Trung Quốc và các nhóm quần thể người Thái - Indonesia.

Năm 2002, Oota và các tác giả khác đã công bố một nghiên cứu về đoạn HV1 thuộc vùng D-loop trên hệ gen ty thể của 35 cá thể người Việt Nam tại Hoa Kỳ Đến năm 2003, hai nhóm nghiên cứu đã ứng dụng phân tích trình tự đoạn HV1 trong giám định hài cốt liệt sỹ và nghiên cứu chỉ thị phân tử vùng D-loop trên bệnh nhân ung thư vú, phát hiện đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Năm 2006, Phan Văn Chi và cộng sự đã phát hiện một số biến đổi DNA ty thể ở người Việt Nam thuộc vùng D-loop khi nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể các tộc người Việt Nam.

Vào năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn cùng với các tác giả khác đã áp dụng phương pháp giải trình tự DNA để nghiên cứu sự đa hình kiểu đơn bội của DNA ty thể.

Nghiên cứu trên 78 cá thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Kinh, Tày, Mường đã phát hiện 1043 điểm đa hình, tương ứng với sự thay đổi nucleotid ở 176 vị trí Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã áp dụng phương pháp giải trình tự tách dòng và xác định được 14 vị trí đột biến trên vùng D-loop ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa.

Chu Văn Mẫn và cộng sự (2009) đã áp dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp với giải trình tự DNA để phát hiện đột biến A3243G ở bệnh nhân và mẹ của bệnh nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS.

Năm 2010, Phạm Hùng Vân và cộng sự đã tiến hành giải trình tự DNA ty thể trực tiếp từ máu của bệnh nhân mắc bệnh LEBER, phát hiện 9 trong số 12 ca có đột biến DNA ty thể.

Nghiên cứu về mtDNA và bệnh ty thể đã chỉ ra sự liên quan giữa đột biến mtDNA và các bệnh lý khác nhau, chẳng hạn như hội chứng MERRF và bệnh thần kinh thị giác Leber Trong một nghiên cứu cụ thể, 18 trường hợp bệnh nhân mắc bệnh thần kinh thị giác Leber được phát hiện mang đột biến mtDNA, trong đó có 14 mẫu với đột biến G11778A và 4 mẫu với đột biến T14484C Những phát hiện này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc nghiên cứu mtDNA trong việc hiểu rõ hơn về các bệnh lý liên quan đến ty thể.

9 bp trên gen ty thể trong bệnh não cơ [96]…

Mẫu giải trình tựcó điểm đột biến T14484C

Mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A

Hình 1.9: K ế t qu ả gi ả i trình t ự đượ c so sánh v ớ i trình t ự DNA ty th ể chu ẩ n c ủa ngườ i [95]

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra mối liên quan giữa DNA ty thể và bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, dữ liệu hiện có vẫn chỉ mang tính cá thể và chưa đủ độ tin cậy để đại diện cho các dân tộc Việt Nam.

Một số phương pháp phát hiện đa hình thái gen ty thể

1.9.1 K ỹ thu ậ t PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát minh vào năm 1985.

Nguyên tắc của phản ứng PCR

Phản ứng PCR dựa trên tính chất biến tính và hồi tính của DNA, cùng với nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của DNA polymerase Quá trình này sử dụng bốn loại nucleotid, mồi xuôi và mồi ngược, cùng với enzym DNA polymerase để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn.

Phản ứng PCR là một quá trình gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm ba giai đoạn chính: biến tính, bắt cặp và tổng hợp Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi DNA đôi mới tạo ra sẽ được sử dụng làm khuôn cho việc tổng hợp DNA trong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài tương ứng với khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, với hai đầu của sản phẩm được xác định bởi đầu 5’ của các đoạn gen mồi.

Số chu kỳ trong phản ứng PCR phụ thuộc vào lượng khuôn DNA ban đầu; sau mỗi chu kỳ, lượng mẫu sẽ tăng gấp đôi so với chu kỳ trước.

Sau n chu kỳ PCR, một DNA đích được nhân bản thành 2^n bản sao, cung cấp đủ lượng DNA để tách ra khi điện di và phát hiện sau khi nhuộm, giúp tạo dòng hoặc giải trình tự Trong quá trình phản ứng, ở những chu kỳ sau, lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP tự do giảm, trong khi enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR đạt kết quả tốt nhất.

1.9.2 K ỹ thu ậ t PCR - RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật đa hình độ dài các phân đoạn DNA cắt giới hạn được phát triển dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR và enzym cắt giới hạn Những đột biến gen như thay thế, mất, thêm hoặc đảo cặp nucleotid tạo ra sự khác biệt nhỏ ở DNA, khó phân biệt bằng điện di do kích thước không thay đổi đáng kể Bằng cách sử dụng enzym cắt giới hạn để chia nhỏ các đoạn DNA có kích thước tương tự thành các phân đoạn nhỏ hơn, chúng ta có thể xác định được chúng qua điện di Sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và xử lý với enzym cắt giới hạn để tạo ra các phân đoạn DNA nhỏ hơn, sau đó được điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamid Số lượng và chiều dài các đoạn DNA này sẽ giúp phát hiện các trường hợp đột biến.

Quá trình thực hiện kỹ thuật PCR-RFLP bao gồm các giai đoạn chính: đầu tiên, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuếch đại đoạn DNA cần phân tích đa hình Sau đó, đoạn DNA này được cắt bằng enzym cắt giới hạn phù hợp Cuối cùng, điện di được sử dụng để xác định sự khác biệt giữa các băng DNA và đưa ra kết luận về sự đa hình.

Kỹ thuật PCR-RFLP rất hữu ích trong việc xác định các SNP, cho phép phân biệt giữa trạng thái đồng hợp và dị hợp Kỹ thuật này được ưu tiên trong phân tích SNP nhờ vào khả năng xác định vị trí cắt đặc hiệu của enzym Tuy nhiên, nó chỉ có thể phát hiện những SNP đã biết trước và yêu cầu trình tự đặc hiệu cho enzym cắt giới hạn.

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotid trong phân tử DNA Hiện nay, có hai phương pháp chính được sử dụng: dideoxynucleotid và giải trình tự bằng máy tự động Đặc biệt, giải trình tự thế hệ mới cho phép xác định đồng thời nhiều trình tự DNA trong một lần chạy, giúp tăng hiệu suất và giảm chi phí thực hiện.

1.9.3.1 Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid

Phương pháp này do Sanger, Smith và Coulson phát hiện ra năm 1977

Nguyên lý của phương pháp này như sau: Dideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid

(dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribo không phải là nhóm hydroxyl (-OH) mà là (-H)

Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, dNTP tự do kết hợp với chuỗi đang tổng hợp qua liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat và nhóm 3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng Tuy nhiên, khi ddNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi, quá trình tổng hợp DNA sẽ dừng lại do không thể hình thành liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo.

Quy trình giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxynucleotid bao gồm các bước sau: Đầu tiên, đoạn DNA cần giải trình tự được chèn vào một vector tại vị trí đã biết Sau đó, một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector được gắn vào đầu 3’ của vector gần vị trí chèn DNA Tiếp theo, phản ứng diễn ra trong bốn ống nghiệm, mỗi ống chứa DNA polymerase, bốn loại dNTP (một trong số đó được đánh dấu phóng xạ) và một trong bốn dideoxynucleic Nồng độ ddNTP được điều chỉnh rất thấp, thường chỉ khoảng 1%, dẫn đến việc chỉ có một dideoxynucleotid gắn vào chuỗi trong quá trình tổng hợp Kết quả là mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau, với ddNTP tương ứng ở đầu 3’ Các ống phản ứng sau đó được điện di trên gel polyacrylamid để phân tách các đoạn DNA Nhờ vào dNTP được đánh dấu phóng xạ, các mạch đơn trên gel sẽ tạo ra các vạch sáng trên phim X quang Cuối cùng, tổng hợp kết quả từ cả bốn ống cho phép xác định trình tự đoạn mạch đơn mới tổng hợp và trình tự của mạch DNA khuôn.

