ĐẶC điểm ENZYME PEPSIN TRONG QUÁ TRÌNH TIÊU hóa của ĐỘNG vật

MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH HÌNH iv I TỔNG QUAN 1.1 DẠ DÀY VÀ SỰ TIÊU HÓA Ở DẠ DÀY 1.1.1 Cấu trúc chức dày 1.1.2 Niêm mạc dày- dịch vị dày 1.1.2.1 Niêm mạc dày 1.1.2.2 Dịch vị dày 1.1.3 Sự tiêu hóa thức ăn dày 1.2 PEPIN 1.2.1 Lịch sử Pepsin 1.2.2 Thành phần cấu trúc, cấu tạo đặc tính Pepsin 1.2.2.1 Cấu trúc 1.2.2.2 Cấu tạo 1.2.2.3 Đặc tính 1.2.3 Kích hoạt pepsin 1.2.4 Cấu trúc tinh thể pepsin 1.2.5 Hoạt động pepsin 1.2.6 Pepsin proteomics 1.2.7 Sự hoạt hóa Pepsinogen thành pepsin 1.3 ĐẶC ĐIỂM ENZYME PEPSIN TRONG Q TRÌNH TIÊU HĨA CỦA ĐỘNG VẬT II QUI TRÌNH THU DỊCH ENZYME PEPSIN 2.1 THU NHẬN DUNG DỊCH PEPSIN 2.1.1 Phương pháp chiết 2.1.2 Phương pháp tự phân 2.2 PHƯƠNG PHÁP THU PEPSIN THÔ TỪ DỊCH TRIẾT 2.2.1 Phương pháp kết tủa 2.2.1.1 Phương pháp kết tủa muối 2.2.1.2 Phương pháp kết tủa cồn hay dung môi hữu 2.2.2 Phương pháp hấp phụ 2.2.3 Phương pháp cô đặc áp suất thấp để dung dịch pepsin đậm đặc 2.3 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PEPSIN 2.3.1 Phương pháp kết tinh pepsin Northrop 2.3.2 Phương pháp qua lọc gel sephadex 2.4 QUI TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PEPSIN TỪ DẠ DÀY ĐỘNG VẬT 2.4.1 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pepsin 2.4.2 Giải thích qui trình 10 2.4.2.1 Nguyên liệu 10 2.4.2.2 Xử lý sơ 10 2.4.2.3 Trích ly 10 2.4.2.4 Lọc 10 2.4.2.5 Kết tủa enzyme 10 2.4.2.6 Ly tâm 10 2.4.2.7 Tinh 10 2.4.2.8 Sấy khô 11 2.4.2.9 Bảo quản 12 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PEPSIN .13 III 3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA PH 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MUỐI VÀ CÁC DUNG M 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT SÁT KHUẨN 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT KÌM HÃM IV ỨNG DỤNG 4.1 ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC THỰC PHẨ 4.1.1 Sản xuất m 4.1.2 Ứng dụng tron 4.2 ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC, SỨC KHỎE 19 4.3 ỨNG DỤNG TRONG CÁC LĨNH VỰC KHÁC 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể pepsin người Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pepsin Hình 4.1 Quy trình sản xuất mat 16 Hình 4.2 Quy trình sản xuất nước mắm cổ truyền 18 I TỔNG QUAN 1.1 DẠ DÀY VÀ SỰ TIÊU HÓA Ở DẠ DÀY 1.1.1 Cấu trúc chức dày Cấu trúc: Dạ dày đoạn phình ống tiêu hóa có tác dụng chứa thức ăn, nhào trộn thức ăn bao tử để thắm dịch vị Thức ăn chịu tiêu hóa enzyme tiêu hóa chứa dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn ruột non Các tuyến dày: - Tế bào niêm dịch tiết chất nhày - Tế bào tiết pepsinogen, rennin, gelatinase - Tế bào viền tiết HCl - Tế bào tiết gastrin Dạ dày sản xuất pepsin enzyme chuyên phân hủy protein Sự phân hủy chất làm giảm độ acid dày, làm thay đổi pH dày nhờ vào hoạt động phân hủy protein pepsin khối lượng thức ăn giảm, khả tiêu hóa protein tăng lên 1.1.2 Niêm mạc dày- dịch vị dày 1.1.2.1 Niêm mạc dày Niêm mạc dày lớp màng nhầy bên dày Trong niêm mạc có ống tiết chất khác nhau, người ta chia dày thành vùng: - Vùng quanh tâm vị có niêm mạc tiết nhiều chất nhầy, pepsinogen Vùng (đáy thân dày) tiết thành phần dịch vị HCL, pepsinogen enzyme tiêu hóa khác - Vùng thân dày hang vị tiết gastrin chất nhầy 1.1.2.2 Dịch vị dày Dịch vị dày dịch vị tuyến ống dày tiết Đó dịch khơng màu, khơng có mùi Trong dịch vị có chất hoạt động HCL pepsin, tỷ trọng 1,001-1,01 ngày dày tiết khoảng 1500ml dịch vị 1.1.3 Sự tiêu hóa thức ăn dày Biến đổi lí học: Thức ăn đảo trộn, làm nhuyễn nhờ phối hợp co bóp dày, với dịch vị thấm tạo thành khối nhão đẩy thức ăn xuống phần ống tiêu hóa Biến đổi hóa học: Một phần nhỏ thức ăn đucojw phân giải nhờ enzyme amylase thành đường mantose giai đoạn đầu, thức ăn chưa đucojw trộn dịch vị Sau enzyme pepsin có dịch vị phân cắt chuỗi protein dài thành chuỗi ngắn gồm 3-10 acid amin nhiều loại emzyme khác đóng vai trị khác để tiêu hóa chất 1.2 PEPIN 1.2.1 Lịch sử Pepsin Pepsin enzyme có tác dụng phân hủy protein thành peptide nhỏ Được sản xuất dày, pepsin enzyme tiêu hóa hệ thống tiêu hóa giúp tiêu hóa protein từ thức ăn Cùng với chymotripsin trypsin, pepsin đảm nhận vai trò cắt đứt liên kết acid amin, đồng thời phá vỡ cấu trúc protein thức ăn thành phần nhỏ để ruột non hấp thụ chất dinh dưỡng dễ dàng Đây enzyme cơng nhận có hoạt tính (trong q trình tiêu hóa) Tiền thân pepsin pepsinogen, acid clohidric làm cho mơi trường dày có tính aicd cho phép pepsin kích hoạt tách riêng chất xúc tác tạo thành pepsin hoạt động Năm 1836, pepsin phát nhà tế bào học, sinh lý học người Đức Theodor Schwann Về sau, nhà khoa học bắt đầu khám phá nhiều hợp chất sinh hóa mới, pepsin chất có tính acid chuyển đổi thức ăn dạng nito dựa vào hòa tan nước Năm 1982, pepsin enzyme kết tinh protein John H Northrop tinh chế dùng lọc máu, lọc nước làm mát Porcine pepsin protein chiết xuất (Gillespie 1898) Trong môi trường acid, pepsin hoạt động ổn định khoảng từ 37-42℃, hoạt động mạnh dày pH=1,5-3 Muốn bảo quản pepsin nên bảo quản nhiệt độ -80℃ đến -20℃ để ngăn chặn tự tiêu hóa 1.2.2 Thành phần cấu trúc, cấu tạo đặc tính Pepsin Pesin hoạt động dịch vị động vật có vú, chim, bị sát cá Ơe heo pepsin tập trung chủ yếu phần đáy dày, pesin heo thơ chứa pesin A, pepsin phụ B,C,D gastricsin 1.2.2.1 Cấu trúc Pepsin sợi polypeptide đơn giản cuộn lại thành hình pepsin protein vững liên kết hyro, hyrophobic, liên kết điện tử liên kết S-S 1.2.2.2 Cấu tạo Pepsin mạch polypeptide hợp thành 329 amino acid, mà đầu C alanine đầu N isoleucine Trung tâm hoạt động pepsin gồm hai nhóm cacboxyl acid glutamic, nhân thơm (phenol) tyrosin 1.2.2.3 Đặc tính Chế phẩm enzyme tồn dạng bột vơ định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, hay đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị chua, thêm lactose, glucose hay saccharose có vị (dược điểm Việt Nam) Pepsin dễ hút ẩm , tan nước cho dung dịch đục lờ, không tan cồn 95o, ester, chloroform Pepsin dạng: kết tinh thô Điểm đẳng điện pepsin gần pH=1 Pepsin thủy phân protein vùng acid rộng từ 1-4 pH hoạt động tối ưu pepsin thay đổi tùy theo chất trạng thái chất thường pH khoảng từ 1,8-2,2 Pepsin bền pH khoảng từ 4-5, vùng pH hoạt lực enzyme có phần thay đổi giảm Từ pH=5,5 trở lên, pepsin khơng hoạt động Khả hịa tan pepsin tùy thuộc vào độ tinh khiết 1.2.3 Kích hoạt pepsin Pepsin, với protease aspartic khác thường tìm thấy động vật có xương sống thực vật, chúng tổng hợp dạng zymogen bất hoạt Đối với pepsin, zymogen pepsinogen Pepsinogen có cấu trúc giống pepsin cộng thêm 44 phân đoạn dư đầu N protein 44 phân đoạn dư thường gọi propeptide pepsinogen thường gọi proenzyme (Davies 1990) Peptide pepsinogen chứa gốc lysine, gốc arginine hai gốc histidine tạo nên peptit Propeptit tạo thành vòng xoắn cấu trúc ổn định lực tĩnh điện sáu số chuỗi bên tạo thành ion cặp với chuỗi bên cacboxylate pepsin (Perlmann 1963) Propeptit ức chế hoạt động enzym đoạn ngăn cản khả tiếp cận chất xúc tác aspartates vị trí hoạt động Việc loại bỏ propeptit dẫn đến việc kích hoạt pepsinogen thành pepsin (James Sielecki 1986) Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin cho xảy thông qua hai đường dẫn, theo quy trình bước theo cách Trong phản ứng nội phân tử pepsinogen tự phân cắt để tạo thành pepsin hoạt động, trong phản ứng liên phân tử pepsinogen bị phân cắt phân tử pepsinogen khác, dạng