NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM TT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Huỳnh Thị Phương Liên Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đinh Duy KhángPGS Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Nihe), Bộ y tế Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thái Sơn, Học viện Quân y Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Đăng Hiền, Trung tâm NC sản xuất vắc xin & Sinh phẩm y tế (Polyvac), Bộ y tế Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Viêm não Nhật (VNNB) bệnh gây nhiễm trùng thần kinh cấp tính với nhiều mức độ khác nhau, đáng ngại bệnh thường để lại di chứng thần kinh (như điếc, mù, động kinh, yếu liệt cứng toàn thân liệt tay chân…) tỷ lệ tử vong cao [1, 2] Cho đến chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB, biện pháp phòng bệnh hiệu tiêm vắc xin Vi rút VNNB có nhiều chủng, hầu hết chủng sử dụng để sản xuất vắc xin thuộc genotype gồm chủng Nakayama; Beijing -1; Beijing-3 SA-14-14-2 Nhật Bản nước nghiên cứu, sản xuất thành công vắc xin VNNB Việc sử dụng vắc xin VNNB cộng đồng góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh VNNB đáng kể [3-5] Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất sử dụng vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất não chuột từ năm 1989 Tuy nhiên, vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất não chuột có nhiều hạn chế chi phí sản xuất cao, địi hỏi phải có chuột bệnh, cần có hệ thống ni chuột kiểm soát phức tạp, đặc biệt khâu tinh chế kháng nguyên vi rút thu nhận từ não chuột, hiệu suất sản xuất thấp nguy tạo nhiễm protein từ não chuột ảnh hưởng tới sức khỏe tính mạng người tiêm vắc xin Từ năm 2006, công ty vắc xin sinh phẩm số nghiên cứu sản xuất vắc xin bất hoạt tế bào Vero, sử dụng chủng Beijing-1 (JECEVAX) [6, 7] Trong đó, việc kiểm sốt tốt chất lượng chủng vi rút trước đưa vào sản xuất vắc xin đại trà u cầu cần thiết Chính lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt tế bào Vero Việt Nam” 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng (chủng gốc chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Việt Nam Nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu tính ổn định hiệu giá, ổn định di truyền tính sinh miễn dịch chủng vi rút sản xuất vắc xin VNNB theo thời gian sau sản xuất (0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm) nhiệt độ Nitrogen lỏng; Ở nhiệt độ bảo quản khác (nhiệt độ -20oC sau 1, 3, tháng bảo quản; nhiệt độ 2-8oC sau 1, 3, 5, ngày bảo quản); Nghiên cứu tương đồng nucleotide axít amin Protein E chủng sản xuất so với chủng VNNB lưu hành Việt Nam từ 19642014; Đánh giá tính an tồn tính sinh miễn dịch bảo vệ chủng 10 lô vắc xin JECEVAX sản xuất từ lô WSV quy mô phịng thí nghiệm; Xây dựng tiêu, phương pháp & tiêu chuẩn chất lượng chủng (chủng gốc chủng sản xuất) để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Việt Nam Bố cục luận án Luận án gồm 114 trang, phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết bàn luận 49 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục cơng trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo trang gồm 98 tài liệu Trong luận án có 18 hình, 32 bảng 48 