Hình 1.10 : Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP [103]

1.9.3.2 Giải trình tự bằng máy tự động

Ngày nay, việc giải trình tự DNA đã trở nên dễ dàng hơn nhờ vào sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy này hoạt động dựa trên phương pháp Sanger được cải tiến, trong đó các ddNTP được đánh dấu bằng chất huỳnh quang với màu sắc khác nhau thay vì đánh dấu phóng xạ Điều này giúp các vạch điện di của các mạch đơn DNA phát sáng khi đi qua chùm tia sáng laser, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích kết quả.

Máy tự động giải trình tự bao gồm hai phần chính: phần điện di sử dụng gel polyacrylamid và phần phát hiện các vạch điện di.

Phần điện di polyacrylamid có thể được hình thành dưới dạng gel hoặc ống mao quản chứa gel Phần phát hiện vạch điện di sử dụng các mắt cảm quang kết hợp với một chùm tia laser chiếu qua.

Nguyên tắc hoạt động của máy điện di dựa trên việc ghi nhận sự phát sáng của các vạch điện di khi chúng đi qua chùm tia laser Mỗi vạch phát sáng sẽ tạo ra một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ, từ đó máy sẽ so sánh các đỉnh này với các màu tương ứng để phân tích trình tự DNA Các máy thế hệ mới sử dụng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, cho phép thực hiện phản ứng giải trình tự chỉ trong một ống nghiệm và điện di trên một hàng, thay vì 4 hàng như trước đây.

Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên Genbank

Phương pháp giải trình tự gen giúp phát hiện mọi loại đột biến, đặc biệt là các đột biến điểm, và được sử dụng để xác định một số SNP không có vị trí cắt của enzym giới hạn trong gen.

Hình 1.11 : Hình ảnh giải trình tự một số SNP vùng HV1 , HV2 mtDNA [104]

1.9.3.3 Giải trình tự gen thế hệ mới (next-generation sequencing -NGS)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượng nghiên cứu

- 517 người bình thường khỏe mạnh thuộc 4 dân tộc: Kinh, Mường, Chăm và Khmer: 206 mẫu người dân tộc Kinh (lấy mẫu ở Hà Nội, TP HCM),

Nghiên cứu đã tiến hành lấy mẫu từ 100 người dân tộc Mường ở Hòa Bình, 113 người dân tộc Chăm ở Bình Thuận, và 98 người dân tộc Khmer ở Sóc Trăng Mẫu máu ngoại vi được thu thập để phục vụ cho phân tích và nghiên cứu.

Tiêu chuẩn chọn mẫu: Là người bình thường, khỏe mạnh thuộc 1 trong

4 dân tộc Kinh, Mường, Chăm, Khmer (cụ thể có mẹ và bà ngoại là người cùng một dân tộc) Tình nguyện tham gia nghiên cứu

Các địa điểm lấy mẫu được chọn lựa dựa trên tỷ lệ dân số của các dân tộc Dân tộc Kinh tập trung chủ yếu ở Hà Nội và TP HCM, trong khi dân tộc Mường chiếm 64% dân số tỉnh Hòa Bình Dân tộc Chăm sống rải rác tại các tỉnh phía Nam, với Bình Thuận chiếm trên 30% Dân tộc Khmer tại Sóc Trăng chiếm 30,7% dân số toàn tỉnh và khoảng 31,5% tổng số người Khmer ở Việt Nam.

4 dân tộc Kinh, Mường, Chăm và Khmer (Phụ lục 1)

Bảo quản mẫu: mẫu máu sau khi lấy được bảo quản ở -80°C cho đến khi phân tích

Tại Bệnh viện K Trung ương, 186 bệnh nhân nữ đã được chẩn đoán xác định mắc ung thư vú thông qua kết quả giải phẫu bệnh Các trường hợp ung thư di căn từ nơi khác và bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu đã được loại trừ Mẫu máu ngoại vi của các bệnh nhân được lấy và bảo quản tại Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein, Trường Đại học Y Hà Nội cho đến khi tiến hành phân tích.

Mẫu đối chứng được chọn từ tất cả các mẫu người nữ/517 mẫu người bình thường khỏe mạnh của 4 nhóm dân tộc ở trên (có 255 mẫu nữ/517 mẫu)

Công thức tính cỡ mẫu được xác định bằng n = Z²(1-α/2)p(1-p)/d² Trong đó, n đại diện cho cỡ mẫu cần thiết cho mỗi nhóm nghiên cứu, Z là hệ số tin cậy với α = 0,05 tương ứng với độ tin cậy 95%, có giá trị Z = 1,96 Giá trị p là ước tính tỷ lệ gặp đa hình gen ty thể trong quần thể, thường được chọn là p = 0,5 Cuối cùng, d là độ chính xác tuyệt đối mong muốn, với giá trị d = 0,1 Áp dụng công thức này sẽ giúp tính toán được cỡ mẫu n cho mỗi nhóm nghiên cứu.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từnăm 2014 đến năm 2019

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa Sinh, Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Trường Đại học Y Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu

Mô tả cắt ngang, nghiên cứu bệnh có nhóm đối chứng.

Phương tiện nghiên cứu

- Ống lấy máu chống đông EDTA

- Pipet, đầu côn các loại

- Ống Eppendorf 1,5 ml và ống Facol

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA)

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy ly tâm lạnh Beckman và máy ly tâm đểbàn Eppendorf (Đức)

- Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA)

* Hóa ch ất dùng để tách chi ế t DNA (Promega, Madison, WI, USA) :

- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl với tỷ lệ 25: 24: 1

- Dung dịch chloroform: isoamyl với tỷ lệ 24 : 1

- Dung dịch hòa tan DNA để bảo quản

* Hoá ch ất để th ự c hi ệ n k ỹ thu ậ t PCR (Invitrogen, Carlsbad, California, USA):

- Gold Taq chứa: 4 loại dNTP, Taq polymerase, MgCl2

Mồi xuôi và mồi ngược:

HV1-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA AAG C -3’

HV1-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG -3’

HV2-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C -3’

HV2-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A -3’

* Hoá ch ất để điệ n di s ả n ph ẩ m PCR trên gel agarose

- Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base, boric acid và EDTA (pH 8,0)

- Thang chuẩn DNA 100 bp (Marker 100bp)

- Dung dịch ethidium bromide 10 mg/mL.

Kỹ thuật nghiên cứu

2.5.1 Tách chi ế t DNA t ừ máu ngo ạ i vi

DNA được tách chiết từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp sử dụng phenol/chloroform theo quy trình chuẩn

- Mẫu máu đông lạnh được ủở bể ổn nhiệt 37 o C trong 30 phút

- Cho 0,5 ml máu toàn phần chống đông bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 ml sau đó cho thêm vào 0,5 ml dung dịch Lysis buffer rồi để trên đá trong 10 phút.

- Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C, bỏ dịch nổi và thu cặn lặp lại quá trình này 4 lần

- Cho 0,5 ml dung dịch K vào, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở

4 o C, bỏ dịch nổi và thu cặn

- Cho 0,5 ml Lysis buffer; 12,5 àlSDS 10%; 10 àl Proteinase K; ủ ở

- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, hồn hợp được chia làm 3 phần:

 Lớp dung dịch phía trên có chứa DNA

 Lớp ở giữa là cặn tế bào

 Lớp dưới cùng là dịch chiết

Hút lấy phần dịch chứa DNA phía trên cùng và tiến hành lặp lại các bước trên một lần nữa sẽ đảm bảo không còn tạp chất trong mẫu

- Cho 0,5 ml chloroform: isoamyl, ly tâm mẫu 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa

- Tủa DNA bằng 1 ml ethanol 100%, cho thờm 50 àl sodium acetate, để lạnh ở -20 o C trong 4 giờ

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o C, bỏ dịch nổi, thu tủa

- Rửa DNA bằng ethanol 70% Tủa DNA được hoà tan bằng 50 ml nước tinh khiết hoặc TE

Phân tử DNA thu được sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang ởbước sóng 260/280 nm và điện di trên gel agarose 1,5%

+ Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 –2 thì DNA được coi là tinh sạch

+ Chất lượng của DNA tốt khi điện di cho vạch rõ nét, băng gọn

Khi phân tử DNA bị đứt gãy và lẫn nhiều protein hoặc tạp chất khác, kết quả điện di sẽ xuất hiện dưới dạng một vệt trải dài thay vì những băng gọn gàng.

* Nguyên lý đo mật độ quang học

Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại tại bước sóng 260 nm nhờ sự hiện diện của base purin và base pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm) giúp xác định nồng độ acid nucleic trong các mẫu nghiên cứu.

- Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280nm do sự hấp thụ của các acid amin nhân thơm và dị vòng, bao gồm: tyrosin, tryptophan và phenylalanin

- Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA

Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8  2 thì DNA được coi là tinh sạch

* Tiến hành đo mật độ quang học

Sử dụng 2àl DNA xỏc định nồng độ và độ tinh sạch bằng phương phỏp đo OD trên máy Nanodrop 1000.

2.5.3 Điệ n di DNA sau tách chi ế t

Nguyên lý điện di acid nucleic ở pH = 8 cho thấy acid nucleic mang điện tích âm và di chuyển về cực dương dưới tác dụng của dòng điện một chiều Các đoạn DNA với kích thước khác nhau sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau Tùy vào mục đích nghiên cứu, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để thực hiện điện di, nhưng gel agarose với nồng độ 1,5% là lựa chọn phổ biến nhất.

Bản gel điện di được nhuộm bằng ethidium bromide sẽ phát sáng

Chất lượng DNA được đánh giá qua độ rõ nét và sự gọn gàng của vạch điện di; nếu DNA tốt, vạch sẽ rõ nét và có băng gọn Ngược lại, nếu DNA bị đứt gãy hoặc lẫn nhiều protein và tạp chất, hình ảnh điện di sẽ xuất hiện dưới dạng vệt trải dài mà không tạo thành băng gọn.

Cách chuẩn bị gel agarose 1,5%

Cân 1,5 g agarose và hòa tan trong 10 mL dung dịch boric acid EDTA (TBE) Sử dụng lò vi sóng để agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 55-60 độ C trước khi đổ vào khuôn gel Đợi cho bản gel đông lại và ổn định hoàn toàn trước khi sử dụng.

- Gỡlược, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel

- Pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA)

Tiến hành kỹ thuật điện di

- Đổ bản gel agarose 1,5% với 6 hoặc 12 giếng rồi ngâm vào bểđiện di

- Nạp 5 μl sản phẩm khuếch đại PCR vào các giếng trên bản gel

- Nạp 2,5 μl Marker loại 100 bp vào 1 giếng còn lại

- Sử dụng máy điện di 80-100V (Mupid- Nhật), điện di ở hiệu điện thế 100V khoảng 30 phút

Sau khi điện di, gel được ngâm trong ethidium bromide trong 5 phút Tiếp theo, gel được rửa qua nước cất và được soi dưới đèn tử ngoại Hình ảnh được chụp dưới ánh sáng tử ngoại để nhận định và lưu trữ.

2.5.4 Ph ả n ứng PCR (polymerase chain reaction) nhân đoạ n gen HV1, HV2

Quy trình tách chiết DNA bao gồm việc kiểm tra nồng độ và độ tinh khiết, sau đó sử dụng DNA đạt yêu cầu làm khuôn mẫu để khuyếch đại đoạn gen HV1 và HV2 bằng máy PCR Eppendorf Tất cả các mẫu DNA được pha loãng đến nồng độ khoảng 40 ng/μl để tiến hành phản ứng PCR.

- Thành phần của phản ứng PCR: 10X đệm PCR; 2,5mM dNTP; mồi xuôi và ngược; 0,5unit Taq polymerase; DNA và H2O, tổng thể tớch 20àl

- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 C - 5 phút; 30 chu kỳ [94 C- 30 giây, 54 o C - 30 giây, 72 o C - 30 giây]; 72 o C - 5 phút; bảo quản mẫu ở 15 o C

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% cùng với thang chuẩn 100bp Các băng DNA được nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống EC3 Imaging Phản ứng PCR được coi là đạt yêu cầu khi chỉ có các băng DNA mong muốn xuất hiện.

1 băng duy nhất với mỗi đường chạy, băng rõ nét, kích thước so trên thang DNA chuẩn tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết

2.5.5 Gi ả i trình t ự vùng HV1 và HV2 (DNA sequencing)

- Tinh sạch DNA sử dụng Kit QIAGEN (Hilden, Germany)

Genetic sequencing was performed using the BigDye terminator sequencing method from Applied Biosystems, utilizing the ABI-PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer The obtained sequences were compared with GenBank data to identify polymorphisms.

Tinh sạch DNA (sử dụng Kit QIAGEN)

- Cho 500 àl dung dịch PB vào ống chứa 10 àl DNA, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 30 phút

- Hút hết dịch cho qua cột tinh sạch (do hãng Qiagen cung cấp)

- Quay ly tâm 10000 v/p trong 30 giây, đổ bỏ dịch ở đáy ống

- Cho tiếp 750 àl PE vào cột

- Ly tâm 10000 v/p trong 30 giây, đổ bỏ dịch phía đáy ống

- Ly tâm tiếp thêm 60 giây để loại bỏ hết dịch trong cột

- Lấy cột ra, cho vào ống eppendorf 1,5 mL

- Cho 50 àl dung dịch EB (gồm 10 mM Tris-Cl, pH 8,5)

- Đểở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm 10000 v/p trong 60 giây

- Dịch thu được ở đáy ống là dịch chứa DNA đã được tinh sạch

Quy trình thực hiện giải trình tự gen:

Thực hiện theo qui trình và sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA)

+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị master mix cho phản ứng PCR

- Chuẩn bịeffendorf 0,2ml đã đánh dấu sẵn thứ tự các mẫu

- Chuẩn bị hóa chất để thực hiện phản ứng

- Làm tan hoàn toàn hóa chất, trộn đều sau đó ly tâm nhẹ để toàn bộ dịch trên nắp ống rơi xuống

- Tiến hành pha master mix theo bảng sau:

Sản phẩm sau PCR đã được tinh sạch 1,0

- Toàn bộ khâu chuẩn bị master mix phải được thực hiện trên khay đá

- Các hóa chất phải được làm tan và trộn đều trước khi sử dụng

- Big dye 2,5X phải được bảo quản tránh ánh sáng

- Mỗi DNA thực hiện hai phản ứng với mồi xuôi và mồi ngược

+ Giai đoạn 2: Chạy PCR Sequencing

Sau khi hoàn tất việc chuẩn bị master mix cho phản ứng, hãy tiến hành ly tâm nhanh các ống PCR Điều này giúp dịch lỏng dính trên thành và nắp ống được đẩy xuống dưới, đồng thời làm tan bọt khí.