trung gian pepsin hoạt động phân tử 1.2.4 Cấu trúc tinh thể pepsin Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể pepsin người Phần thừa lại Asp xúc tác, Asp32 Asp215, đánh dấu màu xanh lam pepstatin (chất ức chế pepsin) đánh dấu màu đỏ Protein chia thành ba vùng (James Sielecki 1986) Vùng bao gồm β đối song song sáu sợi Liên miền tạo thành xương sống cấu trúc nằm sau vùng vị trí xúc tác Các hai miền khác bao gồm hai thùy Một thùy đầu cuối N bao gồm 142 phần dư thùy lại đầu cuối C bao gồm 123 phần dư Cho dù dạng tương tự trình tự axit amin chúng, vùng đầu N vùng đầu C không giống cấu trúc bậc hai bậc ba chúng (Sielecki, Fedorov et al 1990) Vị trí xúc tác pepsin đánh dấu hai gốc axit aspartic, Asp32 Asp215 Có phần dư Asp nằm miền đầu cuối N đầu cuối C Hai gốc Asp nằm cuối miền kết nối với thông qua mạng lưới liên kết hydro 1.2.5 Hoạt động pepsin Pepsin loại enzyme có hoạt tính phụ thuộc nhiều vào độ pH Pepsin có hoạt động enzym tối ưu độ pH từ 1,8 đến 2,0 Nó ổn định hoạt động cao, pH giảm xuống thấp tới 1,0 (Ryle 1970) Pepsin bắt đầu hoạt động xung quanh pH (Smith 1991) trở nên không hoạt động đảo ngược pH khoảng Tuy nhiên, nồng độ pepsin cao không hoạt động độ pH khoảng (Jones Landon 2002) Hoạt động pepsin phụ thuộc vào tỷ lệ emzyme so với protein Tỷ lệ cao enzyme hoạt động hiệu (Wu, Kaveti et al Năm 2006) 1.2.6 Pepsin proteomics Pepsin cơng cụ hữu ích cho proteomics Pepsin có tính đặc hiệu cho thường phân cắt sau phần dư kỵ nước cồng kềnh (Fruton 1970; Ryle 1970) Do tính đặc hiệu rộng, pepsin tạo nhiều peptit trình tiêu hóa Nhiều vị trí phân cắt có nghĩa peptit tạo thường nhỏ, chiều dài khoảng đến 30 phần dư Các peptit thường chồng lên hữu ích cho việc xếp protein Mặc dù tính đặc hiệu rộng nó, pepsin enzyme tái sản xuất, có nghĩa tạo peptit giống tiêu hóa protein thực điều kiện giống hệt (Zhang Smith 1993) 1.2.7 Sự hoạt hóa Pepsinogen thành pepsin Như khái niệm trước đó, enzyme biết chất để xúc tác phản ứng nhiều thể sống, xét chất enzym protein Chúng tổng hợp dạng bất hoạt phù hợp nhằm mục đích dự trữ vận chuyển từ vị trí tổng hợp đến vị trí hoạt động mong muốn trường hợp pepsin, chymotrypsin, trypsin carboxypeptidase Những enzym thủy phân hoạt động hoàn theo hai đường chủ yếu tự hoạt hóa trường hợp pepsin trypsin nhóm enzym thứ hai, loại exopeptidase, yêu cầu vài ion kim loại riêng biệt để hoạt hóa Việc phân tích dung dịch chứa enzym ion kim loại tiêu chuẩn để xác định ion kim loại cần thiết enzym tế bào sống nói chung Pepsinogen: Pepsinogen khám phá Langley Nằm vị trí màng nhầy dày động vật, có tế bào chứa zymogen hay pepsinogen (chính dạng tiền pepsin khơng hoạt động) Phần mơn vị heo bao tử gồm có tế bào đỉnh vách, có khả tiết acid HCl Chính acid dẫn đến tiết pepsinogen chuyển hóa việc tự hoạt hóa để thành pepsin với nồng độ acid tự nhiên mơi trường dày Q trình xảy pH nhỏ Khi môi trường có pH cao hơn, có khả xảy kết hợp ngược lại Phân tử pepsinogen heo có trọng lượng rơi vào khoảng 42.000 pepsin heo khoảng 35.000Da Theo Oke Khovitch phân tử pepsinogen có trọng lượng = 42.240Da, trọng lượng phân tử pepsin = 39.930Da Sự hoạt hóa pepsinogen: enzym buộc phải hình thành bên tế bào, kiểm soát bên ngồi, khơng xử lý tức protein tế bào Để loại bỏ vấn đề này, pepsin nhiều enzym phân cắt khác tạo dạng bất hoạt “proenzym” từ hoạt động an tồn bên ngồi tế bào Pepsin tiết dạng tiền pepsin, pepsinogen bất hoạt Khi chúng tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên bao tử pepsin, pepsinogen hoạt hóa thành pepsin Q trình hoạt hóa pepsinogen q trình thủy phân liên kết peptide acid glutamic 41 izoleucin 42, giải phóng peptide kìm hãm, thành phần amino acid peptide kìm hãm tương ứng 41 