TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Vi rút Viêm não Nhật Bản
Vi rút VNNB thuộc nhóm vi rút Arbo (vi rút truyền qua côn trùng), được lây truyền từ côn trùng sang động vật có xương sống qua đường máu Tất cả các vi rút Arbo đều có hệ gen RNA.
Vi rút VNNB thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus nhóm B, có mối liên hệ chặt chẽ với virus West Nile và virus viêm não St Louis Với đường kính từ 40-50 nm, vi rút này có bề mặt là màng lipid kép từ tế bào chủ, bao gồm glycoprotein E và protein màng (M) Vật liệu di truyền của vi rút là một sợi RNA đơn phân cực dương xoắn, được bảo vệ bởi nucleocapsit Thành phần của hạt vi rút VNNB tinh khiết bao gồm 6% RNA, 66% protein, 17% lipid và 9% carbohydrate.
Cấu trúc phân tử của sợi RNA gồm 11.000 nucleotide, tương ứng với 3.400 axit amin
Hệ gen của vi rút VNNB mã hóa cho 10 protein, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc, trong một khung đọc mở liên tục từ đầu 5’ đến đầu 3’ cùng với các vùng không mã hóa Vi rút VNNB có tỷ trọng từ 1,19-1,2 g/cm³ trong đường và 1,22-1,24 g/cm³ trong cesium chlorid, với hệ số lắng 200S và trọng lượng phân tử khoảng 60-70 x 10^6 dalton Vi rút này có độ bền vững cao, ổn định trong khoảng pH từ 7-9, tối ưu nhất ở pH 8.
Vi rút VNNB dễ bị bất hoạt khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, cụ thể là ở 50 o C trong 50 phút và 37 o C trong vài giờ Ngược lại, ở nhiệt độ thấp như -80 o C và -20 o C, vi rút có thể tồn tại trong nhiều năm, trong khi ở nitrogen lỏng (-196 o C), vi rút tồn tại lâu dài Ngoài ra, vi rút VNNB rất nhạy cảm với các dung môi hòa tan lipit như ether và sodium deoxycholate, và cũng dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím và formaldehyde.
1.1.2 Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút
Vi rút VNNB chứa kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) và glycoprotein hoạt tính trung hòa trên các protein preM và E Đây là những kháng nguyên quan trọng trong việc sinh ra kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), kết hợp bổ thể (CF) và kháng thể trung hòa (NT), từ đó kích thích cơ thể sản xuất kháng thể bảo vệ.
Hình 1.1 Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB
(Nguồn: Bobade S S, Gade R M Zika Virus –A Vector Borne Zoonotic Disease: an International Public Health Emergency Biosc.Biotech.Res.Comm 2016;9(2)
Available from: https://bit.ly/2MLfJRM)
Bộ gen RNA gồm: 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc
Protein C (Capsid): Rất nhỏ, chỉ 9-12 Kda gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm 1 số lớn axit amin Lys và Arg Các axit amin trong protein
C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử RNA của vi rút với các tác nhân liên quan[11]
Protein M (Membrane): có 2 dạng là protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và protein M
Protein preM chứa 165 axit amin độc đáo, khác biệt với protein E Trước khi virus được giải phóng khỏi tế bào, preM sẽ được cắt bởi protease để hình thành protein M hoàn chỉnh Mặc dù preM chưa trưởng thành không thể tự tiến tới tế bào mục tiêu, nhưng nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sinh sản của virus trưởng thành.
Protein M có mặt trong vi rút trưởng thành ngoài tế bào, giúp hạt vi rút trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn khoảng 400 lần so với hạt vi rút chưa trưởng thành, điều này làm cho vi rút dễ dàng tiếp cận hơn Khi preM bị ly giải ra ngoài tế bào, cấu trúc Oligo trên bề mặt hạt vi rút được sắp xếp lại, từ đó tăng cường khả năng gây nhiễm của vi rút trưởng thành đối với vật chủ.
Protein E (Envelope) là một glycoprotein có trọng lượng phân tử từ 55-60 kDa, bao gồm 494-501 axit amin, đóng vai trò chính trong cấu trúc của vỏ vi rút So sánh chuỗi axit amin cho thấy protein E có tính bảo tồn cao trong các vi rút thuộc nhóm Flavivirus Protein này có liên quan mật thiết đến các chức năng sinh học của vi rút, bao gồm khả năng bám dính, cảm thụ, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể và điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ.
Các protein không cấu trúc (NS:nonstructural)
NS1 là một glycoprotein có trọng lượng phân tử từ 42-50 kDa, bao gồm 353-354 axit amin Chức năng của NS1 vẫn chưa được xác định rõ, nhưng có khả năng đóng vai trò như một bổ thể hòa tan, giúp cố định kháng nguyên khi chúng bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm.
NS3 có trọng lượng phân tử từ 67-70 Kda, bao gồm 618-623 axit amin, và có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit của nhóm Flavivirus Chức năng chính của NS3 là mã hóa cho enzym protease và helicase.
NS5: Có trọng lượng phân tử 104-106 Kda gồm 900-905 axit amin, có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsit của RNA
NS2A, NS2B, NS4A & NS4B: Đều rất nhỏ, có tính bảo tồn kém trong chuỗi nucleotit, sự mã hóa của chúng có thể liên quan đến protein M
Trong quá trình virus thoát ra khỏi tế bào, protein PreM được enzym protease tách ra thành protein trưởng thành, đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây nhiễm của virus Gen của virus được bao bọc bởi lớp lipid và protein E, hoàn thiện với protein C Protein E không chỉ tấn công vào tế bào đích và hòa màng tế bào, mà còn mang các kháng nguyên bề mặt như kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa, từ đó tạo ra kháng thể trung hòa Đây là tiêu chuẩn quan trọng để lựa chọn các chủng dự tuyển cho sản xuất vắc xin VNNB.
Vi rút VNNB được phân thành 5 kiểu gen (I-V) dựa trên cấu trúc gen vỏ (protein E) nhưng chỉ có 1 type huyết thanh được biết đến[14]
Phương pháp phân biệt và nhận dạng kháng nguyên
Nghiên cứu cho thấy các kháng nguyên của Flavivirus có sự phản ứng chéo, với ba nhóm vi rút chính bao gồm sốt Tây sông Nile, viêm não Louis và viêm não Nhật Bản, dẫn đến khó khăn trong việc phân biệt các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng Để nhận diện và phân biệt kháng nguyên của các vi rút này, phương pháp phản ứng trung hòa (NT) được coi là nhạy nhất, tiếp theo là phản ứng kết hợp bổ thể (CF) và cuối cùng là phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF).