- Xếp các ống effendorf vào máy PCR

- Chọn chương trình nhiệt đã được cài đặt sẵn trong máy theo chu trình đã được tối ưu hóa.

- Kiểm tra lại toàn bộ chu trình nhiệt:

Chu trình Biến tính Bắt cặp Tổng hợp

- Ấn nút “Start” cho máy bắt đầu chạy chương trình.

- Sau khi chạy xong chương trình đưa máy về chế độ nghỉ và tắt máy

- Lấy mẫu ra khỏi máy PCR

Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng Big Dye kit sẽ được tinh sạch thông qua quy trình Big Dye termination, nhằm loại bỏ hoàn toàn lượng Big Dye thừa Sau đó, các sản phẩm này sẽ được đọc trên máy giải trình tự gen ABI 3100 vant của Applied Biosystems.

- Các nucleotid trên gen sẽ được biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với 4 mầu tương đương với 4 loại nucleotid A,T,G,C

The results of the genetic sequencing were compared and aligned with the reference sequence J01415 from GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI) to identify polymorphisms in the HV1 and HV2 regions of mitochondrial DNA.

2.5.6 P hương pháp p hân tích trình t ự đoạ n HV1 và HV2

Giải trình tự gen từ vị trí 15.974 đến 16.517 chứa trình tự vùng HV1, trong khi từ vị trí 8 đến 431 chứa trình tự vùng HV2 Vùng HV1 được xác định từ 16.024 đến 16.365, và vùng HV2 từ 73 đến 340 Mỗi mẫu được giải trình tự theo cả hai hướng (5’ và 3’) nhằm giảm thiểu nhiễu và đảm bảo xác định trình tự gen cũng như phát hiện đầy đủ các điểm đa hình.

Trình tự vùng HV1 và HV2 của mtDNA từ các mẫu nghiên cứu đã được so sánh với trình tự chuẩn Cambridge (rCRS) thông qua phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1, với dữ liệu được lấy từ ngân hàng DNA ty thể (http://mitomap.org) Bên cạnh đó, các đặc điểm đa hình của các mẫu cũng được đối chiếu với các thông tin đã được công bố trên MITOMAP, một cơ sở dữ liệu về gen ty thể ở người.

Độ đa dạng di truyền (genetic diversity) trong quần thể nghiên cứu được xác định thông qua công thức h = (1 - Σ𝑥²)n(n-1), trong đó h đại diện cho độ đa dạng di truyền, Σ𝑥² là xác suất trùng lặp ngẫu nhiên giữa hai cá thể, x là tần suất xuất hiện của haplotype, và n là số mẫu Công thức này được đề xuất bởi Fumio Tajima vào năm 1989.

2.5.7 Phân tích m ố i liên quan gi ữ a m ộ t s ố đa hình đơn nucleotid (SNP) trên vùng HV1 v ớ i b ệnh ung thư vú

Vấn đề đạo đức của đề tài

- Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu

- Các thông tin liên quan đến người tham gia nghiên cứu được đảm bảo bí mật

- Các kỹ thuật thao tác trên người tham gia nghiên cứu được đảm bảo đúng chuyên môn.

- Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học chứ không vì mục đích nào khác

- Đề tài đã được chấp thuận thông qua Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Trường Đại học Y Hà Nội.

Sơ đồ nghiên cứu

Lựa chọn mẫu nghiên cứu

- Lấy mẫu máu ngoại vi

- Tách chiết DNA từ máu toàn phần

- Tiến hành khuếch đại gen

- Điện di sản phẩm PCR

- Giải trình tự sản phẩm PCR

Phân tích kết quả giải trình tự vùng HV1 và HV2

Xác định đa hình trên vùng HV1 và HV2

So sánh kết quả với GenBank

Xác định tỷ lệ một số SNP trên vùng HV1 và HV2

Phân nhóm mtDNA theo các SNP đặc trưng trên vùng HV1 và HV2 Đánh giá một số SNP trên HV1 của mtDNA ở bệnh nhân K vú

K Ế T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

Kết quả giải trình tự gen vùng HV1, HV2 trên DNA ty thể

Bước đầu tiên trong nghiên cứu sinh học phân tử là thu nhận DNA tổng số với số lượng lớn và độ tinh khiết cao, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sau khi tách chiết và tinh sạch, các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nanodrop 1000 ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm Chỉ số A260/280 của các mẫu DNA dao động từ 1,81 đến 2,02, với nồng độ từ 37,0 ng/μl đến 295,0 ng/μl Đường biểu diễn độ hấp thụ quang của các mẫu DNA đều mượt mà, không có gãy khúc hay gập góc, với đỉnh hấp thụ tại bước sóng 260 nm.

Kết quảđiện di DNA tổng số từ các mẫu máu được thể hiện trong hình sau:

Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1,5%

Tất cả các đường chạy đều cho thấy băng DNA rõ nét và không bị đứt gãy Các mẫu DNA được tách chiết có độ tinh khiết tương đối cao và nồng độ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR.

Giếng 1, 2, 3: DNA tổng số tách từ mẫu M10, M12, M14

Giếng 4, 5, 6: DNA tổng số tách từ mẫu KN8, KN9, KN10

3.1.2 K ế t qu ả khuy ếch đại đoạ n gen HV1, HV2 c ủ a DNA ty th ể

Sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu và quy trình tối ưu để khuyếch đại hai vùng gen HV1 và HV2, sản phẩm khuyếch đại được điện di trên gel agarose 1,5% Kết quả điện di được trình bày trong hình dưới đây.

Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của vùng HV1 M: Thang chuẩn DNA 100bp; Giếng 1-11: Sản phẩm khuếch đại vùng HV1

Chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại đoạn gen 543bp từ DNA ty thể, cụ thể từ vị trí 15975-16517, bao gồm vùng siêu biến HV1 Sản phẩm PCR thu được thể hiện rõ nét và đặc hiệu ở tất cả các mẫu nghiên cứu, với chỉ một băng có kích thước tương ứng với các tính toán lý thuyết.

Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của vùng HV2 M: Thang chuẩn DNA 100bp; Giếng 1-11: Sản phẩm khuếch đại vùng HV2

Nhận xét: đã khuếch đại được một đoạn gen có kích thước 423bp (từ vị trí 8-

Vùng siêu biến HV2 của DNA ty thể (431) đã được khuếch đại thành công Ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu, rõ nét ở tất cả các mẫu nghiên cứu, với chỉ một băng có kích thước tương ứng với các tính toán lý thuyết.

3.1.3 K ế t qu ả gi ả i trình t ự vùng HV1, HV2 c ủ a DNA ty th ể trên 4 dân t ộ c Kinh, Chăm, Mường, Khmer ngườ i Vi ệ t Nam

Nghiên cứu này tiến hành giải trình tự gen sản phẩm PCR của vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể bằng máy 3100-Avant Genetic Analyzer của ABI-PRISM Kết quả được so sánh với trình tự chuẩn trên GenBank (trình tự chuẩn gen ty thể - J01415) nhằm xác định đa hình.

Kết quả giải trình tự gen hai vùng siêu biến HV1 và HV2 được trình bày qua các hình ảnh dưới đây Đặc biệt, đa hình trong vùng HV1 của DNA ty thể đã được phân tích và thể hiện rõ ràng.

