Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Kỹ thuật nghiên cứu
2.5.1. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi
DNA được tách chiết từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp sử dụng phenol/chloroform theo quy trình chuẩn.
Quy trình:
- Mẫu máu đơng lạnh được ủở bể ổn nhiệt 37oC trong 30 phút.
- Cho 0,5 ml máu toàn phần chống đông bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 ml sau đó cho thêm vào 0,5 ml dung dịch Lysis buffer rồi để trên đá trong 10 phút.
- Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi và thu cặn. lặp lại quá trình này 4 lần.
- Cho 0,5 ml dung dịch K vào, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 ml Lysis buffer; 12,5 µlSDS 10%; 10 µl Proteinase K; ủ ở 56oC trong 2 3 giờ.
- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC, hồn hợp được chia làm 3 phần:
Lớp dung dịch phía trên có chứa DNA.
Lớp ở giữa là cặn tế bào.
Hút lấy phần dịch chứa DNA phía trên cùng và tiến hành lặp lại các bước trên một lần nữa sẽ đảm bảo khơng cịn tạp chất trong mẫu.
- Cho 0,5 ml chloroform: isoamyl, ly tâm mẫu 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC. Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa.
- Tủa DNA bằng 1 ml ethanol 100%, cho thêm 50 µl sodium acetate, để lạnh ở -20oC trong 4 giờ.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi, thu tủa. - Rửa DNA bằng ethanol 70%. Tủa DNA được hoà tan bằng 50 ml nước tinh khiết hoặc TE.
Phân tử DNA thu được sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang ởbước sóng 260/280 nm và điện di trên gel agarose 1,5%.
+ Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 –2 thì DNA được coi là tinh sạch.
+ Chất lượng của DNA tốt khi điện di cho vạch rõ nét, băng gọn. Ngược lại, phân tử DNA bị đứt gãy, lẫn nhiều protein hoặc các tạp chất khác thì hình ảnh điện di là một vệt trải dài không tạo thành băng gọn.