amino acid pepsinogen (Koen et al., 1968) phản ứng xúc tác ion H* pepsin Pepsin tạo thành lại tiếp tục xúc tác q trình giải phóng peptide kìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động Vì trình mang tính chất q trình tự xúc tác Sự hoạt hóa pepsinogen xảy mơi trường acid có pH5,6 peptide kìm hãm lại kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp không hoạt động 1.3 ĐẶC ĐIỂM ENZYME PEPSIN TRONG Q TRÌNH TIÊU HĨA CỦA ĐỘNG VẬT Pepsin: động vật hoạt động ăn diễn nhiều, thể động vật phải đòi hỏi lượng enzym tiêu hóa thân nhiều lúc bình thường Hệ thống tiêu hóa ln chứa lượng enzym ổn định bền vững chúng sinh để xử lý thực phẩm giàu dinh dưỡng phá vỡ chúng thành mảnh nhỏ Sau đó, peptidase protease khác đường tiêu hóa hồn thành cơng việc Pepsin enzym chuỗi enzym phân giải protein Những phân tử nhỏ amino acid, dipeptide sau tế bào hấp thu sử dụng dạng trao đổi chất tham gia vào cấu trúc protein cho cấu tạo thể Pepsin enzyme có vai trị quan trọng tuyến tiêu hóa Pepsin tồn hoạt động dịch vị động vật có vú, chim bị sát, cá Ở lồi heo, enzyme tập trung tế bào vị trí đáy bao tử Cịn động vật có vú, khu vực màng nhầy bao tử có tế bào tập trung chứa zymogen hay pepsinogen Khi tiết ra, enzyme dạng tiền enzym không hoạt động gọi pepsinogen II QUI TRÌNH THU DỊCH ENZYME PEPSIN 2.1 THU NHẬN DUNG DỊCH PEPSIN Bản chất thực trình lấy pepsin từ màng nhầy dày phối hợp ba trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa cuối chiết tách enzyme Việc làm pepsin có hai phương pháp phương pháp chiết tự phân, chúng dựa ngun tắc: pepsin phóng thích từ màng nhầy dày động vật cách chiết dung dịch acid loãng (Konne and Muraviep, 1960) dựa tự phân môi trường acid (Covalenco, 1966) Việc tiến hành so sánh thu nhận pepsin hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu trích thu enzym cao phương pháp chiết từ 57 lần (Teply et al., 1980) Nguyên nhân phương pháp tự phân có phá vỡ cách triệt để cấu trúc tế bào.Ở khía cạnh khác, phương pháp tự phân cịn có ưu điểm với pepsin, cịn trích thu pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein dày sản xuất 2.1.1 Phương pháp chiết Dạ dày rửa sạch, tách lớp màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol hay glycerin, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa etanol để pepsin kết tủa Thời gian ngâm: 48-72 giờ, nhiệt độ thường 2.1.2 Phương pháp tự phân Niêm mạc dày tiến hành bảo quản nhiệt độ lạnh vừa tách khỏi heo mổ, xay nát nhỏ, dùng HCI hay HPO với nồng độ thích hợp để chiết xuất hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Theo nhiều thực nghiệm diễn ra, việc dùng HCI để điều chỉnh pH môi trường cho hoạt tính tốt Nguyên nhân nằm HCI acid vơ quan trọng có thành phần dịch vị dày động vật, thể sống pepsinogen hoạt hóa thành pepsin nhờ HCI dịch vị Thời gian tự phân: 48 40-42°C 2.2 PHƯƠNG PHÁP THU PEPSIN THÔ TỪ DỊCH TRIẾT 2.2.1 Phương pháp kết tủa 2.2.1.1 Phương pháp kết tủa muối Khi nồng độ cao muối trung tính kết tủa thuận nghịch enzym e mà khơng gây biến tính hay giảm hoạt tính chúng Các protein khác có tính hịa tan khác dung dịch Do tăng dần nồng độ muối lên, protein riêng biệt kết tủa theo thứ tự khác Thường dùng muối trung tính khác (NH,)2SO4, NaCl nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin lại Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược lactose, glucose hay tinh bột chất phụ gia có tính chất ổn định enzyme, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế giảm hoạt tính enzym sấy Thường sấy nhiệt độ ≤ 45°C hay sấy kèm chân không 2.2.1.2 Phương pháp kết tủa cồn hay dung mơi hữu Có thể tủa cồn cao độ dung môi hữu thích hợp như: metylic, etylic, aceton nhiệt độ gần 0-3°C Với pepsin, dung