Hình 3.4: Hình ảnh giải trình tự SNP C16260T và SNP T16298C trên vùng HV1 của DNA ty thể

Hình ảnh trên thể hiện đa hình đơn nucleotid (SNP) vùng HV1 của DNA ty thể, bao gồm SNP C16260T và SNP T16298C trong một mẫu nghiên cứu Đặc biệt, hình ảnh cho thấy các đỉnh tín hiệu rõ ràng, cao và không bị nhiễu, cùng với tín hiệu nền thấp.

Hình 3.5 Hình ảnh giải trình tự SNP T16189C, G16213A và SNP

T16217C trên vùng HV1 của DNA ty thể

Nhận xét: Kết quảgiải trình tự vùng HV1 thấy đa hình tại vị trí 16189 (T-C),

16213 (G-A), 16217 (T-C) của một mẫu nghiên cứu cụ thể

Hình 3.6: Hình ảnh giải trình tự SNP T16311C trên vùng HV1 của DNA ty thể

Kết quả giải trình tự vùng HV1 trong mẫu nghiên cứu này cho thấy sự đa hình tại vị trí 16311 (SNP T16311C), với hình ảnh tín hiệu các đỉnh cao, rõ ràng và không bị nhiễu.

T16311C b) Đa hình trên vùng HV2 của DNA ty thể:

Hình 3.7: Hình ảnh giải trình tự SNP T152C trên vùng HV2 của DNA ty thể

Kết quả giải trình tự SNP T152C trên vùng HV2 của DNA ty thể cho thấy tín hiệu các đỉnh cao rõ ràng, không bị nhiễu, cùng với tín hiệu đường nền thấp.

Hình 3.8: Hình ảnh giải trình tự SNP (249DelA, A263G) trên vùng HV2 của DNA ty thể

Nhận xét: Kết quả giải trình tự vùng gen ty thể HV2 ở mẫu nghiên cứu trên thấy đa hình tại vị trí 249 và 263 (SNP 249DelA và A263G)

Hình 3.9 : Hình ảnh giải trình tự SNP (A263G, 309insC, 315insC) trên vùng HV2 của DNA ty thể

Trong nghiên cứu này, việc giải trình tự vùng HV2 cho thấy sự tồn tại của đa hình tại vị trí 263 (A-G), tại vị trí 309 (thêm C) và tại vị trí 315 (thêm C).

3.1.4 Kết quả giải trình tự vùng HV1 trên DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam

Hình 3.10 : Hình ảnh giải trình tự SNP (T16140C, A16183C, T16189C) trên vùng HV1 của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú

Nhận xét: Kết quả giải trình tự vùng gen ty thể HV1 ở mẫu bệnh nhân ung thư vú ở trên thấy đa hình T16140C, A16183C, T16189C.

Hình 3.11 : Hình ảnh giải trình tự SNP (C16355T, T16362C) trên vùng HV1 của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú

Hình ảnh minh họa đa hình đơn nucleotid (SNP) vùng HV1, cụ thể là SNP C16355T và SNP T16362C, của DNA ty thể từ mẫu bệnh nhân ung thư vú Tín hiệu các đỉnh trong hình ảnh rõ ràng, cao và không bị nhiễu, trong khi tín hiệu đường nền thấp, cho thấy chất lượng phân tích tốt.

Hình 3.12 : Hình ảnh giải trình tự SNP T16362C vùng HV1 của DNA ty thể trên một bệnh nhân ung thư vú

Nhận xét: Kết quả giải trình tự vùng HV1 thấy đa hình tại vị trí 16362 (T-C) của một mẫu nghiên cứu bệnh nhân ung thư vú cụ thể.

Kết quả phân tích đa hình vùng HV1 và HV2 trên DNA ty thể

3.2.1 Đa hình vùng HV1, HV2 trên DNA ty th ể ở 4 dân t ộc ngườ i Vi ệ t Nam (Kinh, Chăm, Khmer và Mườ ng) được đố i chi ế u v ớ i trình t ự chu ẩ n

16021 CTGTTCTTTC ATGGGGAAGC AGATTTGGGT ACCACCCAAG TATTGACTCA CCCATCAACA G- A G C G TC T C

16081 ACCGCTATGT ATTTCGTACA TTACTGCCAG CCACCATGAA TATTGTACGG TACCATAAAT

16141 ACTTGACCAC CTGTAGTACA TAAAAACCCA ATCCACATCA AAACCCCCTC CCCATGCTTA

A TTCT AC C AGGG GTT C TC CA CCCATTT C TTCC G

16201 CAAGCAAGTA CAGCAATCAA CCCTCAACTA TCACACATCA ACTGCAACTC CAAAGCCACC

T G C AT CTG T TC CG CTGTG TG CTCAT CT TA TT

16261 CCTCACCCAC TAGGATACCA ACAAACCTAC CCACCCTTAA CAGTACATAG TACATAAAGC

TTC A GT CG AGA TA A G TTCGT TTTTT CCCG TG CT GA C C AT

16321 CATTTACCGT ACATAGCACA TTACAGTCAA ATCCCTTCTC GTCCCCATGG ATGACCCCCC

16381 TCAGATAGGG GTCCCTTGAC CACCATCCTC CGTGAAATCA ATATCCCGCA CAAGAGTGCT

16441 ACTCTCCTCG CTCCGGGCCC ATAACACTTG GGGGTAGCTA AAGTGAACTG TATCCGACAT

16501 CTGGTTCCTA CTTCAGGGTC ATAAAGCCTA AATAGCCCAC ACGTTCCCCT TAAATAAGAC

1 GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT

61 CGTCTGGGGG GTATGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC AACT A G C GAC A

121 GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT

181 ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA

TG A G G-C TCG GCC A G GC C A G GG G

241 ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCACTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA

301 AACCCCCCCT CCCCCGCTTC TGGCCACAGC ACTTAAACAC ATCTCTGCCA AACCCCAAAA

361 ACAAAGAACC CTAACACCAG CCTAACCAGA TTTCAAATTT TATCTTTTGG CGGTATGCAC

421 TTTTAACAGT CACCCCCCAA CTAACACATT ATTTTCCCCT CCCACTCCCA TACTACTAAT

481 CTCATCAATA CAACCCCCGC CCATCCTACC CAGCACACAC ACACCGCTGC TAACCCCATA

Hình 3.13 trình bày toàn bộ các vị trí đa hình và loại đa hình trên vùng HV1, HV2 của DNA ty thể ở bốn dân tộc Kinh, Chăm, Khmer, và Mường, người Việt Nam được đối chiếu với trình tự chuẩn.

Các vị trí đa hình trên hai vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể được so sánh với trình tự chuẩn Cambridge đã được sửa đổi Trình tự chuẩn này được đánh số vị trí ở đầu dòng và được in thường để dễ nhận diện.

Các vị trí nucleotid và các dạng thay đổi so với trình tự chuẩn được in nghiêng ngay phía dưới trình tự chuẩn, xóa nucleotid (-), thêm nucleotid (+)

Hình ảnh cho thấy sự tồn tại của nhiều dạng đa hình trong hai vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể, với 172 vị trí đa hình ở HV1 và 89 vị trí ở HV2 Đa phần là đa hình thay thế nucleotid, bên cạnh đó còn có đa hình thêm và mất nucleotid Đặc biệt, tại vị trí 16166 ở HV1 có ba loại đa hình: A16166G, A16166C và 16166DelA, trong khi vị trí 316 ở HV2 có hai loại đa hình: G316A và G316C.