trang phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vi rút Viêm não Nhật Đặc điểm, cấu trúc vi rút Viêm não Nhật Bản Vi rút VNNB thành viên vi rút Arbo (arthropod borne viruses), vi rút côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu [8] Vi rút VNNB có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) hoạt tính trung hịa glycoprotein preM E (vỏ tiền màng vi rút) [1, 10] Bộ gen RNA gồm: protein cấu trúc protein không cấu trúc Các protein cấu trúc gồm Protein C (Capsid), Protein M (Membrane) Protein E (Envelope) [1, 11, 12] Các protein không cấu trúc gồm NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 [14] Trong q trình vi rút phóng thích khỏi tế bào, Protein E chịu trách nhiệm công đến tế bào đích hịa màng tế bào; protein E mang kháng nguyên bề mặt kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) hoạt tính trung hịa để tạo kháng thể trung hịa Đây tiêu chuẩn để chọn chủng dự tuyển cho sản xuất vắc xin VNNB [14] Dịch tễ học phân tử vi rút Viêm não Nhật Bản Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút VNNB tập trung nghiên cứu vùng gen E với độ dài 1500 bp, vùng có liên quan đến độc lực tính sinh miễn dịch vi rút chọn vùng gen lý tưởng để nghiên cứu tiến hoá, phát tán, biến đổi, khác chủng vi rút VNNB Cho đến có nhiều chủng vi rút VNNB phát nhờ có sinh học phân tử mà phân genotype Ở Việt Nam có nhiều chủng vi rút VNNB phát hầu hết thuộc genotype genotype [17-19] 1.2 Vắc xin Viêm não Nhật Bản Năm 1938, Takanouchi cs nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt từ não chuột [5, 20] Trong suốt năm sau đó, nghiên cứu vắc xin VNNB tiến hành Nhật Bản, Mỹ nhiều nước giới nhằm tăng hiệu lực bảo vệ giảm độc tính khơng mong muốn vắc xin [22] Năm 1959-1981, trường phái khác Trung Quốc nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực từ chủng vi rút độc lực, thực chủng 12.1.7 [23, 24] Sau nhiều năm nghiên cứu, tác giả Trung Quốc tạo chủng VNNB giảm độc lực SA 14-14-2 [7] Vắc xin bất hoạt nuôi cấy tế bào thận chuột hamster tiên phát, sử dụng chủng Beijing -3 (P3) [24, 26, 27] Năm 1971, Viện Biken đạo Giáo sư Fukai (nguyên Chủ tịch Hiệp Hội nghiên cứu vắc xin Sinh phẩm Nhật Bản) nghiên cứu tinh chế vắc xin để đạt độ tinh khiết với hàm lượng protein ≤ 80 µg/mL Đây hàm lượng tiêu chuẩn protein cho phép vắc xin VNNB sản xuất từ não chuột theo phương pháp hóa lý Takaku Cho đến phương pháp tinh chế tiên tiến TCYTTG công nhận Vắc xin hệ vắc xin sản xuất tế bào (Nhật, Áo, Ấn Độ, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc…) Vắc xin hệ phương pháp công nghệ gen có nhiều tác giả nghiên cứu hầu hết dừng lại mức nghiên cứu thử nghiệm phịng thí nghiệm [36, 56] Tại Việt Nam, từ thập kỷ 70, Đỗ Quang Hà nghiên cứu sản xuất thử vắc xin VNNB từ tế bào thận lợn tiên phát, thử nghiệm thực địa khơng có đáp ứng miễn dịch Vắc xin sản xuất tế bào hiệu bảo vệ có thấp khắc phục nhược điểm công nghệ sản xuất não chuột ổ Công nghệ tế bào công nghệ mở đường cho công nghệ sản xuất đại vắc xin tái tổ hợp, vắc xin vector, vắc xin ADN…trong tương lai Hiện có bốn loại vắc xin sản xuất sử dụng rộng rãi dựa công nghệ sản xuất vắc xin nêu bao gồm (1) Công nghệ sản xuất vắc xin bất hoạt não chuột (chủng