Việc đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin bằng kỹ thuật trung hòa, đặc biệt là PRNT50 trên tế bào, là phương pháp đặc hiệu nhất Ngoài ra, việc sử dụng kháng thể đơn dòng giúp định loại Flavivirus và phân biệt với virus VNNB Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR với cặp mồi đặc hiệu và phương pháp phân tích trình tự gen cho phép định loại nhanh chóng và chính xác các loại virus trong nhóm Flavivirus cũng như phân loại các chủng virus VNNB khác nhau.
1.1.3 Sự nhân lên của vi rút trên tế bào
Chu kỳ nhân lên của vi rút RNA
Khi vi rút tiếp xúc với tế bào cảm thụ, nó nhận diện và bám vào các thụ thể trên màng tế bào, tạo ra khe hở cho vi rút thâm nhập và kích thích tổng hợp RNA Sợi RNA đơn polymerase được bộc lộ để tạo thành RNA phân cực (-) bổ sung, từ đó hình thành chuỗi RNA kép qua quá trình phiên mã sớm Thông tin từ sợi RNA kép được sử dụng làm khuôn để tổng hợp các sợi RNA mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng Khung đọc mở được đồng dịch mã, cắt thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc RNA và protein vi rút được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt trong nguyên sinh chất của tế bào chủ, dẫn đến sự phát triển của lưới nội chất và hình thành các nội bào đặc trưng Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp tại màng tế bào chất, sau đó các hạt virion được giải phóng qua mạng lưới Golgi bằng ngoại bào xuất tiết, tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và khởi đầu chu kỳ mới.
Sự nhân lên của vi rút trong tế bào
Vi rút VNNB có khả năng nhân lên trên nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào tiên phát và tế bào thường trực từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi (tế bào C6/36 muỗi Albobitus) Các tế bào tiên phát như thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn và tế bào phôi gà, cùng với các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ) và BHK21 (thận chuột hamster) đều được sử dụng trong nghiên cứu Trong quá trình nuôi cấy vi rút, hiện tượng hủy hoại tế bào (CPE) xảy ra, nhưng một số loại tế bào lại không cho thấy dấu hiệu CPE khi quan sát dưới kính hiển vi quang học Hiệu giá vi rút phụ thuộc vào loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy; vi rút có thể nhân lên nhanh chóng, với thời gian tạo CPE chỉ từ 1-2 ngày sau khi nhiễm trên các tế bào C6/36, Vero và BHK21.
Vắc xin Viêm não Nhật Bản
1.2.1 Lịch sử phát triển vắc xin VNNB
Vào năm 1938, Takanouchi và các cộng sự đã nghiên cứu sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt từ não chuột và thử nghiệm hiệu quả của vắc xin này trên chuột, phát hiện có kháng thể trung hòa sau khi tiêm Nghiên cứu tiếp theo của Mitamura trên lâm sàng cho thấy có sự đáp ứng miễn dịch ở vùng không lưu hành dịch, trong khi đáp ứng miễn dịch ở vùng có lưu hành dịch lại kém hơn.
Từ năm 1946 đến 1949, các nhà khoa học Mỹ và Nhật Bản đã hợp tác nghiên cứu về hiệu quả của vắc xin VNNB do Nhật Bản sản xuất, với việc thử nghiệm tại vùng Okayama có dịch lưu hành Kết quả cho thấy tỷ lệ mắc bệnh giảm từ 1/4 đến 1/3 Tuy nhiên, vắc xin này cũng gây ra nhiều phản ứng phụ nghiêm trọng, bao gồm viêm não dị ứng do protein của não chuột chưa được loại bỏ hoàn toàn.
Năm 1957, công nghệ sản xuất và chất lượng vắc xin đã có sự cải tiến, với hàm lượng protein được quy định ở mức ≤2 mg/ml Tuy nhiên, với tiêu chuẩn này, vắc xin VNNB vẫn chưa đạt yêu cầu về độ tinh khiết, dẫn đến nhiều trường hợp phản ứng phụ nghiêm trọng.
Năm 1962 tại Nhật Bản có 2 nhóm nghiên cứu là “Biken” ở Osaka và
Nisseiken tại Tokyo đã tiến hành nghiên cứu và tinh chế vắc xin bằng phương pháp siêu ly tâm, giúp loại bỏ protein tạp và giảm hàm lượng protein trong vắc xin xuống 10 lần, từ 0,2 mg/ml xuống còn 0,02 mg/ml.
Năm 1965, Nhật Bản đã tiến hành nghiên cứu để cải thiện tính an toàn và hiệu quả bảo vệ của vắc xin bằng các phương pháp hóa lý của Takaku Kết quả là một loại vắc xin có độ tinh khiết cao, với hàm lượng protein chỉ từ 10-25 µg/ml Vắc xin này không chỉ mang lại hiệu quả bảo vệ cao mà còn rất an toàn cho trẻ em, với các phản ứng phụ không đáng kể, chỉ xảy ra ở một số cá nhân có cơ địa quá mẫn cảm.
Từ năm 1959 đến 1981, một trường phái nghiên cứu ở Trung Quốc đã phát triển vắc xin sống giảm độc lực từ chủng vi rút độc lực Quá trình này bao gồm việc cấy truyền 110 lần trên tế bào phôi gà, tiếp theo là 100 lần trên tế bào thận chuột đất Mặc dù vậy, vắc xin vẫn còn tồn tại yếu tố gây độc tế bào thần kinh, do đó, chủng vi rút vắc xin đã được lựa chọn thông qua phương pháp tạo đám hoại tử, dẫn đến việc tạo ra chủng 12.1.7.
Năm 1973, Yu và cs sử dụng chủng 2.8 bắt nguồn từ chủng 12.1.7 đượctiếp tục giảm độc lực bằng tia cực tím[6]
Năm 1974, Chen và Wang đã sử dụng kỹ thuật tạo đám hoại tử để chọn lọc một chủng vi rút thuần khiết về di truyền, nhằm sản xuất vắc xin Chủng vi rút này sau đó được dùng để sản xuất vắc xin thử nghiệm và tiến hành đánh giá lâm sàng trên 8000 trẻ em sống ở khu vực không có dịch bệnh Kết quả cho thấy có 50% trẻ em đã phát triển đáp ứng kháng thể.
Năm 1981, Yu và cộng sự đã chuyển chủng 2.8 bằng phương pháp tiêm dưới da cho chuột ổ, từ đó tạo ra chủng 12.4 với giảm độc lực cao Sau đó, tác giả tiếp tục lựa chọn và thuần khiết hóa để phát triển một chủng mới có khả năng nhân lên mạnh mẽ và tính miễn dịch cao hơn so với chủng ban đầu.