B ả ng 3.1: Các d ạ ng SNP trên vùng HV1 và HV2 c ủ a DNA ty th ể ở

517 m ẫ u thu ộ c 4 dân t ộc Kinh, Mường, Khmer, Chăm ngườ i Vi ệ t Nam

Loại đa hình Vị trí

Del 16038DelA, 16166DelA, 16183DelA, 16469DelT, 16474DelG

Del 194DelC, 249DelA, 291DelA, 292DelT, 293DelT, 294DelT, 309DelC,

310DelT, 334DelT, 337DelA, 352DelA, 368DelA, 385DelA

Nucleotide polymorphisms can be categorized into several types: Transition refers to the substitution of a nucleotide with the same purine (A-G) or pyrimidine (C-T) base; Transversion involves the replacement of a purine with a pyrimidine or vice versa (A-T, C-G); C-stretch polymorphism denotes variations in repeating nucleotide sequences of cysteine; while Del indicates nucleotide deletion polymorphism and Ins represents nucleotide insertion polymorphism.

Bảng 3.1 cho thấy tính đa hình cao của hai vùng HV1 và HV2 mtDNA ở bốn dân tộc Kinh, Chăm, Mường, Khmer tại Việt Nam Các đa hình chủ yếu là thay thế nucleotid, với đa hình thay thế đồng hoán (transition) chiếm ưu thế, bao gồm thay thế cùng gốc purin (A-G) và pyrimidin (C-T) Cụ thể, vùng HV1 có 136 SNP thay thế đồng hoán và 43 SNP thay thế dị hoán, trong khi vùng HV2 ghi nhận 72 SNP thay thế đồng hoán và 11 SNP thay thế dị hoán Ngoài ra, còn có đa hình mất nucleotid (5 SNP trên vùng HV1 và 13 SNP trên vùng HV2) và đa hình thêm nucleotid (2 SNP trên vùng HV1 và 4 SNP trên vùng HV2), trong đó nucleotid thêm vào thường là C, còn nucleotid mất đi chủ yếu là A.

Như vậy, nghiên cứu đã phát hiện được 286 loại SNP, đa hình thay thế nucleotid chiếm 91,6% (262/286), đa hình thêm nucleotid chiếm 2,1% (6/286) và đa hình mất nucleotid chiếm 6,3% (18/286)

B ả ng 3.2: B ả ng các v ị trí trên vùng HV1 có nhi ều hơn mộ t lo ại đa hình

STT Vị trí trên vùng HV1 Thay đổi nucleotid

Trên vùng HV1, có 10 vị trí xuất hiện từ hai loại đa hình trở lên, trong đó có 4 vị trí với 3 loại đa hình (vị trí 16111, 16166, 16266, 16293) Điều này cho thấy đoạn DNA này có tính đa hình cao và nhiều điểm nóng đột biến.

B ả ng 3.3: B ả ng các v ị trí trên vùng HV2 có nhi ều hơn mộ t lo ại đa hình

STT Vị trí trên vùng HV2 Thay đổi nucleotid

Kết quả giải trình tự vùng HV2 DNA ty thể của 517 mẫu thuộc 4 dân tộc Kinh, Chăm, Mường và Khmer cho thấy 10 vị trí có từ hai loại đa hình trở lên Đặc biệt, vị trí 309 ghi nhận 3 loại đa hình khác nhau: 309insC, 309insCC và 309DelC.

B ả ng 3.4: Các d ạ ng SNP trên vùng HV1 c ủ a DNA ty th ể ch ỉ g ặ p ở 1 trong 4 dân t ộc Kinh, Mường, Khmer, Chăm

STT SNP chỉ gặp ở dân tộc Kinh

SNP chỉ gặp ở dân tộc Mường

SNP chỉ gặp ở dân tộc Khmer

SNP chỉ gặp ở dân tộc Chăm

Nhận xét: có 66 loại đa hình trên vùng HV1 chỉ gặp ở các mẫu thuộc 1 trong

Trong nghiên cứu về di truyền học, có 4 dân tộc chính được phân tích, trong đó dân tộc Kinh sở hữu 21 loại đa hình gen độc đáo, dân tộc Mường có 20 loại SNP riêng biệt, dân tộc Khmer có 17 loại SNP đặc trưng, và dân tộc Chăm với ít nhất 8 loại SNP chỉ gặp ở dân tộc này.

B ả ng 3.5: Các d ạ ng SNP trên vùng HV2 c ủ a DNA ty th ể ch ỉ g ặ p ở 1 trong

4 dân t ộc Kinh, Mường, Khmer, Chăm Vi ệ t Nam

STT SNP chỉ gặp ở dân tộc Kinh

SNP chỉ gặp ở dân tộc Mường

SNP chỉ gặp ở dân tộc Khmer

SNP chỉ gặp ở dân tộc Chăm

Nhận xét: có 42 loại đa hình trên vùng HV2 chỉ gặp ở các mẫu thuộc 1 trong

4 dân tộc (6 loại SNP ở dân tộc Chăm, 11 loại SNP ở dân tộc Mường, 12 loại SNP ở dân tộc Khmer, 13 loại SNP ở dân tộc Kinh)

3.2 2 Đa hình mới đượ c phát hi ệ n trên vùng HV1 và HV2 c ủ a DNA ty th ể ngườ i Vi ệ t Nam

Trong nghiên cứu 517 mẫu, chúng tôi đã kiểm tra các đa hình trên hai vùng HV1 và HV2 thông qua Mitomap (https://www.mitomap.org) và phát hiện ba SNP mới chưa được công bố Cụ thể, SNP 16038DelA (nucleotid A tại vị trí 16038 chuyển thành G hoặc T, hoặc thêm A hoặc C), SNP G16084C (nucleotid G tại vị trí 16084 chuyển thành A hoặc T, hoặc thêm G) và SNP A16515C (đã công bố trên Mitomap là 16515DelA) Hai SNP 16038DelA và G16084C được phát hiện ở dân tộc Mường, trong khi SNP A16515C xuất hiện ở dân tộc Kinh.

Hình 3.14: Hình ảnh giải trình tự SNP (16038DelA) của vùng HV1

Kết quả giải trình tự vùng HV1 của DNA ty thể trong nghiên cứu dân tộc Mường cho thấy sự tồn tại của đa hình 16038DelA, một loại đa hình mới chưa được công bố trên Mitomap Trên Mitomap, nucleotid A tại vị trí 16038 có thể chuyển đổi thành nucleotid G hoặc T, hoặc có thể thêm nucleotid A hoặc C.

Hình 3.15 : Hình ảnh giải trình tự SNP mới (G16084C) trên vùng HV1 của DNA ty thể

Kết quả giải trình tự vùng HV1 của DNA ty thể trong mẫu nghiên cứu cho thấy sự tồn tại của đa hình đơn nucleotid G16084C, đây là một dạng đa hình mới chưa được công bố trên Mitomap.

Hình 3.16 : Hình ảnh giải trình tự SNP ( A16515C) trên vùng HV1 mtDNA

Trong nghiên cứu này, phân tích vùng HV1 của DNA ty thể đã phát hiện 6 SNP (C16511A, T16512C, C16514T, A16515C, G16516A, T16519A) trong một đoạn gen ngắn Đặc biệt, SNP A16515C là một SNP mới chưa được công bố trên Mitomap.

3.2.3 Các v ị trí đa hình thườ ng g ặ p trong các m ẫ u nghiên c ứ u

Chúng tôi đã tiến hành thống kê các đa hình phổ biến trên hai vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể từ 517 mẫu nghiên cứu Bảng 3.12 dưới đây trình bày các vị trí đa hình thường gặp.

