Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút beijing 1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não nhật bản bất hoạt trên tế bào vero tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Huỳnh Thị Phương Liên PGS.TS Đinh Duy Kháng Hà Nội, 2022 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới: Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ nhiều suốt trình làm nghiên cứu sinh Viện Tôi xin trân trọng cảm ơn tới thầy cô, anh chị Cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình làm nghiên cứu sinh Viện Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, TS Đoàn Hữu Thiển tạo điều kiện cho thực nghiên cứu tham gia khóa đào tạo này; Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Huỳnh Thị Phương Liên, PGS.TS Đinh Duy Kháng, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu viết luận án; Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi rút, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế tạo điều kiện hỗ trợ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập; Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình tơi, nơi cho tơi thêm sức mạnh vượt qua khó khăn suốt q trình học tập nghiên cứu Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực Các số liệu chưa công bố cơng trình nghiên cứu khoa học khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỜ THỊ x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Vi rút Viêm não Nhật Bản 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc 1.1.2 Kháng nguyên yếu tố độc lực vi rút 1.1.3 Sự nhân lên vi rút tế bào 1.1.4 Dịch tễ học phân tử vi rút Viêm não Nhật Bản 1.2 Vắc xin Viêm não Nhật Bản 1.2.1 Lịch sử phát triển vắc xin VNNB .9 1.2.2 Sự phát triển vắc xin Viêm não Nhật Bản tế bào 13 1.2.3 Các biến thể di truyền kháng nguyên vi rút VNNB việc tiêm phòng[34] 15 1.2.4 Đánh giá chất lượng an tồn tính sinh miễn dịch vắc xin 16 1.3 Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản 20 1.3.1 Chủng vi rút Nakayama-NIH 20 1.3.2 Chủng vi rút Beijing-1 20 1.3.3 Chủng SA14-14-2 22 1.3.4 Chủng Beijing-3 24 1.3.5 Dịng tế bào ni cấy (nhân) vi rút 26 1.4 Các khuyến cáo TCYTTG cho sản xuất kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt[22] 27 1.4.1 Yêu cầu chung sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt 27 1.4.2 Yêu cầu nguồn nguyên liệu đầu vào: 28 1.5 Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt tế bào Vero Việt Nam .31 iii CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu .35 2.2 Vật liệu nghiên cứu 36 2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị 36 2.2.2 Động vật thí nghiệm 38 2.3 Thiết kế nghiên cứu 38 2.4 Biến số nội dung nghiên cứu 39 2.5 Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5) 41 2.5.1 Kiểm định vi rút ngoại lai .41 2.5.2 Kiểm định vô khuẩn 42 2.5.3 Nhận dạng .42 2.5.4 Đánh giá ổn định di truyền 42 2.5.5 Hiệu giá vi rút 45 2.5.6 Thử nghiệm công hiệu vắc xin 47 2.5.7 An toàn chung 48 2.5.8 An toàn đặc hiệu 49 2.5.9 Chất gây sốt .49 2.5.10 Hàm lượng Thimerosal 50 2.5.11 Hàm lượng Formaldehyde 50 2.5.12 Hàm lượng DNA tồn dư 50 2.5.13 Hàm lượng protein tổng số 52 2.5.14 pH 52 2.5.15 Cảm quan 52 2.6 Xử lý phân tích số liệu 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54 3.1 Kết nghiên cứu 54 3.1.1 Tính ổn định hiệu giá di truyền chủng Beijing-1 54 3.1.2 Tính an tồn sinh miễn dịch bảo vệ chủng lô vắc xin thành phẩm sản xuất từ chủng BV-WSV-0310 quy mơ phịng thí nghiệm .66 3.