dịch pepsin thô cô đặc áp suất thấp, nhiệt độ < 45°C lại 1/8 thể tích ban đầu đem kết tủa với cồn 95° aceton (tỷ lệ 1:3) Sau ly tâm sấy nhiệt độ < 45°C Để giữ hay đảm bảo hoạt tính enzyme phương pháp tủa cần thực – 5oC 2.2.2 Phương pháp hấp phụ Có thể dùng số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym như: caolin, oxyd sắt, than, Sau đó, dùng chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym khỏi chất hấp phụ thu nhận enzym mong muốn 2.2.3 Phương pháp cô đặc áp suất thấp để dung dịch pepsin đậm đặc Tiến hành nhiệt độ ≤45°C điều kiện áp suất thấp để giúp enzym không bị giảm hoạt tính giúp tạo dung dịch pepsin thơ đậm đặc, sau trộn với tá dược lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng bột khô 2.3 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PEPSIN 2.3.1 Phương pháp kết tinh pepsin Northrop Dung dịch pepsin cho kết tủa dung dịch sulfuric với MgSO bán bão hòa, chất kết tủa rửa với dung dịch MgSO hòa tan dung dịch NaOH N/2, lại cho kết tủa lần cách thêm H2SO4 N/2 Kết tủa giữ yên vài nhiệt độ 0°C, hòa tan NaOH N/2 pha loãng nước 45°C làm lạnh Tinh thể pepsin xuất phải qua loạt quy trình hịa tan kiềm tái kết tủa acid điều chế tinh thể pepsin tinh khiết hoạt tính cao 2.3.2 Phương pháp qua lọc gel sephadex Cho hỗn hợp enzyme chảy qua cột chứa gel sephadex trương nước, theo chế phân tử lớn khơng lẫn hay hịa trộn với hạt gel mà di động ngồi gel, di chuyển khỏi cột sephadex nhanh.Và phân tử nhỏ chui vào hạt với mức độ khác tùy theo kích thước chúng Do kỹ thuật dừng dể tách chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng lớn khỏi cột nhanh, phân tử lượng nhỏ chậm 2.4 QUI TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PEPSIN TỪ DẠ DÀY ĐỘNG VẬT 2.4.1 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pepsin Dạ dày Xử lý sơ Trích ly Lọc Bã Dịch enzyme NaCl 25% Kết tủa Ly tâm Tinh Sấy khô Bảo quản Sản phẩm Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pepsin 2.4.2 Giải thích qui trình 2.4.2.1 Ngun liệu Tiến hành lấy nguyên liệu dày heo vừa giết mổ, bảo quản lạnh đông nhiệt độ < -18oC 2.4.2.2 Xử lý sơ + Tách màng nhầy: rửa dày heo nước lạnh, tách lấy màng nhầy, thao tác cần nhẹ nhàng + Xay nhuyễn: Màng nhầy dày sau tách, đem cắt nhỏ tiến hành xay nhuyễn 2.4.2.3 Trích ly Phương pháp tự phân: Sau xay nhuyễn trộn trộn với HCl nồng độ 0,5% (tỉ lệ 1:2) nhiệt độ 40-50°C đến ngày Phương pháp chiết: Sử dụng dung dịch hữu muối có pH thấp, điều chỉnh pH=4 sau thêm NaC6H5CO2 1% để tránh hỏng trích ly 40-50°C đến ngày tùy độ đậm đặc dung dịch 2.4.2.4 Lọc Sử dụng vải giấy lọc đạt yêu cầu tiến hành lọc thu dung dịch enzym 2.4.2.5 Kết tủa enzyme Phương pháp tủa muối: Ta dùng muối NaCl 25% để làm tủa lắng pepsin Cho muối vào dịch enzyme, khuấy nhẹ hịa tan hồn tồn vào nhau, để yên khoảng 30 phút để dịch hoạt động thủy phân Phương pháp tủa cồn hay dung môi hữu cơ: Tiến hành làm lạnh dung dịch enzyme sau cho từ từ cồn hay dung mơi hữu vào khuấy liên tục 5-10 phút 2.4.2.6 Ly tâm Dung dịch thô ly tâm 5000 đến 6000 vòng/phút thời gian 10-15 phút 2.4.2.7 Tinh Phương pháp sắc ký cột lọc gel sephadex: ta dùng gel sephadex G-100 Trên nguyên tắc: Những chất có phân tử lượng nhỏ lọt vào bên lỗ gel, chúng di chuyển chậm qua cột Cịn chất có phân tử lượng lớn giải phóng khỏi cột trước Sau đó, chất có phần tử lượng nhỏ theo sau 10 Gel sephadex G-100 sau ngâm NaNO3 ngày đem rửa tiến hành nhồi cột có đường kính 1,8 cm, cao 80 cm • Kỹ thuật nhồi cột: - Cột sau rửa (rửa cột để đổ gel): cột rửa HNO, 50% rửa lại nước cất nhiều lần, tráng aceton, đem sấy khô - Rửa dụng cụ khác: ống nghiệm rửa ngâm vào dung dịch sulfocromic ngày, rửa lại, tráng nước cất vừa sấy khô - Tiến hành nhồi