Nakayama Beijing -1); (2) Công nghệ sản xuất vắc xin bất hoạt tế bào Vero (chủng Beijing -1, SA14-14-2); (3) Công nghệ sản xuất vắc xin sống giảm độc lực tế bào PHK (chủng SA14-14-2); (4) Sản xuất vắc xin tái tổ hợp theo công nghệ khảm (chimeric –JE and YF-17D vắc xin, chủng SA14-14-2) Trong bốn loại trừ loại đầu sản xuất não chuột (thực tế có vắc xin Việt Nam, Hàn Quốc) cịn lại cơng nghệ sản xuất tế bào Điều để thấy xu hướng chung giới dần chuyển sang cơng nghệ sản xuất vắc xin VNNB tế bào Việt Nam bắt đầu đưa vắc xin VNNB JEVAX vào chương trình tiêm chủng mở rộng quốc gia (TCMR QG) từ năm 1991 đến số ca nhiễm vi rút VNNB giảm đáng kể Sự phát triển vắc xin Viêm não Nhật Bản tế bào Trung Quốc nước giới nghiên cứu sản xuất vắc xin tế bào, Nhật Bản nghiên cứu thành công công nghệ Vắc xin sản xuất tế bào hiệu bảo vệ có thấp khắc phục nhược điểm công nghệ sản xuất não chuột ổ Điều đáng quan tâm cơng nghệ sản xuất vắc xin tế bào mở rộng qui mơ sản xuất cách nhanh chóng, có khả cung cấp sản lượng vắc xin lớn, giá thành rẻ người dân dễ dàng tiếp cận vắc xin, vụ dịch Công nghệ tế bào công nghệ mở đường cho công nghệ sản xuất đại vắc xin tái tổ hợp, vắc xin vector, vắc xin ADN…trong tương lai 1.3 Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản Chủng vi rút Nakayama-NIH Nhật Bản nước phân lập vi rút VNNB năm 1935 từ em bé bị VNNB, đặt tên chủng Nakayama [13, 20] Ngoài Nhật Bản, chủng Nakayama số nước chọn để sản xuất vắc xin cho người Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam… Chủng vi rút Beijing-1 Chủng Beijing-1 phân lập từ người năm 1949 Bắc Kinh, Trung Quốc Nhật Bản bắt đầu sử dụng chủng Beijing-1 với chủng Nakayama –NIH để sản xuất vắc xin VNNB cho nhu cầu nước xuất từ năm1989 [34, 35] Ở châu Á chủng Nakayama Beijing-1 chọn để sản xuất vắc xin khả nhân lên nhạy não chuột có phản ứng chéo với chủng khác chuột [16, 36-40] Chủng SA14-14-2 Chủng vi rút VNNB nguyên thủy SA chủng độc lực phân lập từ muỗi năm 1954 Từ 1959-1981, chủng nguyên thủy SA độc lực Trung Quốc nghiên cứu phát triển thành chủng vi rút sống giảm độc lực, chủng giảm độc lực có ký hiệu 12.1.7 [41, 42] Chủng Beijing-3 Chủng Beijing-3 (P3) phân lập từ não bệnh nhân Trung Quốc năm 1949 Chủng nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào PHK [3] Năm 1998, vắc xin bất hoạt sản xuất TB Vero, sử dụng chủng Beijing-3 cấp phép Trung Quốc Vắc xin tương tự dựa chủng Beijing-1 cấp phép Nhật Bản [48] Dịng tế bào ni cấy (nhân) vi rút Vi rút có khả nhân lên nhiều dòng tế bào Tuy nhiên phép sử dụng để sản xuất vắc xin có số dịng tế bào có nguồn gốc từ động vật thận khỉ, thận bị, phơi gà; Các dịng tế bào lưỡng bội người (MRC5, KMB17) khỉ (WI38, FRhL2); dòng tế bào thường trực: Vero, CHO Tại Vabiotech, tế bào vero CCL81 WHO đời 134 (2 ống) nhập Việt nam, từ nhân lên làm tế bào gốc MCB đời 137 (chỉ có 100 ống) để phục vụ cho nghiên cứu sản xuất Sử dụng ống đời 137 nhân lên đời 139 làm WCB (200 ống) Từ đời 139 nhân lên đến đời 142 để đưa vào sản xuất 1.4 Các khuyến cáo TCYTTG cho sản xuất kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt [61] Chuột: Chuột sử dụng để nhân chủng vi rút VNNB sản xuất vắc xin phải từ đàn/dòng chuột khỏe mạnh cấp phép (kiểm soát) quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền Tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK): Tế bào thận tiên phát sử dụng để sản xuất vắc xin, loại động vật loại mô tế bào tiên phát phải phê chuẩn quan quốc gia có thẩm quyền Hiện có dòng tế bào phát triển sử dụng tế bào thận chuột Hamster tiên phát Tế bào thường trực: Khi dòng tế bào thường trực sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB ngân hàng tế bào gốc (MCB) ngân hàng tế bào sản xuất (WCB) phải kiểm soát phải đáp ứng tiêu chuẩn có nguồn gốc từ động vật sử dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho người Chủng vi rút: Chủng vi rút sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt phải chủng đảm bảo tiêu chuẩn khiết, an toàn hiệu lâm sàng bất hoạt Hệ thống chủng vi rút gồm: Chủng gốc (Master seed lots) chủng sản xuất (Working seed lots) Chủng đơng khơ bảo quản ≤ -20oC; chủng đơng băng bảo quản ≤ -60oC Chủng gốc chủng sản xuất phải kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng quy định, phải đạt tiêu chuẩn sở phê chuẩn quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền 1.5 Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt tế bào Vero Việt Nam Giai đoạn 1: Nghiên cứu thiết lập hệ thống ngân hàng chủng với việc xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero (năm 2006 -2012 - Đề tài cấp Bộ Y tế): + Từ năm 2006-2010: Nghiên cứu thích ứng chủng vi rút Beijing-1 tế bào Vero để tạo chủng vi rút đủ điều kiện cho phát triển sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Vabiotech + Từ tháng 4/2010: bắt đầu thiết lập chủng gốc chủng sản xuất để sản xuất thử nghiệm loạt vắc xin nhằm xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero VABIOTECH Giai đoạn 2: Sử dụng hệ thống chủng thiết lập sản xuất loạt vắc xin cho nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I, II, IIB & III Việt Nam (Năm 2013-2018 - Đề tài cấp Nhà nước); kiểm tra đánh giá tính ổn định chủng beijing-1 vắc xin JECEVAX sau sản xuất quy mơ phịng thí nghiệm Giai đoạn 3: Tổng hợp liệu có để hồn thiện, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho ngân hàng chủng sản xuất, vắc xin 11 2.3 Thiết kế nghiên cứu Mycoplasma, ổn đinh hiệu giá di tuyền (Sản xuất từ 2010 đến 2018) Hình Sơ đồ nghiên cứu 2.4 Biến số nội dung nghiên cứu Bảng Chỉ tiêu nghiên cứu lô chủng gốc BV-MSV-0210, lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 Chỉ tiêu TT Phương pháp Cấy môi trường Vô trùng Vi rút ngoại lai chuột nhắt Thử chuột nhắt Vi rút ngoại lai chuột nhắt ổ Thử chuột nhắt ổ Vi rút ngoại lai chuột lang Thử chuột lang Vi rút ngoại lai tế bào Kiểm tra nhiễm Mycoplasma Thioglycolate Tế bào Vero, BHK21, MRC5 Cấy môi trường PPLO lỏng I, II, thạch PPLO 12 Nhận dạng với KT đặc hiệu ELISA Nhận dạng ổn định di truyền Giải trình tự gen Tương đồng nucleotide Giải trình tự gen 10 Tương đồng protein Giải trình tự gen 11 Hiệu giá vi rút tế bào Tạo đám hoại tử PFU 12 Hiệu giá vi rút ĐVTN Thử não chuột nhắt Hiệu giá chủng kiểm tra sau bảo quản 13 Nhiệt độ bảo quản phù hợp dải nhiệt độ khác nhau, khoảng thời gian khác Với vắc xin JECEVAX thực thử nghiệm theo yêu cầu WHO TRS 963 Tiêu chuẩn áp dụng: DĐVN V, 2017; Dược