B ả ng 3.6: B ả ng m ộ t s ố v ị trí đa hình thườ ng g ặ p trên vùng HV1 và HV2

Vị trí đa hình trên HV1

Vịtrí đa hình trên HV2

Các vị trí đa hình phổ biến nhất trong vùng HV1 bao gồm C16223T (41%), T16189C (39%), G16129A và A16183C (33%) Trong khi đó, vùng HV2 ghi nhận các vị trí đa hình như 309insC (56,4%), 315insC (96,3%), A73G (99,6%) và đặc biệt là A263G, xuất hiện ở 100% các mẫu nghiên cứu.

3.2.4 T ổ ng s ố đa hình trong các mẫ u nghiên c ứ u

Sau khi kiểm tra và so sánh với trình tự chuẩn, chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết các mẫu nghiên cứu đều chứa nhiều đa hình, với 401/517 mẫu có từ 10 đa hình trở lên Mẫu có số lượng đa hình nhiều nhất ghi nhận 21 vị trí (thuộc dân tộc Chăm), trong khi mẫu ít nhất có 6 đa hình (có 8 mẫu) Số lượng đa hình này khá lớn, phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng hai vùng siêu biến HV1 và HV2 có tần số đột biến cao nhất trong hệ gen ty thể Dữ liệu về các vị trí đa hình trên hai vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể ở bốn dân tộc Kinh, Chăm, Mường, Khmer phản ánh tốc độ đột biến rất cao, đồng thời cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

Phân nhóm SNP đặc trưng vùng HV1 và HV2 (phân chia các nhóm đơn bội mtDNA theo bộ SNP đặc trưng trên vùng HV1, HV2) ở 4 dân tộc Kinh, Chăm, Mường, Khmer Việt Nam

Việc phân loại DNA ty thể thành các nhóm đơn bội (Haplogroup) cho các mẫu nghiên cứu thuộc bốn dân tộc Kinh, Mường, Chăm và Khmer là một quá trình phức tạp Do đó, nghiên cứu này sẽ tiến hành phân nhóm đơn bội DNA ty thể dựa trên các nghiên cứu gần đây trên thế giới.

Nghiên cứu về phân loại nhóm đơn bội mtDNA của các dân tộc châu Á, đặc biệt theo cách phân loại của Yao, đã thu hút sự chú ý lớn trong cộng đồng khoa học Các nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về sự đa dạng di truyền và nguồn gốc của các dân tộc trong khu vực.

Vào năm 2002, chúng tôi đã tiến hành phân nhóm đơn bội DNA ty thể của các dân tộc Việt Nam dựa trên các SNP đặc trưng ở vùng HV1 và HV2 Kết quả phân tích cho thấy các nhóm đơn bội DNA ty thể của bốn dân tộc Kinh, Chăm, Mường và Khmer được trình bày trong các bảng 3.6, 3.7, 3.8 và 3.9 Chúng tôi đã chia nhóm đơn bội dựa trên các SNP đặc trưng ở vùng HV1 và HV2, đặc biệt là ở một số mẫu nghiên cứu đại diện cho dân tộc Chăm Việt Nam.

Cham03 B5a (18) T140C , G153A, T178C, A183C, T189C, A207G, C266A, T519A 42G, A73G, G103A, A210G, A263G, 309CC, 315C, 522-523d Cham94 B5b (3) C067G, T140C, A183C, T189C, T243C, T519A A73G, A103G, T152C, T204C, A263G, 315C, 522-523d Cham52 C (1) T086C, C223T, T298C, C327T, T357C, T519A C64T, A73G, 249DelA, A263G, 309C, 315C

Kết quả giải trình tự từ các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự chuẩn, nhằm phân nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng ở hai vùng HV1 và HV2 Các SNP in đậm thể hiện những đặc điểm riêng biệt cho từng nhóm đơn bội tương ứng.

Bảng 3.6 cung cấp thông tin chi tiết về các SNP của 113 mẫu dân tộc Chăm, được phân loại thành 26 nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng ở vùng HV1 và HV2 Trong số đó, nhóm B4c, M và B5a chiếm tỷ lệ cao nhất với 14/113, 15/113 và 18/113 mẫu tương ứng Các nhóm đơn bội này phản ánh sự đa dạng di truyền trong cộng đồng dân tộc Chăm, đồng thời cũng có thể so sánh với các mẫu nghiên cứu đại diện cho dân tộc Kinh Việt Nam.

Khin19 F1c (1) C111T, G129A, C266T, T304C, T519A A73G, T152C, 249delA, A263G, 309C, 315C, 522-523d Khin75 F3a (1) T093C, T249C, T298C, C355T, T362C, G390A A73G, T152C, G207A, 249delA, A263G, 309CC, 315C

Kết quả giải trình tự các mẫu nghiên cứu đã được so sánh với trình tự chuẩn Phân nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng ở hai vùng HV1 và HV2 của mtDNA Các SNP in đậm thể hiện đặc trưng cho nhóm đơn bội tương ứng Cụ thể, mẫu từ dân tộc Kinh ở Hà Nội (Khin) và dân tộc Kinh ở TPHCM (KN) đã được phân tích.

Bảng 3.7 cung cấp chi tiết về các SNP trên mẫu dân tộc Kinh, với 206 mẫu được phân loại vào 39 nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng của vùng HV1 và HV2 Trong số đó, nhóm M7b1, B5a, và F1a là ba nhóm đơn bội chiếm tỷ lệ cao nhất, lần lượt là 20, 23 và 43 mẫu Ngoài ra, việc phân chia nhóm đơn bội cũng được thực hiện dựa trên các SNP đặc trưng trên vùng HV1, HV2 của một số mẫu nghiên cứu đại diện cho dân tộc Khmer Việt Nam.

(Số lượng mẫu) HV1(16000+) HV2

Kết quả giải trình tự từ các mẫu nghiên cứu đã được so sánh với trình tự chuẩn, giúp phân nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng ở hai vùng HV1 và HV2 Các SNP in đậm thể hiện những đặc trưng riêng của từng nhóm đơn bội, ví dụ như ở dân tộc Khmer.

Bảng 3.8 trình bày các nhóm đơn bội mtDNA đại diện cho dân tộc Khmer, được phân loại dựa trên các SNP đặc trưng của vùng HV1 và HV2 Trong tổng số 98 mẫu người dân tộc Khmer, có 20 nhóm đơn bội được xác định, trong đó nhóm B, F1a và M là ba nhóm có tỷ lệ cao nhất, lần lượt chiếm 12/98, 14/98 và 18/98 mẫu Nghiên cứu cũng chỉ ra sự phân nhóm đơn bội dựa trên các SNP đặc trưng tại vùng HV1 và HV2 của một số mẫu nghiên cứu dân tộc Mường tại Việt Nam.

M26 C (5) A182C, A183C, T189C, C223T, T298C, C327T, 469delT A73G, T146C, A237G, 249delA, A263G, C303A M74 D4 (4) C111T, T126C, T140A, T172C, A183C, T189C, C223T, T362C A73G, A263G, 309CC, 315C, 302C, 334delA M39 F1a (16) C108T, G129A, A126G, T172C, T304C A73G, 249delA, A263G, 309CC, 315C

Kết quả giải trình tự của các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự chuẩn, trong đó phân nhóm đơn bội mtDNA dựa trên các SNP đặc trưng tại hai vùng HV1 và HV2 Các SNP in đậm thể hiện những đặc trưng riêng biệt cho từng nhóm đơn bội, với M đại diện cho dân tộc Mường.