Li và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu vắc xin bất hoạt từ tế bào nuôi, bên cạnh việc phát triển vắc xin sống giảm độc lực Mặc dù loại vắc xin này an toàn, nhưng khả năng bảo vệ của nó thấp hơn so với vắc xin sống.
Kể từ năm 1968, công nghệ sản xuất vắc xin từ não chuột của Takaku đã trở thành công nghệ tiên tiến nhất Thử nghiệm thực địa cho thấy vắc xin này đạt tỷ lệ đáp ứng kháng thể lên đến 91% ở trẻ em tại Thái Lan Vắc xin được tiêm phòng ở nhiều quần thể dân cư tại Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan, cho thấy hiệu quả cao và không ghi nhận phản ứng phụ đáng kể cũng như không có trường hợp viêm não dị ứng sau khi tiêm.
Năm 1971, dưới sự chỉ đạo của Giáo sư Fukai, Viện Biken đã nghiên cứu và tinh chế vắc xin với độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn protein ≤ 80 àg/ml, phương pháp này vẫn được Tổ chức Y tế Thế giới công nhận là tiên tiến nhất Năm 1989, Việt Nam đã nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin VNNB từ não chuột (vắc xin JEVAX) Hiện nay, vắc xin thế hệ 2 được sản xuất trên tế bào ở nhiều quốc gia như Nhật, Áo, Ấn Độ, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam Vắc xin thế hệ 3, ứng dụng công nghệ gen, vẫn chủ yếu ở giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.
Hiện nay, có bốn loại vắc xin đang được sản xuất và sử dụng phổ biến, bao gồm: (1) Vắc xin bất hoạt trên não chuột với các chủng Nakayama và Beijing -1; (2) Vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero, bao gồm chủng Beijing -1 và SA14-14-2; (3) Vắc xin sống giảm độc lực trên tế bào PHK với chủng SA14-14-2; và (4) Vắc xin tái tổ hợp theo công nghệ khảm, như vắc xin chimeric – JE và YF-17D, cũng với chủng SA14-14-2.
Hiện nay, xu hướng toàn cầu đang chuyển dần sang công nghệ sản xuất vắc xin VNNB trên tế bào, với ba loại vắc xin được sản xuất theo phương pháp này, ngoại trừ loại đầu tiên được sản xuất trên não chuột Việt Nam và Hàn Quốc đã phát triển hai loại vắc xin dựa trên công nghệ này, thể hiện sự tiến bộ trong lĩnh vực sản xuất vắc xin.
Bảng 1 1 Các loại vắc xin VNNB và công nghệ sản xuất hiện nay
STT Tên VX Chủng vi rút Công nghệ
1 JE vaccinee GCC a Nakayama-NIH Não chuột Bất hoạt, dung dịch Green Cross,
2 JEVAX a Nakayama-NIH Não chuột Bất hoạt, dung dịch Vabiotech, Việt
3 Japanese encephalitis vaccinee Beijing-3 TB PHK Bất hoạt, dung dịch
Beijing, Inst of Biological Products
4 RS.JEV a SA-14-14-2 TB PHK Sống giảm độc lực, đông khô Chengdu, China
2Inactivated vaccinee SA-14-14-2 TB PHK Bất hoạt, dung dịch
Intercell AG (Biological E, WRAIR), Áo
6 JE-VC SA-14-14-2 TB Vero Sống giảm độc lực, đông khô
7 IC51 (hay IXIARO ®hay JESPECT®) SA-14-14-2 TB Vero Bất hoạt, hấp phụ Novatis
8 JEEV a SA-14-14-2 TB Vero Bất hoạt, hấp phụ B/E (Biological
SA-14-14-2 (chimeric Vero cell-derived-
TB Vero Sống giảm độc lực, đông khô
10 JENVAC 821564-XY TB vero Bất hoạt Bharat, India
287 Beijing-1 TB Vero Bất hoạt, đông khô Kaketsuken,
12 BK-VJE Beijing-1 TB Vero Bất hoạt, đông khô Biken (Japan)
13 JECEVAX (*) Beijing-1 TB Vero Bất hoạt Vabiotech, Việt
(a): Các vắc xin đã và đang lưu hành ở VN
(*): Vắc xin đã xong các nghiên cứu trên lâm sàng và đang hoàn thiện các thủ tục đăng ký xin cấp phép lưu hành
Việt Nam đã triển khai vắc xin VNNB JEVAX trong chương trình tiêm chủng mở rộng quốc gia từ năm 1991, góp phần làm giảm đáng kể số ca nhiễm vi rút VNNB.
Bảng 1 2 Tỷ lệ mắc VNNB ở bệnh nhân VNVR năm 1991-2019
Năm Số mẫu xét nghiệm Số mẫu (+) với VNNB Tỷ lệ (+) VNNB (%)
(Nguồn: TCMRQG trong báo cáo hội nghị TCMRQG 2020)
Qua bảng 1.2 để thấy rõ vai trò của vắc xin trong công tác phòng bệnh với vi rút VNNB của VN
1.2.2 Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào
Trung Quốc là quốc gia tiên phong trong việc nghiên cứu và sản xuất vắc xin trên tế bào, và hiện tại, Nhật Bản cũng đã đạt được thành công trong công nghệ này.
Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản
1.3.1 Chủng vi rút Nakayama-NIH
Nhật Bản là quốc gia đầu tiên phân lập vi rút VNNB vào năm 1935 từ một trẻ em mắc bệnh, và đã đặt tên cho chủng vi rút này là Nakayama Ngoài ra, Nhật Bản cũng là nước tiên phong trong việc sản xuất vắc xin phòng bệnh VNNB, với chủng Nakayama được chọn làm chủng chính để sản xuất vắc xin từ các mẫu vi rút phân lập được trong nước.
Nghiên cứu của Aizawa và cộng sự, cũng như Han và cộng sự, đã chỉ ra sự khác biệt trong đáp ứng kháng thể giữa chủng Nakayama-NIH và nhiều chủng khác thông qua kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT) Dựa trên những phát hiện này, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn 5 chủng để tiến hành sản xuất vắc xin, bao gồm Nakayama-NIH, Nakayama Yokken, JaGar-01, Yokoshiba (YS) và T8.