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Việt Nam .72 3.2 Bàn luận 74 iv 3.2.1 Tính ổn định hiệu giá, di truyền chủng vi rút Viêm não Nhật Bản sau sản xuất điều kiện bảo quản 74 3.2.2 Sự tương đồng kháng nguyên chủng sản xuất vắc xin VNNB so với chủng Viêm não Nhật lưu hành Việt Nam 81 3.2.3 Tính an tồn tính sinh miễn dịch JECEVAX sản xuất từ chủng BVWSV-0310 quy mơ phịng thí nghiệm 88 3.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero (JECEVAX) 93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Adverse events (biến cố bất lợi) BYT Bộ Y tế BHK-21 Baby Hamster Kidney – 21 (Tế bào thận chuột Hamter sơ sinh) BR209 Beijing reference (Vắc xin mẫu chuẩn Beijing-1) CF Complement Fixation (Cố định bổ thể) CPE Cytopathic effect (hiệu gây độc/hủy hoại tế bào) CV Challenge virus (vi rút thử thách) E Envelope protein (Protein vỏ) FTM Fluid Thioglycollate Medium (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) HA Haemagglutinin Assay (thử nghiệm ngưng kết hồng cầu) HI Haemagglutinin inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) HT Huyết HLKN Hàm lượng kháng nguyên HGKTTH Hiệu giá kháng thể trung hòa IC51 Vắc xin VNNB tế bào vero Intercell – Áo JEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột Việt Nam JECEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất tế bào vero Việt Nam JE-MB Vắc xin VNNB sản xuất não chuột Nhật Bản KT Kháng thể MRC5 Tế bào phôi phổi bào thai người NICVB Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm Y tế (National Institute for Control of Vaccines and Biologicals) NS Non structural Protein (Protein không cấu trúc) NSX Nhà sản xuất vi NT Neutralization test (thử nghiệm trung hòa) PHK Primary Hamster kidney (thận chuột Hamster tiên phát) PreM Premium membrane (Protein tiền màng) PRNT50 Plaque reduction neutralization test (Trung hòa giảm 50% đám hoại tử) TCCS Tiêu chuẩn sở TCYTTG/WHO Word Health Organization (Tổ chức Y tế giới) THGĐHT Trung hòa giảm đám hoại tử TNLS Thử nghiệm lâm sàng TNMD Thử nghiệm miễn dịch VNNB Viêm não Nhật Bản VABIOTECH Công ty TNHH MTV vắc xin sinh phẩm số VERO Verda Reno (Tế bào thường trực thận khỉ xanh châu Phi) VX Vắc xin vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các loại vắc xin VNNB công nghệ sản xuất .12 Bảng Tỷ lệ mắc VNNB bệnh nhân VNVR năm 1991-2019 .13 Bảng 2.1 Cỡ mẫu sử dụng nghiên cứu 35 Bảng 2 Sinh phẩm sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.3 Mơi trường, hóa chất sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 2.4 Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 2.5 Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 2.6 Chỉ tiêu nghiên cứu lô chủng gốc BV-MSV-0210 lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 39 