Nhận xét: bảng 3.9 là bảng chi tiết toàn bộ các SNP trên một số mẫu dân tộc Mường, các mẫu này là đại diện cho

Nghiên cứu về 100 mẫu dân tộc Mường cho thấy chúng được phân loại vào 22 haplogroups dựa trên các SNP đặc trưng vùng HV1 và HV2 Trong đó, ba nhóm đơn bội chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm B (8/100), M7b1 (10/100) và F1a (16/100).

Phân nhóm đơn bội DNA ty thể được thực hiện dựa trên các SNP đặc trưng tại vùng HV1 và HV2 của mtDNA Nghiên cứu này bao gồm 517 mẫu, trong đó có 206 mẫu từ dân tộc Kinh, 100 mẫu từ dân tộc Mường, 113 mẫu từ dân tộc Chăm và 98 mẫu từ dân tộc Khmer.

Bài nghiên cứu đã phân tích 517 mẫu từ 4 dân tộc: Kinh, Mường, Chăm và Khmer, được thể hiện qua các bảng 3.6, 3.7, 3.8 và 3.9 Những mẫu này đã được phân loại vào 50 haplogroups mtDNA Thông tin chi tiết về đa hình và phân nhóm đơn bội của các mẫu nghiên cứu được trình bày trong Phụ lục 2.

Từ kết quả chi tiết toàn bộ đa hình trên vùng HV1, HV2 của mtDNA ở

Chúng tôi đã thống kê tổng số haplotype HV1/HV2 mtDNA từ 517 mẫu nghiên cứu (Phụ lục 2) và trình bày số lượng mẫu cho từng haplotype HV1/HV2 mtDNA trong bảng 3.10 dưới đây.

B ả ng 3.11: S ố lượ ng haplotypes HV1/HV2 mtDNA c ủ a 517 m ẫ u nghiên c ứ u thu ộ c 4 dân t ộc Kinh, Chăm, Mườ ng, Khmer Vi ệ t Nam

Số mẫu/Haplotype HV1/HV2 Số lượng haplotypes Tổng số mẫu

Như vậy, kết quả giải trình tự của 517 mẫu nghiên cứu đã xác định được

Trong nghiên cứu, đã xác định được 438 haplotypes, trong đó có 393 haplotypes duy nhất tương ứng với 393 mẫu, và 45 haplotypes xuất hiện ở nhiều hơn một cá thể (từ 2 đến 6 mẫu trên 1 haplotype HV1/HV2 mtDNA) Sự đa dạng di truyền được tính toán bằng công thức h = (1 - Σ𝑥²)n(n-1) của Fumio Tajima năm 1989, cho kết quả là 99,83% Bên cạnh đó, xác suất trùng lặp ngẫu nhiên giữa hai cá thể có cùng một haplotype HV1/HV2 mtDNA là 0,37%.

Dựa vào các SNP đặc trưng trên vùng HV1, HV2 của DNA ty thể (bảng 3.6 đến bảng 3.9) chúng tôi đã phân loại được 517 mẫu nghiên cứu của

Tỷ lệ một số SNP trên vùng HV1 của DNA ty thể ở nhóm bệnh nhân bị ung thư vú và nhóm nữ bình thường

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đa hình DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư vú bằng cách giải trình tự vùng HV1 của 186 mẫu bệnh nhân Kết quả được so sánh với trình tự chuẩn trên Genbank để xác định các loại đa hình Đồng thời, chúng tôi cũng phân tích và so sánh với 255 mẫu nữ đối chứng, được chọn từ 517 mẫu người bình thường thuộc 4 dân tộc khác nhau Kết quả thống kê cho thấy có 184 loại đa hình trên vùng HV1 của 186 mẫu bệnh nhân ung thư vú, chủ yếu là đa hình thay thế nucleotid.

Mẫu có nhiều đa hình nhất là 26 đa hình, mẫu có ít đa hình nhất là 1 đa hình.

Một số loại SNP thấy hay gặp ở các mẫu nghiên cứu (bảng 3.13)

B ả ng 3.13 B ả ng t ỷ l ệ m ộ t s ố đa hình hay gặ p trên vùng HV1 c ủ a mtDNA ở b ệnh nhân ung thư vú

Loại SNP Sốlượng (n6) Tỷ lệ %

Bảng trên chỉ ra rằng có nhiều SNP phổ biến trong vùng HV1 ở bệnh nhân ung thư vú, với đa hình C16223T xuất hiện với tỷ lệ cao nhất, chiếm 45,7% (85/186 mẫu bệnh nhân).

Bi ểu đồ 3.3 T ỷ l ệ m ộ t s ố SNP trên vùng HV1 mtDNA c ủ a 2 nhóm

Các SNP T16140C, A16183C, T16189C và T16304C ít xuất hiện ở nhóm bệnh so với nhóm chứng Ngược lại, SNP T16362C có tần suất cao hơn ở nhóm bệnh Trong khi đó, SNP T16172C, G16129A và C16223T có tỷ lệ gặp gần như tương đương giữa hai nhóm bệnh và chứng.

B ả ng 3.14 T ỷ l ệ m ộ t s ố SNP trên vùng HV1 mtDNA c ủ a nhóm ung thư vú và nhóm n ữ bình thườ ng

SNP T16172C, T16189C, A16183C và C16223T có tỷ lệ cao ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng, đều vượt quá 15% Trong khi đó, SNP T16140C, A16183C và T16189C ở nhóm chứng có tỷ lệ cao hơn nhóm bệnh, với các tỷ lệ lần lượt là 13,3%, 33,3% và 40% so với 7%, 14% và 24,7% Ngược lại, SNP T16362C ở nhóm bệnh chiếm tỷ lệ cao hơn nhóm chứng, đạt 19,3% so với 11,4% Haplotype mtDNA HV1/HV2 T16140C, T16189C và haplotype A16183C, T16189C ở nhóm bệnh có tỷ lệ gặp thấp hơn nhóm chứng, với 5,4% so với 12,5% và 12,9% so với 17,6% Cuối cùng, haplotype C16223T, T16362C ở nhóm bệnh có tỷ lệ cao hơn nhóm chứng, đạt 15,6% so với 6,3%.

Tỷ lệ SNP T16362C ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng với p=0,02, OR=1,87 và 95% CI (1,1-3,18) Khi có cả hai SNP C16223T và T16362C, nguy cơ ung thư vú tăng gấp 2,759 lần, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p=0,001, 95% CI (1,45-5,25).

Nghiên cứu cho thấy rằng SNP A16183C, T16189C, hoặc sự hiện diện đồng thời của A16183C và T16189C, hoặc T16140C và T16189C có liên quan đến khả năng giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, cụ thể là p=0,0001, p=0,001, p=0,0001 và p=0,011 (bảng 3.5).

Các đa hình trong vùng HV1 của DNA ty thể có thể vừa là yếu tố nguy cơ, vừa mang ý nghĩa bảo vệ đối với bệnh ung thư vú Biểu đồ dưới đây minh họa mối quan hệ giữa các SNP vùng gen ty thể HV1 và bệnh ung thư vú.

Bi ểu đồ 3.4: Bi ể u th ị m ối tương quan giữ a SNP trên vùng HV1 c ủ a DNA ty th ể v ớ i b ệnh ung thư vú

Biểu đồ 3.4 chỉ ra rằng một số SNP và haplotype HV1/HV2 của DNA ty thể có thể ảnh hưởng đến bệnh ung thư vú Đặc biệt, SNP T16362C và haplotype C16223T có ảnh hưởng rõ rệt, trong đó SNP T16362C được xác định là yếu tố nguy cơ với tỷ lệ odds ratio (OR) lần lượt là 1,87 và 2,76 với p