Chủng Nakayama-NIH và Nakayama Yokken có nguồn gốc giống nhau, nhưng được sử dụng cho mục đích khác nhau: Nakayama-NIH cho vắc xin người và Nakayama Yokken cho vắc xin động vật Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng Nakayama-NIH đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn sản xuất vắc xin tại Nhật Bản Kể từ năm 1989, cả hai chủng Nakayama-NIH và Beijing-1 đã được sử dụng song song để sản xuất vắc xin phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu Ngoài Nhật Bản, chủng Nakayama cũng được lựa chọn để sản xuất vắc xin cho người tại một số quốc gia như Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Chủng Beijing-1 được phân lập từ người vào năm 1949 tại Bắc Kinh, Trung Quốc, và đã được cấy truyền 70 đời, đạt tiêu chuẩn tương tự như chủng Nakayama Do đó, chủng Beijing-1 đã được sử dụng để sản xuất vắc xin trong nhiều năm Từ năm 1989, Nhật Bản đã bắt đầu sử dụng chủng Beijing-1 cùng với chủng Nakayama – NIH để sản xuất vắc xin VNNB phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.
Nghiên cứu của Kurane và Takasaki cho thấy vắc xin VNNB từ hai chủng Nakayama và Beijing-1 đạt tỷ lệ đáp ứng miễn dịch 94% sau ba mũi tiêm, với trí nhớ miễn dịch kéo dài ít nhất ba năm Các vắc xin này có khả năng trung hòa tất cả năm genotype của vi rút viêm não Nhật Bản, chứng minh rằng vi rút chỉ tồn tại một serotype, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất vắc xin Hơn nữa, chủng Beijing-1 tạo ra kháng thể trung hòa cao hơn so với chủng Nakayama và các chủng khác.
Cả ba chủng SA14-14-2, Nakayama và Beijing-1 đều cho thấy khả năng tạo miễn dịch bảo vệ chống lại các chủng virus VNNB hoang dại Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng vắc xin từ chủng Beijing-1 có thể tạo ra đáp ứng kháng thể đạt 100% đối với cả hai chủng Nakayama và Beijing-1.
Nghiên cứu của Ku và cs (1994) đã kết luận vắc xin sản xuất từ chủng Beijing-
Vắc xin này có khả năng tạo ra kháng thể cao và miễn dịch chéo rộng đối với các chủng virus như JaGar-01 và E-50, với hiệu giá kháng thể vượt trội so với vắc xin được sản xuất từ chủng Nakayama.
Bộ Y tế và Bộ Ngoại giao Nhật Bản đã chấp nhận rằng chủng Beijing-1 tạo ra kháng thể trung hòa cao và có khả năng phản ứng chéo rộng với tất cả các chủng virus VNNB ở các khu vực khác nhau Vì lý do này, từ năm 1989, chủng Beijing-1 đã được chọn thay thế chủng Nakayama để sản xuất vắc xin VNNB Tại châu Á, cả hai chủng Nakayama và Beijing-1 đều được lựa chọn do khả năng nhân lên nhạy trên não chuột và phản ứng chéo với các chủng khác Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Beijing-1 có hiệu giá cao hơn và khả năng phản ứng chéo rộng hơn với các chủng VNNB lưu hành so với chủng Nakayama.
Châu Á là khu vực có tỷ lệ lưu hành cao của bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB), do đó, việc giám sát dịch tễ học bệnh này ngày càng trở nên quan trọng Nghiên cứu về miễn dịch chéo giữa các chủng VNNB cũng cần được thúc đẩy để nâng cao hiệu quả phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh.
Nhiều nhà sản xuất, trong đó có Việt Nam, hiện đang lựa chọn chủng Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB do các đặc điểm nổi bật của nó Các chủng VNNB lưu hành tại Việt Nam thuộc genotype III, tương đồng với các chủng được sử dụng trong sản xuất vắc xin như Beijing-1, Nakayama, SA14-14-2, và Beijing-3.
Hình 1.3 Một số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1
Chủng vi rút VNNB nguyên thủy SA, được phân lập từ muỗi vào năm 1954, đã trải qua quá trình nghiên cứu và phát triển tại Trung Quốc từ năm 1959 đến 1981, dẫn đến việc tạo ra chủng vi rút sống giảm độc lực Ban đầu, chủng nguyên thủy được cấy truyền 110 lần trên trứng gà có phôi và 100 lần trên tế bào thận chuột Hamster, sau đó được chọn lọc để loại bỏ yếu tố gây độc thần kinh, tạo ra chủng giảm độc lực đầu tiên mang ký hiệu 12.1.7 Năm 1973, Yu và cộng sự tiếp tục giảm độc lực bằng tia cực tím, cho ra đời chủng 12.8 Đến năm 1974, Chen và Wang đã sử dụng kỹ thuật tạo đám hoại tử để chọn lọc chủng vi rút thuần khiết về di truyền, qua đó phát triển chủng giảm độc lực đầu tiên phục vụ cho sản xuất vắc xin trong thử nghiệm lâm sàng.
Khoảng 8000 trẻ em sống ở khu vực không có dịch lưu hành, trong đó 50% trẻ có đáp ứng kháng thể Năm 1984, nhóm nghiên cứu của Yu đã tiêm chủng 12.8 qua đường dưới da cho chuột sơ sinh, dẫn đến việc phát triển chủng 12.4 với độc lực giảm Sau đó, tác giả tiếp tục chọn lọc thuần khiết để tạo ra một chủng có khả năng nhân lên mạnh mẽ hơn và tính miễn dịch cao hơn so với chủng ban đầu.
Vắc xin vi rút VNNB sống giảm độc lực đầu tiên được phát triển và cấp phép tại Trung Quốc vào năm 1988, dựa trên chủng JEV SA14 giảm độc lực SA14-14-2 Vắc xin này được sản xuất trên dòng tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK).
Vắc xin thế hệ thứ hai này có hiệu quả bảo vệ cao, với tỷ lệ miễn dịch đạt 85% - 99% sau một liều và 98% sau hai liều Kháng thể trung hòa vẫn tồn tại trong gần 90% trường hợp sau 4 năm từ liều đơn Vắc xin đã được chứng minh là an toàn, với tỷ lệ sốt thoáng qua chỉ 5-10% và phát ban hoặc khó chịu ở mức 1-3%, không ghi nhận trường hợp quá mẫn trong hơn 1 triệu trẻ em sau tiêm Vắc xin đã được cấp phép tại nhiều quốc gia châu Á như Ấn Độ, Nepal, Thái Lan, Sri Lanka, Hàn Quốc, Campuchia, Myanmar và Việt Nam Gần đây, SA14-14-2 đã được đưa vào chương trình tiêm chủng quốc gia ở Nepal và Trung Quốc, trong khi Ấn Độ cũng đã triển khai vắc xin này trong dự án thí điểm năm 2006 cho trẻ em ở các khu vực lưu hành VNNB đặc biệt.