điển Châu Âu, 2018; WHO TRS 963 2.5 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp kiểm định sử dụng nghiên cứu áp dụng theo Quy trình chuẩn kiểm định chất lượng vắc xin Công ty VABIOTECH, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện CNSH- Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, NICVB Bao gồm quy trình kỹ thuật: Kiểm định vi rút ngoại lai, Kiểm định vô khuẩn, Nhận dạng, Đánh giá tương đồng di truyền, Hiệu giá vi rút, Thử nghiệm công hiệu vắc xin, An toàn chung, An toàn đặc hiệu, Chất gây sốt, Hàm lượng Thimerosal, Hàm lượng Formaldehyde, Hàm lượng ADN tồn dư, Hàm lượng protein tổng số, pH, Cảm quan, Thể tích đóng ống, Kiểm tra Mycoplasma 13 Xử lý phân tích sớ liệu 2.6 Kết thử nghiệm chủng vắc xin ghi chép theo biểu mẫu tiêu chuẩn VABIOTECH NICVB Số liệu thí nghiệm vắc xin ghi chép, nhập xử lý phần mềm Excel Kết số liệu phân tích trình bày dạng bảng thống kê số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tính ổn định hiệu giá di truyền chủng Beijing-1 Kết nhận dạng chủng gốc (BV-MSV-0210) chủng sản xuất (BV-WSV-0310) cho thấy, nồng độ pha loãng 640 lần, OD (giá trị mật độ quang) chủng gốc cao khoảng 17,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm chủng sản xuất cao khoảng 22,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm khơng có kháng ngun vi rút VNNB; độ pha 1/10 hàm lượng kháng nguyên chủng gốc chủng sản xuất cao vắc xin chuẩn BR209 2,5 lần (bảng 3.1) Trình tự nucleotide trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E chủng gốc (BV-MSV-0210) chủng sản xuất (BV-WSV-0310) có tương đồng 100% so với chủng chuẩn tham chiếu Reference JEV Beijing-Kanonji (Hình 3.1) Kết giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên E chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BV-WSV-0310 so với chủng chuẩn tham chiếu JEV Beijing-Kanonji cho thấy, sản phẩm PCR đặc hiệu, khơng có sản phẩm phụ, kích thước tương đương với độ dài gen E theo tính tốn lý thuyết (khoảng 1500 bp) Kết trình tự vùng gen E chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BV-WSV-0310, gen mã hóa kháng nguyên E có độ dài 1500 bp, tỷ lệ GC 52%, mã hóa cho protein có độ dài 500 axit amin (hình 3.4) 14 So sánh trình tự nucleotide trình tự protein gen E chủng sản xuất, chủng gốc với chủng vi rút VNNB phân lập Việt Nam (từ 1964-2014), đặc biệt chủng phân lập từ người, kết cho thấy, tỷ lệ dao động từ 86,67 đến 97,53% nucleotide 97,2 đến 99,20% protein Trên người hay muỗi hay lợn, chủng thuộc genotype III (GIII) tương đồng nucleotide protein >95% cao hẳn chủng thuộc genotype I (GI) (sự tương đồng nucleotide 86-88,3% tương đồng protein >94%) Kết tương đương kết nhà nghiên cứu khác giới [71] Kết bảng 3.7 cho thấy, epitope thuộc gen mã hóa kháng nguyên E chủng sản xuất, chủng tham chiếu, chủng vắc xin SA1414-2 chủng vi rút VNNB phân lập từ người Việt Nam năm 2014 không thay đổi Kết nghiên cứu lâm sàng cho thấy, sau tiêm đủ liều vắc xin JECEVAX 99,62% đối tượng nghiên cứu tăng hiệu giá KTTH >0,4 log (tăng lần) Tỷ lệ đối tượng nghiên cứu có KTTH sau liều tăng > 1,0 log vắc xin JECEVAX cao vắc xin đối chứng JEVAX® (HGKT đạt 99,0%) Theo số liệu tổng kết báo cáo Viện Vệ Sinh dịch tễ trung ương