cột với G-100 trương nở hoàn toàn: gel đưa vào cột với dung dịch đệm qua phễu cách từ từ tránh tạo bọt khí phân lớp Sau cho gel vào cột gel lắng thành lớp cao khoảng 5cm mở khóa cho dung dịch đệm chảy từ từ Sau tiếp tục cho gel vào cột đạt đến độ cao cần thiết Bề mặt dung dịch bên cột phải phẳng, mặt gel ln có lớp dung dịch đệm cao khoảng 2cm để gel khơng bị khơ Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định giờ, sau rửa cột dung dịch đệm pH = 2,2 khoảng 24 (thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng ba lần thể tích cột) • Đưa mẫu vào cột: Đem kết tủa 50ml dung dịch enzyme thu sau trình tự phân qua lọc 283ml cồn tuyệt đối (nồng độ cồn hỗn hợp khoảng 85%) Sau xử ly tâm, kết tủa hòa tan lại 50ml dung dịch đệm pH 2,2 ta dung dịch A - Hút 3ml dung dịch A, thêm vào 2ml dung dịch đệm pH 2,2; đem ly tâm bỏ cặn • Ngưng khóa dịng dung dịch đệm chảy qua cột, lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt gel cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột 5ml (từ 1-5% thể tích cột) Thu mẫu qua cột: Sau mẫu vào hết cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột 2.4.2.8 Sấy khô Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa Nước chuyển từ dạng rắn qua dạng khí Nhờ nước loại bỏ khỏi dung dịch Dạng rắn lỏng dung dịch tồn lúc ngừng trình làm lạnh Sau tiến hành sấy mơi trường chân không nhiệt độ - 40°C để thăng hoa trạng thái lạnh nước nguyên liệu Sau để thu sản phẩm có độ ẩm đạt yêu cầu ta tiến hành sấy chân không nhiệt độ thấp 11 2.4.2.9 Bảo quản Pepsins cần bảo quản nhiệt độ thấp (từ -80 °C -20 °C) điều kiện khơ, kín, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng tác nhân lý, hóa học có ảnh hưởng đến họat tính enzym 12 III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PEPSIN 3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA PH Khoảng hoạt động vùng pH từ 1-4, khoảnh pH thích hợp pepsin từ 1,5- 2,4 Và tùy theo chất mà khoảng pH tối ưu thay đổi hemolobin 2,2 Còn chất albumin 1,5 Pepsin bền vững vùng pH acid độ bền tối đa pH = – hoạt lực enzym thấp Enzyme pepsin không hoạt động pH > 5,5 liên kết hydro biến đổi Ở pH thấp pepsin xảy tượng tự phân Pepsin bị vô hoạt mơi trường kiềm, phục hồi hoạt tính phần đưa pH vùng thích hợp với Ảnh hưởng pH lên loại pepsin khác Đối với pepsin có nguồn gốc khác hay loại pepsin có nguồn gốc, pH tối thích cho chúng hoạt động khác 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ Đa số enzyme hoạt động tốt nhiệt độ 30 – 40oC Một số enzyme chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao tới 70oC Khi nhiệt độ 90oC, enzyme ngừng hoạt động Pepsin enzyme hoạt động nhiệt độ cao: + Nhiệt độ tối ưu để hoạt động từ 40 – 50oC + Ở 70oC, pepsin khả tiêu đạm Tốc độ xúc tác phản ứng thủy phân pepsin không cao protease khác độ bền nhiệt pepsin cao hơn, chất có mặt số ion kim loại đặc biệt Ca2+ 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MUỐI VÀ CÁC DUNG MÔI HỮU CƠ Tùy theo chất hóa học muối mà ảnh hưởng nhiều đến hoạt động tính xúc tác pepsin Các chất hữu kiềm hay dung dịch muối kiềm NaHCO làm chậm pepton hóa pepsin Trong pepton hóa, HCl acid gây thủy phân mạnh nhất, kế HNO3, HBr, H2SO4, H3PO4, acid lactic, formic,… gây tác động Các muối kim loại nặng Pb, Hg, Pt nồng độ thấp gây kết tủa biến tính enzyme Nguyên nhân: muối kim loại nặng tạo nên phức hệ với nhóm quan trọng protein – enzyme, làm thay đổi cấu trúc protein → biến tính enzyme Các dung mơi hữu phân cực, chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ cấu trúc bậc III, làm tăng độ xoắn mạch polypeptide phân tử pepsin → giảm hoạt tính pepsin 13 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT SÁT KHUẨN Với liều lượng