Bảng 2.7 Chỉ tiêu nghiên cứu vắc xin JECEVAX 40 Bảng 2.8 Thông tin trình tự vùng gen E chủng vi rút VNNB phân lập Việt Nam năm khác từ vật chủ khác sử dụng nghiên cứu 45 Bảng 3.1 Kết nhận dạng chủng gốc chủng sản xuất phương pháp ELISA 54 Bảng 3.2 Kết kiểm tra LD50 não chuột Swiss chủng gốc BVMSV-0210 56 Bảng 3.3 Kết kiểm tra LD50trên não chuột Swiss chủng sản xuất BVWSV-0310 .56 Bảng 3.4 Kết kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) tế bào BHK21 57 Bảng 3.5 Kết kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) tế bào BHK21 .57 Bảng 3.6 Tỷ lệ tương đồng nucleotide protein gen mã hóa kháng nguyên E chủng gốc (BV-MSV-0210) chủng sản xuất (BV-WSV-0310) so với trình tự vùng gen E chủng virút VNNB phân lập Việt Nam năm khác từ vật chủ khác 61 Bảng 3.7 Vị trí epitope vị trí axit amin định tính kháng nguyên thuộc epitope protein E chủng sản xuất (BV-WSV-0310), chủng tham chiếu (Beijing-1 Kanonji), chủng vi rút VNNB phân lập người năm 2014 chủng vắc xin SA14-14-2 62 viii HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN TẾ BÀO CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1.1 Pha loãng mẫu thử - Pha loãng mẫu thử bậc 10 tuýp Eppendorf, ví dụ sau: Tuýp số Độ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 pha loãng Mẫu thử (ml) 0,1 0,1 Dung dịch 0,9 LE+BA (ml) 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,9 1.2 Gây nhiễm tế bào + Gây nhiễm phiến tế bào giếng: - Đánh dấu độ pha giếng - Hút bỏ môi trường nuôi cấy giếng - Cấy 200 l hỗn dịch virus pha loãng (03 độ pha cuối) vào giếng, độ pha giếng + Cho tất phiến cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút Cứ 30 phút láng lần 1.3 Phủ thạch nhuộm cố định tế bào 1.3.1 Phủ thạch - Cho ml môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcelluse vào giếng - Ủ phiến ngày tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) 1.3.2 Cố định nhuộm tế bào - Hút bỏ môi trường nuôi cấy giếng - Cho 0,5 ml dung dịch nhuộm cố định vào ủ 30 - 45 phút nhiệt độ phòng 20 – 25oC - Rửa phiến vòi nước chảy Để khô đọc kết KẾT QUẢ - Đếm số plaque có giếng: plaque đốm trắng nhìn thấy mắt thường mặt đáy giếng - Dùng bút đánh dấu đếm plaque ghi số plaque đọc nắp giếng - Tính kết trung bình tất giếng 2.1.Tính kết - Cơng thức tính: Hiệu giá virus (PFU/ml) = a/b.c Trong đó: a: Số plaque trung bình; b: Độ pha loãng; c: số ml hỗn dịch virus cấy - Ví dụ: độ pha 10-5: Giếng 1: 167 plaques Giếng 2: 165 plaques Số plaque trung bình: 166 plaque Hiệu giá virus (PFU/ml) = 166 /(10-5x 0,2) = 8,3 x107 (PFU/ml) 2.2 Tiêu chuẩn chấp nhận - Hiệu giá virus bán thành phẩm thô vắc xin VNNB ≥ 107 (PFU/ml) - Hiệu giá virus chủng virus thử thách (CV) VNNB ≥ 105 (PFU/ml) - Hiệu giá virus chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB ≥ 106(PFU/ml) AN TOÀN CHUNG a Chuẩn bị mẫu thử - Lấy đủ số lượng mẫu theo yêu cầu - Mẫu dạng dung dịch: Hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu thử nghiệm bơm tiêm vô trùng - Mẫu dạng đơng khơ: Hồn ngun với dung dịch nước hồi chỉnh hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu thử nghiệm bơm tiêm