hội nghị TCMR QG 2020, đến năm 2019 (bảng 1.2), hiệu phòng bệnh giảm rõ từ 1454 ca (năm 1991) 196 ca (năm 2019) – tức giảm gần 90% Vắc xin ngoại từ 2019 thức vào VN, cịn trước tồn dùng vắc xin JEVAX VN sản xuất- tức dùng vắc xin JECEVAX cho kết tốt tương đương Kết kiểm tra hiệu giá vi rút não chuột chủng gốc (BV-MSV-0210) chủng sản xuất (BV-WSV-0310) > 107 PFU/ml, đạt tiêu chuẩn dự kiến ≥ 106 PFU/ml (bảng 3.2, 3.3) Bằng phương pháp thử nghiệm tế bào, hiệu giá trung bình 15 chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất 8,72x107 PFU/ml 3,93x107 PFU/ml (bảng 3.5) Kết nghiên cứu bảng 3.8 cho thấy, sau sản xuất bảo quản nitrogen lỏng, hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210 (6 đời cấy chuyển) chủng sản xuất BV-WSV-0310 (7 đời cấy chuyển) gần khơng có thay đổi sau sản xuất (2010) đến năm 2020 bảo quản nitrogen lỏng Chủng gốc BV-MSV-0210 hiệu giá cao chủng sản xuất BV-WSV-0310 từ 0,3-0,4 log giao động lần thử nghiệm lô chủng giảm tối đa từ 0,06 - 0,07 log Nghiên cứu tính ổn định chủng vi rút nỗ lực nhóm nghiên cứu nhằm giám sát tính ổn định hiệu giá chủng vi rút VNNB sử dụng để sản xuất vắc xin Trong nghiên cứu kiểm chứng khẳng định điều kiện bảo quản nitrogen lỏng tối ưu cho chủng VNNB Ngoài ra, việc bổ sung Gelatin 0,05% trước đóng ống cất giữ, giúp tăng khả bảo vệ bền vững cho kháng nguyên vi rút VNNB bảo quản lâu dài trạng thái ngừng hoạt động (điều kiện nitrogen lỏng) Việc thêm Geltatin vào chủng hay vắc xin chất ổn định nghiên cứu áp dụng cho nhiều loại vắc xin giới DTaP, Sởi, Quai Bị, Rubella, MR, MMR, Dại, Viêm não nhật (vắc xin Je-vax Aventis Pasteur, Gelatin 0,5 mg/liều …) [3, 4] Sau sản xuất bảo quản nitrogen lỏng, hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BV-WSV-0310 gần khơng có thay đổi sau sản xuất đến năm 2020 Chủng gốc BV-MSV-0210 hiệu giá cao chủng sản xuất BV-WSV-0310 từ 0,3-0,4 log (bảng 3.10) Hiệu giá vi rút bảo quản chủng -20oC Sau tháng giảm 0,61 log; sau tháng giảm 1,91 log (về sát giới hạn tiêu chuẩn 16 cho phép chủng WSV dự kiến ≥ 6,0 log), sau tháng giảm sâu rõ rệt (2,66 log) thấp tiêu chuẩn cho phép (bảng 3.9) Hiệu giá chủng BV-WSV-0310 bảo quản 2-8oC sau ngày giảm 1,17 log; sau ngày giảm 1,46 log đạt so với tiêu chuẩn (≥ 6,0 log) Nhưng sau 5-7 ngày giảm sâu rõ rệt, 2,39-2,52 log thấp tiêu chuẩn cho phép (bảng 3.10) Kết đánh giá số số chất lượng khác chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BV-WSV-0310 đạt yêu cầu vô trùng (vi nấm vi khuẩn) – bảng 3.11; Mycoplasma (bảng 3.12) vi rút ngoại lai (bảng 3.13 & 3.14) 3.2 Tính an toàn sinh miễn dịch bảo vệ chủng các lô vắc xin thành phẩm sản xuất từ chủng BV-WSV-0310 Kết bảng 3.15 đến bảng 3.18 cho thấy thử nghiệm an toàn (an toàn chung, an toàn đặc hiệu, chất gây sốt, DNA tồn dư) hay tiêu hóa lý (pH, cảm quan, thể tích, , Protein tổng số, Thimerosal, Formaldehyde) 10 lô vắc xin JECEVAX sản xuất từ lô chủng Beijing-1 BV-WSV-0310 cho kết đạt yêu cầu theo quy định TCYTTG (WHO TRS 963), DĐVN V, 2017 Cơng hiệu (hay tính sinh miễn dịch) vắc xin tính số trung hịa kháng thể log10n, n kết định lượng kháng thể trung hòa kỹ thuật trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50) Hiệu giá kháng thể trung