nhỏ chất sát khuẩn HCl, salisilic acid, clorofrom,… không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin chúng làm giảm đáng kể hoạt tính pepsin chúng nhiệt độ cao 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT KÌM HÃM Tất chất gây biến tính protein kìm hãm khơng đặc hiệu enzyme nói chung pepsin nói riêng Ngồi ra, có nhiều chất khơng làm biến tính protein nhưng làm giảm hoạt độ xúc tác chế kìm hãm cạnh tranh kìm hãm khơng cạnh tranh… Với chất kìm hãm ρ-bromophenacyl bromide, hoạt tính protease bị phá hủy từ 70 – 80% Hợp chất α-diazo- ρ-bromoacetophenone làm vơ hoạt hồn tồn pepsin Nồng độ vơ hoạt hai chất mol ức chế mol pepsin Hợp chất diphenyldiazomethane mol ức chế mol enzyme làm giảm 50% hoạt tính pepsin tác dụng chất Hb, hợp chất nayfcungx ngăn cản hoạt hóa pepsinogen Sự vơ hoạt xảy có ion Cu2+ hợp chất béo diazocarbonyl, hợp chất có cấu trúc tương tự chất pepsin Ngoài ra, pepsin bị ức chế pepstatin tùy mức độ, pepsin A bị vô hoạt hoang toàn nồng độ pepstatin khoảng 1mol/1mol pepsin A, pepsin C phải cần khoảng 100mol pepstitan/mol pepsin C 14 IV ỨNG DỤNG 4.1 ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC THỰC PHẨM Pepsin thương mại tách từ lớp tuyến dày heo Nó thành phần rennet hay gọi rennin sử dụng để đông sữa, đặc biệt sản xuất mát Pepsin sử dụng cho loạt ứng dụng sản xuất thực phẩm: để biến đổi cung cấp chất lượng whipping với protein đậu nành gelatin, biến đổi protein thực vật để sử dụng mặt hàng ăn nhẹ không làm từ bơ, để làm ngũ cốc nấu chín trước vào ngũ cốc nóng tức thời chuẩn bị để thủy phân protein động vật protein thực vật để sử dụng hương liệu thực phẩm đồ uống (Fujinaga M, Chernaia MM, Tarasova NI, Mosimann SC, James MN, 1995) Ngoài chất enzyme phân giải protein nên pepsin dạng nội tận dụng trình sản xuất nước chấm, hay sản xuất rượu bia giúp giảm thiểu thời gian lên men rượu bia, thành phẩm đạt tiêu hiệu quả, tiết kiệm chi phí sản xuất, tăng tỷ lệ nguyên liệu thay thế, hiệu thu hồi sản phẩm nâng cao,…trong sản xuất bánh qui thêm vào nguyên liệu làm bánh giúp tiết kiệm thời gian trộn bột, tăng độ nở dẻo cho bột bánh Từ hình thành nên sản phẩm bánh quy ngon, hấp dẫn 15 4.1.1 Sản xuất mát Hình 4.1 Quy trình sản xuất mat Theo truyền thống sản xuất mát, sau đông tụ dịch chiết từ dày bê 1–5 tuần tuổi gọi "rennet" Lên men sữa, đông tụ casein đẩy phần nước chất hịa tan, người ta nhận vẩy sữa (hay phomat không tin chế) Thường người ta dùng enzyme rennet tạo pH môi trường axit (thường 6,6 – 6,7) xuống đến pH đẳng điện (pI = 5,1 – 5,3) để đông tụ sữa sau trùng Pasteur (85 – 90oC 15 – 20 phút) để thu phomat khối Tác động rennet chủ yếu thủy phân phần casein thành pepton axit amin tự Bản chất: Là kết tụ micelle casein để tạo gel đặc Rennet hỗn hợp enzyme, chủ yếu chymosin peptin Tỷ lệ chymosin pepsin rennet khác tùy thuộc vào độ tuổi bê, chymosin thường chiến khoảng 80-90% + Chymosin có nguồn gốc từ dày bê + Repsinogen hoạt hóa thành pepsin 16 Cơ chế: - Casein protein sữa, có cấu tạo gồm chuỗi polypeptide kỵ nước αs 1−¿, αs 2−¿, β−casein chuỗi polypeptide ưa nước κ−casein Do đặc tính tích điện âm ưa nước nên κ−casein nằm bề mặt hạt micelle sữa Chymosin enzyme đóng vai trị đông tụ sữa, thông qua việc thủy phân liên kết hai gốc Phe105 Met106 phân tử κ−casein protein sữa Sản phẩm phản ứng thủy phân hai giai đoạn peptide giai đoạn từ Glu1 đến Phe105 kết tủa, đoạn Met106 đến Vla169 tan vào phần Whey sữa Enzyme rennet cắt đầu ưa nước κ−casein cho cấu trúc micelle khơng cịn bền → hạt micelle liên kết thông qua cầu photphat canxi 17 4.1.2 Ứng dụng sản xuất nước mắm Thùng gỗ Muối Lên men Triết rút Nước mắm cốt Nước bồi Bã chượp Lên men Bã Triết rút Dịch nước mắm Pha đầu