Tại Tây Bengal và Karnataka, một chiến dịch tiêm chủng đồng loạt đã được triển khai nhằm bảo vệ trẻ em từ 9 tháng đến 15 tuổi Chiến dịch này bao gồm việc tiêm 2 liều cơ bản dưới da, cách nhau 1 năm, cùng với liều tăng cường khi trẻ đến tuổi nhập học Năm 2013, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận vắc xin SA14-14-2, do Viện Sản phẩm Sinh học Chengdu sản xuất, vào danh sách các vắc xin đạt tiêu chuẩn chất lượng.
Các khuyến cáo của TCYTTG cho sản xuất và kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt[22]
vắc xin VNNB bất hoạt[22]
1.4.1 Yêu cầu chung trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt
Quy trình sản xuất phải đạt GMP cho sản xuất các sản phẩm về thuốc và GMP cho các chế phẩm sinh học
Nhà xưởng sản xuất vắc xin VNNB phải tuân thủ tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp độ 2, do vi rút VNNB thuộc nhóm nguy cơ cấp độ 2 Những người tham gia vào quá trình sản xuất và kiểm định vắc xin cần được tiêm chủng vắc xin VNNB và có tỷ lệ kháng thể tối thiểu đạt ≥ 1:10.
Nguồn nguyên liệu để sản xuất vắc xin (chuột hay tế bào) phải được cấp phép và kiểm soát bởi cơ quan kiểm định quốc gia
1.4.2 Yêu cầu đối với nguồn nguyên liệu đầu vào: Đối với chuột hay tế bào sử dụng để sản xuất chủng:
Chuột được sử dụng để nhân chủng virus VNNB phục vụ sản xuất vắc xin phải là những con khỏe mạnh, từ 5 tuần tuổi, không có bệnh lý, và được kiểm soát chặt chẽ Những con chuột này phải được cấp phép bởi cơ quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền, đảm bảo không có tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn, ký sinh trùng và virus Ngoài ra, môi trường sống và tiếp xúc của chuột cũng cần được kiểm soát để đảm bảo vệ sinh và an toàn Huyết thanh của chuột phải chứng minh không có kháng thể chống lại các virus gây bệnh cho chuột.
Việc kiểm tra chất lượng chuột trong sản xuất cần thực hiện trên một nhóm chuột đại diện Quá trình này bao gồm việc theo dõi và quan sát sức khỏe của chuột hàng ngày, tuy nhiên không nhất thiết phải tiến hành tất cả các bài kiểm tra Thay vào đó, cần chú ý đến tần suất, số lượng sử dụng và các dấu hiệu bệnh lý để đảm bảo chất lượng chuột phục vụ sản xuất.
Khi một con chuột bị ốm hoặc chết, cần phải tiến hành nghiên cứu cẩn thận để xác định nguyên nhân Trong trường hợp này, sản xuất phải tạm dừng và báo cáo đầy đủ cho cơ quan quốc gia có thẩm quyền Quá trình sản xuất chỉ được phép khởi động lại khi đã xác định được nguyên nhân, có phương án giải quyết và bằng chứng rõ ràng để kiểm soát các nguy cơ, đồng thời phải chờ phê duyệt và cấp phép từ cơ quan có thẩm quyền.
Việc sản xuất vắc xin trên não chuột đòi hỏi phải có phương pháp và quy trình gây nhiễm cũng như thu hoạch virus được đăng ký và phê duyệt bởi cơ quan quốc gia có thẩm quyền.
Tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK)
Tế bào thận tiên phát được sử dụng trong sản xuất vắc xin, và cả loại động vật lẫn mô tế bào tiên phát đều cần được phê duyệt bởi cơ quan quốc gia có thẩm quyền.
Chuột Hamster được sử dụng để lấy mô tế bào thận nhằm sản xuất vắc xin vi rút VNNB phải đến từ các đàn chuột khỏe mạnh, từ 10-14 ngày tuổi và không có bệnh lý Những con chuột này phải được kiểm soát chặt chẽ và cấp phép bởi cơ quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền Đặc biệt, vùng lấy tế bào cần được kiểm tra kỹ lưỡng về dấu hiệu bệnh lý, và quy trình sản xuất tế bào phải tuân thủ các tiêu chuẩn an toàn, chất lượng, cũng như tiêu chuẩn GMP, được phê duyệt bởi cơ quan có thẩm quyền.
Tế bào PHK được lấy từ mô thận chuột Hamster cần được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo tiêu chuẩn vô trùng, không có tác nhân vi rút ngoại lai, độ sống của tế bào đạt yêu cầu (%), và không bị nhiễm Mycoplasma Tất cả các quy trình này phải được phê duyệt bởi cơ quan quốc gia có thẩm quyền.
Nếu tế bào thường trực được dùng để sản xuất vắc xin VNNB, thì ngân hàng tế bào gốc (MCB) và ngân hàng tế bào sản xuất (WCB) cần được quản lý chặt chẽ và phải tuân thủ các tiêu chuẩn về nguồn gốc động vật cho sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ con người.
MCB và WCB phải tuân thủ giới hạn cấy chuyển tối đa cho phép, đồng thời cần thực hiện kiểm tra Mycoplasma, tính vô trùng, tác nhân ngoại lai, khả năng sinh khối u trên động vật, độ sống sót và sự ổn định di truyền (bao gồm các đặc tính sinh hóa, miễn dịch và di truyền) Tất cả các quy trình này phải được phê duyệt và cấp phép bởi cơ quan kiểm định quốc gia có thẩm quyền.
Môi trường sử dụng trong sản xuất vắc xin VNNB
Các loại môi trường nuôi cấy như MEM và TCM199 cần phải là những sản phẩm chuyên dụng, được chứng nhận chất lượng từ nhà sản xuất Đối với các môi trường do nhà sản xuất tự nghiên cứu và sản xuất, cần đảm bảo tuân thủ đầy đủ các tiêu chuẩn quy định về hóa chất dùng trong sản xuất chế phẩm sinh học cho con người.
Trước khi sử dụng huyết thanh và trypsin trong nuôi cấy tế bào, cần kiểm tra để đảm bảo tính vô trùng, không có Mycoplasma và không chứa tác nhân hoặc virus ngoại lai.
Huyết thanh người không được khuyến khích sử dụng, trong khi Albumin huyết thanh người có thể được áp dụng nếu nó đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn cho sản phẩm từ máu dành cho người.
Kháng sinh như Penicillin và các beta-lactams khác không nên sử dụng do tính nhạy cảm cao với virus và khả năng gây phản vệ cho người dùng vắc xin Tuy nhiên, các kháng sinh khác có thể được áp dụng trong quá trình sản xuất, nhưng cần kiểm soát ảnh hưởng và đảm bảo hàm lượng tồn dư trong giới hạn an toàn của sản phẩm cuối cùng.