hịa 10 lơ vắc xin JECEVAX cao hiệu giá trung hòa vắc xin mẫu chuẩn (giới hạn tối thiểu cho phép thử nghiệm HGKTTH tham chiếu theo vắc xin JE-CEVAX (Biken) ≥ 1,3 log) (bảng 3.19, hình 3.8, hình 3.9) Kết nghiên cứu tính sinh miễn dịch động vật thí nghiệm (cơng hiệu) 10 lơ vắc xin VNNB JECEVAXcho thấy cao vắc xin mẫu chuẩn BR209, HGKTTH JECEVAX đạt từ 1,7 – 2,36 log so với 17 tiêu chuẩn sở > 1,3 log Kết công hiệu tương quan 10 lô vắc xin JECEVAX so với vắc xin mẫu chuẩn BR209 >1,0 dao động khoảng 1,013 – 1,146 Vắc xin đạt yêu cầu an toàn sinh miễn dịch tốt phịng thí nghiệm xem xét để triển khai tiếp nghiên cứu lâm sàng người (Đề tài cấp Nhà nước 2013-2018) Thực tế cho thấy sau giai đoạn thử người, vắc xin chứng minh đạt an toàn sinh miễn dịch tốt tương đương so với vắc xin đối chứng JEVAX nên đề tài nghiệm thu, đánh giá cao cho phép chuyển sang làm hồ sơ đăng ký thức để sản xuất đại trà dùng cho người Ngồi lơ chủng BV-WSV-0310 cịn sử dụng để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn quốc gia (MCQG) lô BR-520 từ tháng 5/2020 – tháng 10/2021 dự án cấp nhà nước NICVB: “nghiên cứu sx 11 vắc xin mẫu chuẩn dùng cho kiểm định chất lượng VX thuộc chương trình sản phẩm quốc gia VX phịng bệnh cho người” Lơ mẫu chuẩn đạt tất yêu cầu chung cho lô MCQG theo quy định chung TCYTTG, nghiệm thu vào tháng 10/2021 18 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Việt Nam Từ kết nuôi cấy sản xuất lô chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BV-WSV-0310 vi rút VNNB từ thiết lập đến thời điểm nghiên cứu, tiêu chuẩn khuyến nghị cho số đời cấy tối đa chủng gốc đời chủng sản xuất đời Loại tế bào sử dụng cho nuôi cấy vi rút VNNB tế bào Vero với số đời cấy chuyển tối đa 150 đời Chủng gốc BV-MSV-0210 chủng sản xuất BVWSV-0310 giảm dần hiệu giá vi rút bảo quản theo thời gian Các điều kiện bảo quản ưu tiên nitrogen lỏng, - 60oC/3 tháng - 20oC/3 ngày (bảng 3.21) Kiểm định tác nhân ngoại lai sử dụng chuột nhắt, chuột nhắt ổ, chuột lang dòng tế bào MRC5, Vero, BHK21 Kiểm định nhận dạng sử dụng phương pháp ELISA, giải trình tự gen E, giải trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E (bảng 3.20) Kiểm định ổn định di truyền lô chủng gốc trình tự nucleotide kháng nguyên E trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E tương đồng với mẫu chuẩn Reference JEV Beijing-Kanonji ≥95,0% Trình tự nucleotide trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E tương đồng với chủng Vi rút Viêm não Nhật Bản phân lập Việt Nam 85,0% Hiệu giá vi rút sau bảo quản nitrogen lỏng đạt ≥ 6,0 log PFU/ml (bảng 3.21, 3.22) ... ? ?Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin vi? ?m não Nhật Bản bất hoạt tế bào Vero Vi? ??t Nam? ?? 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Xây dựng tiêu chuẩn chất. .. đáng kể Sự phát triển vắc xin Vi? ?m não Nhật Bản tế bào Trung Quốc nước giới nghiên cứu sản xuất vắc xin tế bào, Nhật Bản nghiên cứu thành công công nghệ Vắc xin sản xuất tế bào hiệu bảo vệ có thấp... Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng (chủng gốc chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Vi? ??t Nam Nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu tính ổn định hiệu giá,