Sản phẩm 18 Hình 4.2 Quy trình sản xuất nước mắm cổ truyền Như biết, pepsin enzyme hệ enzyme protease, khả thủy phân protein, enzyme thủy phân protein mạnh mẽ Trong lĩnh vực sản xuất nước chấm, điển nước mắm, việc phân giải protein tối ưu để tạo axit amin, nâng cao tỉ lệ đạm từ nâng cao giá trị sản phẩm Chính lí đó, enzyme pepsin ứng dụng cách tự nhiên việc có sẵn nội tạng cá, đóng vai trò lớn việc lên men sản xuất nước mắm truyền thống Q trình cơng nghệ sản xuất nước mắm gồm giai đoạn: Hai giai đoạn thủy phân tạo mùi Có thể coi hai giai đoạn lên men nước mắm: lên men lên men phụ Trong lên men chính, chủ yếu thủy phân protein thịt cá thành acid amin Về chế với có mặt enzyme pepsin, chúng phân cắt từ phân tử Protein Polypeptide Oligopeptide Acid amin 4.2 ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC, SỨC KHỎE Pepsin hoạt động thể? Chức phá vỡ (hoặc biến tính) protein, phá vỡ liên kết peptit thành mảnh nhỏ axit amin giúp ruột non hấp thu dễ dàng Vai trị men tiêu hóa chủ yếu làm chất xúc tác phản ứng hóa học thể Các enzym tiêu hóa biến phân tử lớn thành phần tử dễ hấp thụ mà thể thực sử dụng để tồn phát triển Lợi ích công dụng pepsin bao gồm:  Hỗ trợ thể phá vỡ protein khó tiêu hóa  Giúp điều trị chứng khó tiêu ruột bị rị rỉ cách giảm căng thẳng cho đường tiêu hóa  Kiểm soát viêm tụy, can thiệp vào khả sản xuất cách enzym cần thiết để phân hủy thức ăn  Giúp chuẩn bị kháng thể tiêu hóa IgG  Kích thích tiết mật  Hỗ trợ giải độc gan  Cải thiện triệu chứng trào ngược axit, ợ nóng vấn đề khác hội chứng ruột kích thích  Tăng cường hấp thu dinh dưỡng ngăn ngừa thiếu hụt dinh dưỡng, bao gồm thiếu vitamin B12, sắt canxi 19  Chống lại chất ức chế enzym cách tự nhiên thực phẩm đậu phộng, mầm lúa mì, lòng trắng trứng, hạch, hạt, đậu khoai tây  Được sử dụng để giúp kiểm soát nhiều vấn đề sức khỏe, chẳng hạn chứng khó tiêu (đau tái phát khó chịu vùng bụng trên), nơn ốm nghén mang thai, buồn nôn tiêu chảy, chứng khó tiêu liên quan đến điều trị ung thư (Jillian Levy, CHHC, 2018) Pepsin có nhiệm vụ tiêu diệt vi khuẩn dày tách vitamin B12 khỏi protein để vitamin sử dụng cách Vào năm 2015, nhà nghiên cứu Trung Quốc đề xuất pepsin giúp tiêu hóa axit nucleic - thành phần DNA RNA cần thiết cho hầu hết khía cạnh sức khỏe, từ hệ thống miễn dịch đến phát triển bắp Phát cho thấy vai trò pepsin việc phân hủy chất dinh dưỡng lớn người ta nghĩ trước (Phil white, 2019) 4.3 ỨNG DỤNG TRONG CÁC LĨNH VỰC KHÁC Nó sử dụng ngành cơng nghiệp da để loại bỏ lơng mơ cịn sót lại từ da việc thu hồi bạc từ phim ảnh loại bỏ tiêu hóa lớp gelatin chứa bạc (Fujinaga M, Chernaia MM, Tarasova NI, Mosimann SC, James MN, 1995) TÀI LIỆU THAM KHẢO MH Palashoff, 2008 Determining the specificity of pepsin for proteolytic digestion Fujinaga M, Chernaia MM, Tarasova NI, Mosimann SC, James MN, 1995 Crystal structure of human pepsin and its complex with pepstatin Jillian Levy, CHHC, 2018 Pepsin: Signs You Need More of This Digestive Enzyme & How to Get It in Your Diet Phil White, 2019 What to Know About Pepsin: Benefits & Uses 20 ... ENZYME PEPSIN TRONG QUÁ TRÌNH TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT Pepsin: động vật hoạt động ăn diễn nhiều, thể động vật phải địi hỏi lượng enzym tiêu hóa thân nhiều lúc bình thường Hệ thống tiêu hóa ln chứa... khác để tiêu hóa chất 1.2 PEPIN 1.2.1 Lịch sử Pepsin Pepsin enzyme có tác dụng phân hủy protein thành peptide nhỏ Được sản xuất dày, pepsin enzyme tiêu hóa hệ thống tiêu hóa giúp tiêu hóa protein... tạo thể Pepsin enzyme có vai trị quan trọng tuyến tiêu hóa Pepsin tồn hoạt động dịch vị động vật có vú, chim bị sát, cá Ở loài heo, enzyme tập trung tế bào vị trí đáy bao tử Cịn động vật có vú,