Các cơ chất khác có thể được sử dụng, nhưng cần kiểm soát hàm lượng trong giới hạn an toàn cho sản phẩm cuối cùng Chẳng hạn, chỉ thị pH không độc như Phenol đỏ phải có hàm lượng ≤ 0,002%.
Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam
xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam
Quá trình thiết lập ngân hàng chủng cho sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero, cụ thể là chủng Beijing-1 (JECEVAX), được thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau.
Giai đoạn 1 tập trung vào nghiên cứu và thiết lập hệ thống ngân hàng chủng, đồng thời xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero từ năm 2006 đến 2012, thuộc đề tài cấp Bộ Y tế.
Từ năm 2006 đến 2010, Vabiotech tiến hành nghiên cứu để thích ứng chủng vi rút Beijing-1 trên tế bào Vero, nhằm tạo ra chủng vi rút đủ tiêu chuẩn cho việc phát triển và sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt.
Từ tháng 4/2010, VABIOTECH đã bắt đầu thiết lập chủng gốc và chủng sản xuất để tiến hành thử nghiệm các loạt vắc xin, nhằm xây dựng quy trình sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero.
Giai đoạn 2 bao gồm việc sử dụng hệ thống chủng đã được thiết lập để sản xuất các loạt vắc xin phục vụ cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I, II, IIB & III tại Việt Nam từ năm 2013 đến 2018, thuộc đề tài cấp Nhà nước Trong giai đoạn này, cũng tiến hành kiểm tra và đánh giá tính ổn định của chủng beijing-1 và vắc xin JECEVAX sau khi sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm.
Giai đoạn 3: Tổng hợp các dữ liệu đã có để hoàn thiện, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho ngân hàng chủng sản xuất, vắc xin
Ngân hàng chủng vi rút đóng vai trò quan trọng trong sản xuất vắc xin, đảm bảo nguồn nguyên liệu liên tục Nghiên cứu này tập trung vào chủng Beijing-1, được nhận từ viện Kanonji, Trường đại học Osaka, Nhật Bản, đã trải qua 41 đời cấy chuyển (P41) để tạo ra chủng an toàn và hiệu quả Chủng Beijing-1 hiện đang được sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB tại Nhật Bản Tại Việt Nam, chủng Beijing-1 P41 được coi là P0 và tính đến năm 2020, đã trải qua thêm 7 đời cấy chuyển, tương ứng với P48 từ chủng gốc, với đời đầu tiên (P1) kích ứng trên não chuột và các đời tiếp theo được nhân lên trên tế bào Vero.
Hình 1 6 Sơ đồ thiết lập ngân hàng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất
Tại thời điểm nghiên cứu năm 2017, lô chủng gốc BV-MSV-0210 có số đời cấy chuyển là 6 lần, tương ứng với đời số P47 từ chủng chuẩn gốc Beijing-1 Kanonji, trong khi lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 có số đời cấy chuyển là 7 lần, tương ứng với đời số P48 từ cùng chủng chuẩn gốc.
Sau khi hoàn thành nghiên cứu và xây dựng ngân hàng chủng cho sản xuất vắc xin, việc thiết lập tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm tra chất lượng chủng là rất quan trọng Điều này sẽ giúp các nhà sản xuất khẳng định được chất lượng của hệ thống chủng sử dụng, đảm bảo an toàn và hiệu quả cho vắc xin.
1 ml/tuýp, Hiệu giá 1,75 10 7 PFU/ml Cấy chuyển trên tế bào Vero
2 ml/tuýp, Hiệu giá 2,6.10 9 PFU/ml Cấy chuyển 1 lần trên tế bào Vero
Hiệu giá 1,6.10 9 PFU/ml Cấy chuyển 1 lần trên não chuột
1 ml/tuýp, Hiệu giá 1,4 10 7 PFU/ml Cấy chuyển trên tế bào Vero
1 ml/tuýp, Hiệu giá 2,5 10 6 PFU/ml Cấy chuyển trên tế bào Vero
1 ml/tuýp, Hiệu giá 1,8 10 7 PFU/ml Cấy chuyển trên tế bào Vero
Chủng P7 (48) (Chủng sản xuất BV-WSV-0310)
1 ml/tuýp, Hiệu giá 3,93 10 7 PFU/ml Bảo quản nitrogen lỏng
Chủng P6 (47) (Chủng gốc BV-MSV-0210)
Sản phẩm vắc xin được sản xuất từ 1 ml/tuýp với hiệu giá 8,72.10^7 PFU/ml, cấy chuyển trên tế bào Vero, đảm bảo chất lượng vắc xin Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm tra chất lượng, cùng với đánh giá tính ổn định hiệu giá và di truyền của chủng qua các đời cấy chuyển, giúp nhà sản xuất hoàn thiện hồ sơ sản phẩm cho phê duyệt thử nghiệm lâm sàng và đăng ký lưu hành Các nghiên cứu này được thực hiện độc lập, theo phương pháp hồi cứu, tiến cứu hoặc kiểm chứng kết quả đã công bố, nhằm khẳng định chất lượng và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng theo quy định cho ngân hàng chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero.