vô trùng - Trường hợp mẫu cần pha loãng: Pha loãng mẫu nồng độ yêu cầu hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu thử nghiệm bơm tiêm vô trùng b Chuẩn bị chuột - Chuột nhắt chuột lang thí nghiệm cho ăn, uống đầy đủ trước tiêm - Chuột cần kiểm tra trước tiêm để đảm bảo hồn tồn bình thường - Cân, ghi trọng lượng đánh dấu (bằng phẩm mầu) trước lúc tiêm vào biểu mẫu ghi chép c Tiến hành tiêm - Sát trùng vùng bụng động vật thí nghiệm bơng cồn - Tiêm vào phúc mạc chuột d Liều tiêm Nguyên tắc chung: Tiêm phúc mạc chuột lang liều tiêm cho người không 5ml/con tiêm phúc mạc chuột nhắt liều tiêm cho người khơng 1ml/con; Chuột chứng không tiêm - trừ số vắc xin sinh phẩm đặc biệt thực theo chuyên luận riêng cho vắc xin, sinh phẩm e Theo dõi động vật sau thí nghiệm - Hàng ngày theo dõi, cân trọng lượng vào định - Thời gian theo dõi: - 14 ngày (tùy vắc xin, sinh phẩm) f Đánh giá kết  Thử nghiệm coi có giá trị tuân thủ qui trình; Chuột chứng khỏe mạnh lên cân bình thường  Tiêu chuẩn đánh giá kết Vắc xin, sinh phẩm coi đạt yêu cầu vịng ngày theo dõi tồn động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân khơng có biểu bệnh lý nhiễm độc (có trạng thái bất thường (*), giảm hoạt động, giảm cân chết nhiễm độc) (*): Trạng thái bất thường: Là trạng thái, dấu hiệu bệnh lý không giống mô tả đặc trưng (thường gặp) vắc xin, sinh phẩm thử nghiệm Nếu nhóm chuột đối chứng khỏe mạnh lên cân bình thường, nhóm chuột tiêm vắc xin, sinh phẩm có chuột bị chết hay sút cân có biểu bất thường trình theo dõi (7 ngày), phải tiến hành rà sốt lại yếu tố, điều kiện thử nghiệm kèm theo mổ chuột để xem tổn thương thực thể lấy mẫu bệnh phẩmxác định nguyên nhân CHẤT GÂY SỐT Nguyên vật liệu, điều kiện tiến hành - Động vật thử nghiệm: lựa chọn thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực (không mang thai) Trọng lượng 1.5 – 2.5kg nuôi dưỡng thức ăn không chứa chất kháng sinh, không tụt cân suốt tuần trước thử nghiệm khơng có biểu bệnh lý Cho thỏ nhịn ăn uống nước đầy đủ thời gian 18 (qua 1đêm) khơng cho uống nước thời gian làm thử nghiệm - Thử nghiệm tiến hành phòng yên tĩnh, sẽ, tránh tiếng động ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết thử nghiệm nhiệt độ phòng không chênh lệch 30C so với nơi cũ Quy trình thử nghiệm - Thử nghiệm thăm dị: ngày trước tiến hành tiêm sinh phẩm cần kiểm tra tính nhạy cảm cho thỏ thử nghiệm cách tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 10ml/ kg trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0.9% không chứa chất gây sốt làm ấm lên khoảng 38.50C Ghi nhiệt độ trước tiêm tiếp tục vòng 3h sau tiêm dung dịch nước muối sinh lý Nếu thỏ có nhiệt độ dao động >0.60C bị loại khơng đưa vào thử nghiệm Nhiệt độ dao động thỏ nhiệt độ tăng giảm sau tiêm so với nhiệt độ ban đầu - Thử nghiệm chính: thỏ thí nghiệm thỏ đạt yêu cầu thử nghiệm thăm dò, để lồng chuyên dụng 60 phút để ổn định Sau tiến hành đo nhiệt độ thỏ lần lần cách 30 phút (nếu đo tay) theo chương trình cài đặt (nếu đo thiết bị) Nhiệt độ ban đầu thỏ giá trị trung bình lần đo Tiêu chuẩn đưa thỏ vào thí nghiệm thỏ có nhiệt độ chênh lệch lần đo không 0.20C nhiệt độ ban đầu nằm khoảng 380C đến 39.80C Mỗi mẫu thử tiêm cho nhóm gồm thỏ nhiệt độ chênh lệch nhóm khơng q 10C - Sau theo dõi, nhóm thỏ đạt yêu cầu tiêm mẫu thử vào tĩnh mạch rìa tai thỏ Thể tích tiêm cho thỏ tương ứng với 1ml/kg cân nặng Nên làm ấm dung dịch tới 38.50C trước tiêm Đo nhiệt độ thỏ khoảng thời gian tùy thuộc vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay 1giờ đo lần, dùng thiết bị tùy thuộc vào chương trình cài đặt) - Nhiệt độ tối đa nhiệt độ cao đo khoảng thời gian Đánh giá thử nghiệm - Đáp ứng thỏ hiệu số nhiệt độ tối đa sau tiêm mẫu thử nhiệt độ ban đầu - Đáp ứng thỏ nhiệt độ tối đa sau tiêm thấp nhiệt độ ban đầu - Mẫu thử đạt yêu cầu chất gây sốt nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 0.60C tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 1.30C - Mẫu thử không đạt yêu cầu chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ > 2.40C - Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ nằm khoảng từ lớn 1.3 0C đến 2.40C thử nghiệm phải tiến hành thỏ khác Mẫu thử đạt yêu cầu chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ ≤ 30C Nếu > 4.10C coi không đạt yêu cầu - Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ nằm khoảng từ lớn 30C đến 4.10C làm thêm lần cuối thỏ khác Mẫu thử đạt yêu cầu chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ ≤ 4.90C Nếu > 4.90C coi không đạt yêu cầu THỬ NGHIỆM CÔNG HIỆU Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bất hoạt xác định dựa việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm miễn dịch chuột Cụ thể: Huyết sau tiêm trung hòa với vi rút thử thách (CVS) sau gây nhiễm lên tế bào Vero BHK-21 dòng tế bào phù hợp khác 1.1 Nguyên vật liệu, dụng cụ 1.1.1 Ngun vật liệu - Mơi trường pha lỗng MEM 2% FBS (GIBCO/Sigma) - Môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcellulose(GIBCO/Sigma) - Dung dịch PBS 0,02% gelatin, pH 7,4 - Dung dịch nhuộm cố định Crystal violet - Huyết chứng dương (Vabioteach) - Tế bào Vero BHK-21 - Chủng vi rút viêm não Nhật Bản làm việc giữ -700C - Vắc xin chuẩn - Vắc xin Viêm não Nhật Bản thử nghiệm - Chuột trắng Swiss giống chuột phù hợp khác, 11-14g; khoẻ mạnh; 32 (16 cho vắc xin thử, 16 cho vắc xin chuẩn) làm chứng 1.1.2 Dụng cụ trang thiết bị - Phiến 24 giếng đáy (Corning) - Cốc thuỷ tinh to (Schott Duran): 1L & 2L - Giấy dán phiến - Pipet nhựa vô trùng loại 10ml, 25 ml (Corning) - Tuýp nhựa 15 ml, 50 ml, tuýp eppendorf - Bơm tiêm nhựa vô trùng 3ml (Việt Nam) - Pipet-aid, pipet-man loại 20 µl, 200µl, 1000µl (Eppendorf) - Chai lọ thuỷ tinh (Schott Duran) loại 50ml, 500ml, 1000ml vô trùng - Hốt Laminar (Nuare ClassII) - Tủ ấm CO2(Sanyo-2172) - Bể ổn nhiệt(CHCL-Lab, No0301299) - Máy ly tâm lạnh (Marathol 2100R) - Kính hiển vi phản pha.(Olympus-CK2) - Máy lắc (IKA) 1.2 Các bước tiến hành 1.2.1 Pha vắc xin gây miễn dịch - Pha vắc xin chuẩn vắc xin mẫu thử dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32 - Vắc xin pha phải bảo quản nhiệt độ 2-8oC 1.2.2 Tiêm miễn dịch - Mỗi mẫu vắc xin tiêm phúc mạc cho nhóm chuột gồm 16 con, 0,5 ml bơm tiêm nhựa vô khuẩn với mũi, mũi cách ngày - Một nhóm chuột khơng tiêm dùng làm chứng âm 1.2.3 Lấy máu chuột, tách huyết - ngày sau tiêm mũi thứ 2, toàn chuột lấy máu tim riêng rẽ Máu chứa tuýp eppendorf - Ủ tuýp máu 37oC / 60 phút - Để tủ lạnh 4oC qua đêm - Ly tâm mẫu máu 3000 vòng/ phút x 30 phút nhiệt độ 4oC - Chắt lấy huyết sang tuýp eppendorf mới, lượng huyết cần lấy tuýp 200µl - Huyết chuẩn chia ngẫu nhiên thành nhóm nhóm tuýp, sau chúng hộn chung vào tuýp ký hiệu RA RB - Huyết thử chia ngẫu nhiên thành nhóm nhóm tuýp sau chúng hộn chung vào tuýp ký hiệu VA VB - Huyết chuột chứng hộn chung thành týp ký hiệu CA (-) - Tất huyết bất hoạt 56oC /30 phút - Bảo quản - 20 oC làm thử nghiệm trung hoà 1.2.4 Pha loãng huyết - Huyết chuẩn huyết thử pha lỗng mơi trường MEM 2% FBS để có độ pha 1/80 1/160 1/320 - Pha huyết chứng dương để có độ pha loãng 1/80 1/160 - Pha huyết chứng âm để có độ pha lỗng pha 1/10 - Pha loãng huyết chứng âm 1/10:0,5 ml huyết + 4,5 ml MEM 2%FBS 1.2.5 Pha chủng vi rút viêm não thử thách có hiệu giá là: 100- 200PFU/ 200µl Ký hiệu chủng độ pha là: CV 1.2.6 Trung hoà huyết vi rút - Lấy ml độ pha huyết chuẩn bị mục 5.3.4 trộn với ml chủng CV; ml chủng CV trộn với ml MEM 2% FBS - Đặt vào bể ổn nhiệt 37oC / 90 phút - Lấy ra, làm lạnh nước đá 1.2.7 Gây nhiễm tế bào Vero BHK-21 - Tế bào nuôi cấy lớp phiến giếng - Hút bỏ môi trường nuôi cấy giếng cho khoảng 0,5 ml/giếng - Đánh dấu độ pha giếng - Nhỏ 200µl hỗn dịch (huyết + vi rút) vào giếng Mỗi nồng độ cấy giếng; Hỗn dịch CV- MEM 2% FBS nhỏ 10 giếng - Để phiến tủ ấm 37OC, 5%CO2 90 phút để vi rút tiếp xúc với tế bào 1.2.8 Phủ thạch - Cho vào giếng ml môi trường thạch MEM 1% Methylcellulose - Ủ 37oC/5%CO2 4-5 ngày 1.2.9 Cố định nhuộm tế bào - Ngày thứ hút hết môi trường giếng - Cho vào giếng ml dung dịch nhuộm - Để phiến nhiệt độ phòng 15-20 phút - Rửa phiến vòi nước - Đếm plaque mắt thường 1.2.10 Đọc tính kết Theo phần mềm cơng thức tính hiệu giá kháng thể trung hồ: * Tỉ lệ giảm đám hoại tử tính theo cơng thức: S: số plaque trung bình nồng độ huyết pha CV số plaque trung bình CV/giếng * Hiệu giá kháng thể trung hoà tính theo cơng thức sau: Z: logarit hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử thử nghiệm x: số nghịch đảo độ pha loãng 1.3 Đánh giá thử nghiệm Thử nghiệm có giá trị khi: - Khơng có dấu hiệu tế bào bị nhiễm khuẩn hay nấm mốc giếng - Số plaque trung bình 10 giếng chứng nằm khoảng 50-150 - Hiệu giá huyết chứng dương ≥ 1,5 - Hiệu giá huyết chứng âm ≤ Phụ lục ... bào Vero Vi? ??t Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chủng (chủng gốc chủng sản xuất) vi rút Beijing- 1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt tế bào Vero Vi? ??t Nam Nội dung nghiên. .. tiêu chuẩn mang tính đặc thù riêng cho sản phẩm Chính lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing- 1 để ứng dụng sản xuất vắc xin vi? ?m não Nhật Bản bất hoạt tế bào. .. độc lực vi rút 1. 1.3 Sự nhân lên vi rút tế bào 1. 1.4 Dịch tễ học phân tử vi rút Vi? ?m não Nhật Bản 1. 2 Vắc xin Vi? ?m não Nhật Bản 1. 2 .1 Lịch sử phát triển vắc xin VNNB