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu và cỡ mẫu : Chủng vi rút Viêm não Nhật bản(Beijing-1, nguồn gốc từ Viện Kanonji thuộc Trường đại học Osaka, Nhật Bản)
- Lô chủng gốc (BV-MSV-0210)
- Lô chủng sản xuất (BV-WSV-0310)
Vắc xin Viêm não Nhật Bản: Vắc xin JECEVAX(vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero, chủng Beijing-1 do Vabiotech sản xuất)
Bảng 2.1 Cỡ mẫu sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mẫu Thời gian sản xuất Số lượng (lọ)
1 Lô chủng gốc (BV-MSV-0210) 2/2010 30
2 Lô chủng sản xuất (BV-WSV-0310) 3/2010 50
Hình 2.1 Hình ảnh ống chủng Beijing-1 và vắc xin JECEVAX Địa điểm nghiên cứu:
- Phòng thí nghiệm, QC, QM của công ty VABIOTECH
- Phòng thí nghiệm của Khoa VR Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương (NIHE);
- Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học
- Phòng thí nghiệm của Khoa KĐVX Vi rút, NICVB
Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị
Bảng 2 2 Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu
STT Sinh phẩm Hãng/nguồn gốc
Beijing-1, nguồn gốc từ Viện Kanonji thuộc Trường đại học Osaka, Nhật Bản
3 Ngân hàng tế bào Vero Vabiotech (mua từ ATCC)
4 Ngân hàng tế bào BHK21 Vabiotech(mua từ ATCC)
5 Ngân hàng tế bào MRC5 Vabiotech(mua từ ATCC)
6 Kháng huyết thanh VNNBsản xuất từ chuột Swiss Vabiotech
7 Sinh phẩm ELISA-Ag Vabiotech
8 Bộ sinh phẩm QIAamp®Viral RNA mini Qiagen
9 Bộ sinh phẩm Super Scrip TM one-step with Platium taq Invitrogen
10 Bộ sinh phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ABI
Bảng 2.3 Môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Môi trường, hóa chất Hãng
1 Canh thang Thioglycolate (FTM: Thioglycolate Fluid Medium) Sigma
2 Môi trường MEM(Minimum Essential Medium) Gibco
3 Dung dịch nhuộm cố địnhCrystal violet 5% VABIOTECH
4 Huyết thanh bào thai bê(FBS) Gibco-Thermo
5 Dung dịch Trypsin – EDTA Gibco-Thermo
8 Dung dịch PBS, pH 7 VABIOTECH
9 Thạch PPLO(pleuropneumonia-like organisms) HiMedia
Bảng 2 4 Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu
1 Máy đo nhiệt độ thỏ có độ chính xác 0,1 o C Ellab
2 Tủ nuôi cấy tế bào JISICO
5 Pipet tự động, bán tự động DRUMMOND
7 Kính hiển vi soi ngược OLYMPUS
9 Cân động vật(0-420g cho chuột nhắt; 0-2100g cho chuột lang) SATORIUS
10 Máy ly tâm lạnh BECKMAN
11 Nồi hấp vô trùng HIRAYAMA
12 Máy ly tâm Eppendorf EPPENDORF
13 Máy rửa bản ELISA SANOFI
14 Máy đọc kết quả ELISA SANOFI
15 Máy ủ 4 tấm Sanofi IPS SANOFI
16 Máy khuấy từ MIDI MR1 IKA
17 Máy đo pH Thermo FNH
18 Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM BioRad
19 Máy giải trình tự gen NGS ThermoFisher
20 Máy ủ nhiệt khô MS0030 BioRad
21 Cân phân tích (0,082-220g) XSR204 Mettler toledo
22 Cân phân tích (sai số 4 chữ số) Satorius, Đức
23 Máy đo tỷ trọng Anton Paar (Đức)
Bảng 2 5 Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu
Giống Trọng lượng Số lượng Giới tính
Chuột nhắt ổ 1-3 ngày tuổi Swiss/ICR / 80 con Đực và cái
Chuột nhắt trắng 3 tuần tuổi Swiss/ICR 11-13 g 600 con Đực và cái Chuột nhắt trắng 4 tuần tuổi Swiss/ICR 17-22 g 350 con Đực và cái
Chuột lang Việt Nam 250 – 450 g 40 con Đực và cái
Thỏ Newzealand 1,8 – 2,5 kg 60 con Đực và cái
Thiết kế nghiên cứu
Sơ đồ hình 2.2 tóm tắt các thử nghiệm kiểm tra chất lượng cho các chủng MSV, WSV và vắc xin JECEVAX Nghiên cứu được thực hiện trên hai nhóm đối tượng, bao gồm chủng vi rút VNNB với lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô sản xuất BV-MSV-0310, cùng với 10 lô vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX.
Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu
Hiệu giá và ổn định về hiệu giá Ổn định di truyền
Biến số và nội dung nghiên cứu
Bảng 2 6 Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310
TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn viện dẫn
Nhận dạng chủng MSV và WSV với kháng thể đặc hiệu
ELISA TCCS; DĐ Châu Âu, 2018; WHO
Nhận dạng và xác định tính ổn định di truyền của chủng MSV và
Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
3 Tương đồng nucleotide Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
4 Tương đồng protein Giải trình tự gen
TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
5 Hiệu giá vi rút trên tế bào Tạo đám hoại tử PFU TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điển
6 Hiệu giá vi rút trên động vật thí nghiệm Thử trên não chuột nhắt TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điển
7 Nhiệt độ bảo quản phù hợp
Hiệu giá chủng được kiểm tra sau khi bảo quản ở các dải nhiệt độ khác nhau, trong các khoảng thời gian khác nhau
8 Vô trùng Cấy trực tiếp trên môi trường
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
Cấy trên môi trường PPLO lỏng I, II, thạch PPLO DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;
10 Vi rút ngoại lai trên chuột nhắt Thử trên chuột nhắt (tiêm não và phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;
11 Vi rút ngoại lai trên chuột nhắt ổ Thử trên chuột nhắt ổ (tiêm não và phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;
12 Vi rút ngoại lai trên chuột lang Thử trên chuột lang (tiêm phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;
13 Vi rút ngoại lai trên tế bào Tế bào Vero, BHK21, MRC5 DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;
Bảng 2.7 Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX
TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận Tiêu chuẩn viện dẫn
1 Cảm quan Quan sát bằng mắt thường
Dung dịch trong suốt, đồng nhất và không có vật thể lạ
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
2 Thể tích Cân và đo tỷ trọng ≥ 1,0 ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
OD, = 415nm (DĐVN IV, 2009, PL15.29)
≤ 120 àg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Chõu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
Thuốc thử Ditizon, đo OD, = 480 nm (DĐVN IV, 2009, PL15.25)
≤ 10 àg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Chõu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
PCR/ phương pháp lai điểm ≤ 10 ng/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
7 Hàm lượng protein tổng số Lowry ≤ 80 àg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Chõu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
Cấy trực tiếp trên môi trường
Thioglycholate và soybean casein (DĐVN IV, 2009, PL15.7)
Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
9 An toàn chung DĐVN IV, 2009,
Trong vòng 7 ngày theo dõi toàn bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và không có biểu hiện bệnh lý hoặc nhiễm độc
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
10 Chất gây sốt Tiêm tĩnh mạch tai thỏ, DĐVN V, 2009,
Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤ 0,6 0 C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1,3 0 C
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
11 Công hiệu Phương pháp trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT 50 )
≥ 1,3 log PRNT 50 /ml; hoặc công hiệu tương quan của vắc xin thử so với vắc xin mẫu chuẩn ≥ 1,0
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5)
2.5.1 Kiểm định vi rút ngoại lai
Kiểm định vi rút ngoại lai là tiêu chuẩn quan trọng để đảm bảo chất lượng của vi rút dùng trong sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản Phương pháp kiểm định này bao gồm việc thử nghiệm trên động vật thí nghiệm và tế bào.
Các dòng tế bào như Vero, MRC5 và BHK-21 được sử dụng để kiểm định vi rút ngoại lai Để kiểm tra chủng vi rút Viêm não Nhật Bản, vi rút này được trung hòa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu và sau đó cấy 3 ml vào 5 chai tế bào thử nghiệm.
Tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 36,5 0,5 o C trong 14 ngày, trong đó quá trình theo dõi đám hoại tử (CPE) diễn ra vào các ngày 1, 4, 7, 11 và 14 dưới kính hiển vi soi ngược Sau thời gian nuôi cấy, nước nổi trong các chai tế bào được loại bỏ để kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu Kết quả cho thấy chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai khi không phát hiện tế bào bị hủy hoại (CPE) và không có vi rút hấp phụ hồng cầu.
Kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thí nghiệm được thực hiện với 20 chuột nhắt trắng tiêm não, 10 chuột nhắt trắng tiêm phúc mạc, 20 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm não, 10 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm phúc mạc và 5 chuột lang tiêm phúc mạc Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiêm cho động vật thử nghiệm Quá trình theo dõi bao gồm tăng trưởng cân nặng và các dấu hiệu bệnh lý bất thường sau tiêm Để đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai, chủng vi rút Viêm não Nhật Bản cần phải đáp ứng các tiêu chí nhất định trong thí nghiệm trên động vật.
Chuột nhắt: không có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý sau 21 ngày theo dõi
Chuột ổ: không có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi
Chuột lang: không có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý, giải phẫu bệnh không thấy tổn thương phủ tạngsau 42 ngày theo dõi
Kiểm định vô khuẩn là quy trình quan trọng để đảm bảo rằng chủng vi rút Viêm não Nhật Bản dùng trong sản xuất vắc xin không bị nhiễm các tác nhân vi khuẩn hoặc nấm Huyền dịch vi rút được cấy trên môi trường Thioglycolate theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam 5, 2017, và được ủ ở nhiệt độ 32,5±2,5°C và 22,5±2,5°C trong 14 ngày Trong suốt thời gian này, môi trường nuôi cấy được theo dõi hàng ngày, với các kết quả được ghi nhận vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn vào các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14.
Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt tiêu chuẩn vô khuẩn khi cả hai loại môi trường nuôi cấy đều trong suốt, không bị đục và môi trường Thioglycolate không mất lớp chỉ thị màu ở phía trên Điều này chứng tỏ rằng không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.
Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được sử dụng để sản xuất vắc xin đã được kiểm định nhận dạng bằng kỹ thuật ELISA trực tiếp Kỹ thuật này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể IgG chuột chống vi rút VNNB chủng Beijing-1 gắn vào phiến và kết hợp với kháng nguyên vi rút VNNB trong mẫu thử Sau đó, cộng hợp IgG chuột kháng Beijing-1 gắn enzyme peroxidase tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên - cộng hợp Khi thêm cơ chất OPD, enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu, giúp xác định sự hiện diện của vi rút.
Màu sắc xuất hiện trong quá trình thử nghiệm cho thấy đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên, từ đó cho phép xác định nồng độ kháng nguyên trong mẫu thử thông qua cường độ màu Để đo lường, mật độ quang học (OD) được thực hiện trên máy đọc ELISA ở bước sóng 490/620nm.
Các giá trị OD của mẫu thử và mẫu chuẩn được biểu diễn qua đồ thị logarit, với độ pha loãng trên trục tung và các giá trị OD trên trục hoành Kết quả nhận dạng được xác định dựa vào các yếu tố chứng âm và Blank không có màu; mẫu thử và mẫu chuẩn phải có màu vàng, và OD của mẫu thử phải lớn hơn hoặc bằng 10 lần OD của Blank để được coi là dương tính.
2.5.4 Đánh giá ổn định di truyền
Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được sử dụng trong sản xuất vắc xin đã được đánh giá về tính tương đồng di truyền thông qua kỹ thuật giải trình tự gen.
Bộ gen được sử dụng trong kiểm định này là đoạn gen E, bao gồm trình tự nucleotide và trình tự acid amin được tổng hợp từ gen này Kết quả giải trình tự gen của các đợt đánh giá trên chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản đã được so sánh với kết quả giải trình tự gen ngay sau khi sản xuất, cũng như so sánh với chủng Beijing – Kanonji và các chủng vi rút Viêm não Nhật Bản phân lập từ người, lợn và muỗi tại Việt Nam trong giai đoạn 1964 đến 2014 Quy trình giải trình tự gen E của chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2.
RNA tổng số được tách chiết và tinh chế từ mỗi mẫu bằng QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) Vùng gen E được khuếch đại thông qua RT-PCR với bộ kit OneStep PCR Kit (Qiagen), sử dụng cặp mồi được thiết kế bằng chương trình Primer-Blast dựa trên trình tự gen E của virus Viêm não Nhật Bản Cặp mồi có trình tự như sau:
Chương trình PCR bao gồm bốn bước: bước 1 ở 50°C trong 30 phút, bước 2 ở 95°C trong 15 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với nhiệt độ 94°C trong 1 phút, 50°C trong 1 phút, và 72°C trong 1 phút Cuối cùng, bước 3 duy trì ở 72°C trong 10 phút và bước 4 giữ sản phẩm ở 4°C cho tới khi sử dụng Vùng gen E được khuếch đại với độ dài lý thuyết 1500 bp và sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% Sản phẩm PCR được tinh chế bằng QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) để chuẩn bị cho việc giải trình tự Giải trình tự gen được thực hiện bằng bộ Kit Applied Biosystems™ Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher) và máy giải trình tự ABI 3500 tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
Hình 2 3 Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản
Trình tự gen E được phân tích bằng các phần mềm như Blast, CLC Generation Workbench, Aliview, BioEdit và MEGA6.0 để đánh giá sự tương đồng và xây dựng cây phả hệ giữa 2 chủng Beijing-1 với chủng chuẩn cùng các chủng virus VNNB được phân lập từ người, lợn và muỗi tại Việt Nam trong giai đoạn 1964-2014 Phân tích epitope kháng nguyên của vùng gen E được thực hiện theo phương pháp của Luca et al (2012).
Bảng 2 8.Thông tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt
Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu
STT Số đăng ký trong GenBank Năm phân lập Vật chủ
Chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản đã được kiểm tra sự ổn định về hiệu giá trong khoảng thời gian từ 2010 đến 2020, với các lô chủng được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau như ≤ -60 o C, -20 o C, và 2-8 o C Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chủng được thực hiện theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và TCYTTG, nhằm đảm bảo chất lượng cho việc sản xuất vắc xin sử dụng cho người Hiệu giá vi rút được xác định thông qua phương pháp nuôi cấy trên tế bào (PFU) và thử nghiệm trên động vật (LD50).
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào
