Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN5283 2018 Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5283 2018 ISO 13904 2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN Animal feeding stuffs Det[.]
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5283:2018 ISO 13904:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN Animal feeding stuffs - Determination of tryptophan content Lời nói đầu TCVN 5283:2018 thay TCVN 5283:2007; TCVN 5283:2018 hoàn toàn tương đương với ISO 13904:2016; TCVN 5283:2018 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F17 Thức ăn chăn nuôi biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố THỨC ĂN CHĂN NI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN Animal feeding stuffs - Determination of tryptophan content Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng tryptophan (Trp) tổng số tự thức ăn chăn ni (ví dụ: thức ăn hồn chỉnh thức ăn bổ sung, nguyên liệu thô, thành phần thức ăn thức ăn đậm đặc) xác định tryptophan tự tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại Tiêu chuẩn không phân biệt dạng D- L- Nguyên tắc Để xác định tryptophan tổng số, thủy phân mẫu môi trường kiềm dung dịch bari hydroxit bão hịa làm nóng đến 110 °C 20 h Sau thủy phân, bổ sung chất nội chuẩn Để xác định tryptophan tự do, chiết mẫu môi trường axit nhẹ với có mặt chất nội chuẩn Đối với tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại, bổ sung chất nội chuẩn sau chiết Tryptophan chất nội chuẩn dịch thủy phân dịch chiết xác định sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) C18 pha đảo với detector huỳnh quang Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác 3.1 Nước cất hai lần, nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 µS/cm) 3.2 Chất chuẩn chất kiểm soát: tryptophan (độ tinh khiết ≥ 99 %) làm khô điều kiện chân không phospho pentoxit Hai sản phẩm coi tinh khiết 100 % Chất kiểm soát phải đến từ nhà sản xuất khác với nhà sản chất chuẩn (xem 3.17.2) CHÚ THÍCH: Kiểm sốt độ tinh khiết chất chuẩn cách đo độ hấp thụ dung dịch tryptophan bước sóng 280 nm Chuẩn bị dung dịch có nồng độ khoảng mg/ml HCl 10 -3 N từ dung dịch gốc mật độ quang (OD) bước sóng 280 nm so với HCl 10 -3 N Sau tính nồng độ tryptophan cơng thức: C = OD/5 630 × 10+06 Trong 630 hệ số tắt phân tử tryptophan nước bước sóng 280 nm; C biểu thị µmol/l Độ tinh khiết chất chuẩn (C/C0) × 100 C0 nồng độ lý thuyết dung dịch pha lỗng, biểu thị µmol/l (khoảng 25 µmol/l) Kiểm sốt độ tinh khiết sau tháng sử dụng; độ tinh khiết phải ≥ 99 % 3.3 Chất nội chuẩn: α-metyltryptophan (độ tinh khiết ≥ 99 %), làm khô điều kiện chân LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn không qua phospho pentoxit 3.4 Bari hydroxit ngậm tám phân tử nước Cẩn thận không để bari hydroxit ngậm tám phân tử nước [Ba (OH) 2.8 H2O] tiếp xúc lâu với khơng khí để tránh hình thành BaCO3, điều gây cản trở cho việc xác định (xem B.3) 3.5 Natri hydroxit 3.6 Axit orthophosphoric, w = 85 % 3.7 Axit clohydric đặc, ρ20= 1,19 g/ml 3.8 Metanol, loại dùng cho HPLC 3.9 Dầu nhẹ, có dải sơi từ 40 °C đến 60 °C 3.10 Dung dịch natri hydroxit, c = mol/l Hòa tan 40,0 g dung dịch natri hydroxit (NaOH) (3.5) nước (3.1) thêm nước (3.1) đến lít 3.11 Axit clohydric, c = mol/l Lấy 492 ml axit clohydric (HCl) đặc (3.7) thêm nước (3.1) đến lít 3.12 Axit clohydric, c = mol/l Lấy 82 ml axit clohydric (HCl) (3.7) thêm nước (3.1) đến lít 3.13 Axit clohydric, c = 0,1 mol/l Lấy 8,2 ml axit clohydric (3.1) thêm nước (3.1) đến lít 3.14 Axit orthophosphoric, c = 0,5 mol/l Lấy 34 ml axit orthophosphoric (3.6) thêm nước (3.1) đến lít 3.15 Dung dịch chuẩn tryptophan dung dịch kiểm sốt (3.2) đặc, c = 0,50 g/l Hịa tan 0,25 g tryptophan (3.2) (được cân xác đến 0,1 mg) axit clohydric (3.13) đựng bình định mức 500 ml, thêm axit clohydric (3.13) đến vạch Bảo quản nhiệt độ -18 °C tối đa bốn tuần 3.16 Dung dịch nội chuẩn đặc, c = 0,54 g/l Hịa tan 0,27 g α-metyltryptophan (3.3) (cân xác đến 0,1 mg) axit clohydric (3.13) đựng bình định mức 500 ml thêm axit clohydric (3.13) đến vạch Bảo quản nhiệt độ -18 °C tối đa bốn tuần 3.17 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tryptophan chất nội chuẩn 3.17.1 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn dùng để phân tích tryptophan thức ăn chăn nuôi, (c = 0,010 g/l) Lấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đặc (3.15) 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc (α-metyltryptophan) (3.16) Pha loãng nước (3.1) metanol (3.8) đến thể tích nồng độ metanol (10 % đến 30 %) kết thúc thủy phân Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng Trong trình chuẩn bị, bảo vệ dung dịch tránh ánh nắng trực tiếp 3.17.2 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tryptophan dùng để phân tích tryptophan tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại, (c = 0,010 g/l) Lấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đặc (3.15) 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc (α-metyltryptophan) (3.16) Pha loãng axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đựng bình định mức 100 ml Thêm axit clohydric đến vạch Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng Trong trình chuẩn bị, bảo vệ dung dịch tránh ánh nắng trực tiếp Để kiểm tra xác nhận dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, sử dụng dung dịch kiểm sốt tryptophan Dung dịch kiểm sốt chuẩn bị phân tích dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, phải lấy từ nhà sản xuất khác với nhà sản xuất chất chuẩn (3.2) Độ thu hồi tryptophan mẫu dung LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn dịch kiểm soát phải từ 99 % đến 101 % 3.18 Etanolamin > 98 % 3.19 Dung dịch 1,1,1-Triclo-2-metyl-2-propanol Cho g 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol vào 100 ml metanol (3.8) CHÚ THÍCH: Dung dịch 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol (3.19) coi độc hại môi trường cần xử lý thải bỏ đặc biệt 3.20 Pha động dùng cho HPLC Hòa tan 3,00 g axit axetic 900 ml nước (3.1) thêm 50,0 ml dung dịch 1,1,1-triclo-2-metyl-2propanol (3.19) Chỉnh pH đến 5,00 etanolamin (3.18) Thêm nước (3.1) đến 000 ml Thời hạn sử dụng pha động (đặc biệt ổn định hỗn hợp axit axetic etanolamin) phải kiểm tra thời gian lưu Xem thêm Phụ lục B pha động thay thế: Hỗn hợp đệm phosphat metanol rẻ độc hơn; khơng cần chỉnh pH Hỗn hợp ổn định Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Thiết bị HPLC, có detector đo phổ huỳnh quang 4.2 Cột sắc ký lỏng, kích thước 125 mm x mm, C18, nhồi hạt cỡ µm, tương đương 4.3 Máy đo pH 4.4 Bình polypropylen, dung tích 125 ml, cổ rộng nắp vặn 4.5 Bộ lọc màng xenlulose axetat (cỡ lỗ 0,45 µm 0,22 µm) 4.6 Nồi hấp áp lực, có khả trì nhiệt độ (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar] Có thể sử dụng đĩa có nắp đậy kín đặt nồi có khả trì đến nhiệt độ (110 ± 2) °C 4.7 Máy lắc học máy khuấy từ 4.8 Máy trộn Vortex, 4.9 Bộ lọc thủy tinh 4.10 Bình nón (Erlen meyers) chia vạch, dung tích 200 ml, 250 ml, 600 ml 4.11 Bình định mức, dung tích 100 ml, 500, 000 ml (tất loại A) Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Thức ăn chăn nuôi Nghiền mẫu cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm Các mẫu có độ ẩm cao làm khơ khơng khí nhiệt độ khơng q 50 °C làm đơng khơ trước nghiền Các mẫu có hàm lượng chất béo cao phải chiết dầu nhẹ (3.9) trước nghiền 5.1.2 Các tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại Nghiền mẫu cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 0,25 mm đồng hóa kỹ mẫu nghiền 5.2 Xác định tryptophan tự (dịch chiết) 5.2.1 Thức ăn chăn ni Cân lượng thích hợp (từ g đến g) mẫu chuẩn bị (5.1.1), xác đến mg vào bình nón Thêm 100,0 ml axit clohydric (3.13) 5,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc (3.16) Sử dụng máy lắc học máy khuấy từ (4.7) lắc trộn 60 Để lắng dùng pipet lấy 10,0 ml dịch phía cho vào cốc có mỏ Thêm ml axit orthophosphoric (3.14) Chỉnh pH đến 3,0 natri hydroxit (3.10) Cho metanol (3.8) đủ để có nồng độ metanol từ 10 % đến 30 % thể tích cuối Chuyển lượng thích hợp dung dịch vào bình định mức thêm nước (3.1) đến thể tích cần thiết cho phép đo sắc ký [thể tích tương tự dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.1)] Lọc vài mililit dung dịch qua lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm 0,22 µm (4.5) trước bơm vào cột HPLC Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Bảo vệ dung dịch chuẩn dịch chiết tránh ánh nắng trực tiếp Nếu khơng thể phân tích dung dịch thủy phân ngày bảo quản dung dịch nhiệt độ °C tối đa ba ngày 5.2.2 Các tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại Cân từ 0,5 g đến g mẫu đồng (5.1.2), tùy thuộc vào nồng độ dự kiến tryptophan mẫu thử (ví dụ: xem Phụ lục C), xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 000 ml Thêm axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đến vạch Hỗn hợp khuấy 30 máy lắc học máy khuấy từ (4.7) Để lắng Chuyển ml dung dịch suốt vào bình định mức 100 ml Thêm ml chất nội chuẩn đặc (3.16) Thêm axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đến vạch Dung dịch thử pha lỗng phải có nồng độ tryptophan gần với nồng độ tryptophan dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2) nồng độ chất nội chuẩn phải tương tự (c = 0,010 g/l) nồng độ chất nội chuẩn dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (c = 0,010 g/l, 3.17.2) Xem Phụ lục A ví dụ việc chuẩn bị mẫu thử Lọc vài mililit dung dịch qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm 0,22 µm (4.5) trước bơm vào cột HPLC Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4 Bảo vệ dung dịch chuẩn dịch chiết tránh ánh nắng trực tiếp Nếu khơng thể phân tích ngày bảo quản dịch chiết nhiệt độ °C tối đa ba ngày 5.3 Xác định tryptophan tổng số (dịch thủy phân) Cân từ 0,1 g đến g mẫu chuẩn bị (5.1.1), xác đến 0,2 mg, cho vào bình polypropylen (4.4) Phần mẫu thử cân phải có hàm lượng nitơ khoảng 10 mg Thêm 8,4 g bari hydroxit octahydrat (3.4) 10 ml nước (3.1) Trộn máy trộn Vortex (4.8) máy khuáy từ (4.7) Để khuấy từ nam châm bọc teflon hỗn hợp Rửa thành bình ml nước (3.1) Đậy kín bình vặn nắp Chuyển bình sang nồi hấp áp lực (4.6) hấp 30 đến 60 Đậy nồi hấp áp lực hấp nhiệt độ (110 ± 2) °C 20 h Trước mở nồi hấp áp lực, giảm nhiệt độ vừa 100 °C Để tránh kết tinh Ba(OH) 2.8H2O, thêm 30 ml nước (3.1) nhiệt độ phòng vào hỗn hợp ấm Lắc khuấy nhẹ bình Thêm 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc (α-metyltryptophan) (3.16) Làm nguội bình bể nước/đá 15 Sau thêm ml axit orthophosphoric (3.14) Giữ bình bể làm mát trung hòa HCl mol/l (3.11) khuấy sử dụng HCl mol/l (3.12) chỉnh pH đến 3,0 Thêm metanol vừa đủ để có nồng độ metanol từ 10 % đến 30 % thể tích cuối Chuyển lượng dung dịch thích hợp vào bình định mức thêm nước (3.1) đến thể tích cần thiết để chạy sắc ký (ví dụ: 100 ml) Việc bổ sung metanol không tạo kết tủa Lọc vài mililit dung dịch qua lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm 0,22 µm (4.5) trước bơm lên cột HPLC Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4 Bảo vệ dung dịch chuẩn dịch thủy phân tránh ánh nắng trực tiếp Nếu khơng thể phân tích dịch thủy phân ngày bảo quản dịch thủy phân nhiệt độ °C tối đa ba ngày 5.4 Xác định HPLC Sử dụng điều kiện sau để rửa giải đẳng dòng; sử dụng điều kiện khác cho kết tương tự Cột sắc ký lỏng (4.2): Cột C18, kích thước 125 mm × mm, cỡ hạt µm tương đương Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng Pha động (3.20): Hòa tan 3,00 g axit axetic 900 ml nước (3.1) thêm 50,0 ml dung dịch 1,1,1triclo-2-metyl-2-propanol (3.19) Chỉnh pH đến 5,00 etanolamin (3.18) Thêm nước đến 000 ml Tốc độ dòng: ml/min Tổng thời gian chạy: Khoảng 34 Bước sóng detector: Kích thích: 280 nm; phát xạ: 356 nm Thể tích bơm: 20 µl Tính kết LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 6.1 Thức ăn chăn nuôi Hàm lượng tryptophan, w, tính gam 100 g mẫu, theo Cơng thức (1): (1) Trong đó: Ais,cal diện tích pic chất nội chuẩn dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.1); Atrp, sam diện tích pic tryptophan dịch chiết (5.2) dịch thủy phân (5.3); Vtrp thể tích dung dịch tryptophan đặc (3.15) thêm vào dung dịch chuẩn tryptophan (3.17.1), tính mililit (2 ml); ctrp nồng độ dung dịch tryptophan đặc (3.15) thêm vào dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (5.2.1), tính gam lít (g/l) Vis, sam thể tích dung dịch nội chuẩn đặc (3.16) thêm vào dịch chiết (5.2.1) (= 5,00 ml) dịch thủy phân (5.3) (= 2,00 ml), tính mililit (ml); Vis,cal thể tích dung dịch nội chuẩn đặc (3.16) thêm vào dung dịch hiệu chuẩn (3.17.1), tính mililit (= 2,00 ml); Ais,sam diện tích pic chất nội chuẩn dịch chiết (5.2.1) dịch thủy phân (5.3); Atrp,cal diện tích pic dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tryptophan (3.17.1); m khối lượng mẫu thử (được chỉnh khối lượng ban đầu sấy khơ và/hoặc khử chất béo), tính gam (g) 6.2 Các tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại 6.2.1 Dung dịch kiểm soát việc hiệu chuẩn Cần kiểm tra xác nhận chất lượng dung dịch Nếu dung dịch không phù hợp, phải chuẩn bị dung dịch (3.17.2) Sau bốn lần phân tích dung dịch thử phân tích dung dịch hiệu chuẩn 6.2.2 Tính kết Hàm lượng tryptophan, w, tính gam 100 g mẫu, tính theo Cơng thức (2): (2) Trong đó: Ais,cal diện tích pic chất nội chuẩn dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2); Ais,sam diện tích pic chất nội chuẩn dung dịch thử pha loãng (5.2.2); Atrp,sam diện tích pic tryptophan dung dịch thử pha lỗng (5.2.2); Atrp,cal diện tích pic tryptophan dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2); Ctrp nồng độ dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2), tính gam lít (g/l) m khối lượng mẫu thử, tính gam (g); d hệ số pha lỗng (xem Phụ lục C) Độ chụm 7.1 Phép thử liên phịng thử nghiệm 7.1.1 Thức ăn chăn ni Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử không áp dụng cho dải nồng độ mẫu khác với dải nồng độ mẫu nêu 7.1.2 Các tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan thương mại Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục D LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các giá trị thu từ phép thử khơng áp dụng cho dải nồng độ mẫu khác với dải nồng độ mẫu nêu 7.2 Độ lặp lại 7.2.1 Thức ăn chăn nuôi Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn lặp lại, r, nêu Bảng A.1 Bảng A.3 7.2.2 Các tryptophan tinh khiết premix chứa % tryptophan thương mại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn lặp lại, r, nêu Phụ lục D 7.3 Độ tái lập 7.3.1 Thức ăn chăn nuôi Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người thực khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp lớn giới hạn tái lập, R, nêu Bảng A.1 Bảng A.3 7.3.2 Các tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người thực khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp lớn giới hạn tái lập, R, nêu Phụ lục D Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu dùng, biết; c) phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không quy định tiêu chuẩn xem tùy chọn, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết thử nghiệm; e) kết thử nghiệm thu kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu Phụ lục A (Tham khảo) Các kết phép thử liên phòng thử nghiệm Một phép thử liên phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi liên minh Châu Âu tổ chức tiến hành phân tích ba mẫu gồm 12 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra, xác nhận phương pháp thủy phân Mỗi mẫu thực năm phép phân tích lặp lại Các kết nêu Bảng A.1 Bảng A.1 Mẫu Thức ăn cho lợn Mẫu Mẫu Thức ăn cho lợn có bổ Thức ăn đậm đặc sung L-tryptophan cho lợn Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết 12 12 12 Số lượng kết thử nghiệm từ phòng thử nghiệm lại 50 55 50 2,42 3,40 4,22 Giá trị trung bình, , g/kg LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Mẫu Mẫu Thức ăn cho lợn Mẫu Thức ăn cho lợn có bổ Thức ăn đậm đặc sung L-tryptophan cho lợn Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, g/kg 0,05 0,05 0,08 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,9 1,6 1,9 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr), g/kg 0,14 0,14 0,22 Độ lệch chuẩn tái lập, sR, g/kg 0,15 0,20 0,09 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 6,3 6,0 2,2 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR), g/kg 0,42 0,56 0,25 Các nghiên cứu cộng tác khác tiến hành phân tích hai mẫu gồm 13 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp chiết tryptophan tự Mỗi mẫu thực năm phép phân tích lặp lại Các kết nêu Bảng A.2 Bảng A.2 Mẫu Mẫu Hỗn hợp lúa mì đậu tương Hỗn hợp lúa mì đậu tương (= mẫu 4) có bổ sung tryptophan (0,457 g/kg) Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết 12 12 Số lượng kết thử nghiệm từ phòng thử nghiệm lại 55 60 0,391 0,931 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, g/kg 0,005 0,012 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,34 1,34 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr), g/kg 0,014 0,034 Độ lệch chuẩn tái lập, sR, g/kg 0,018 0,048 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 4,71 5,11 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR), g/kg 0,05 0,134 Giá trị trung bình, , g/kg Các phép thử liên phòng thử nghiệm khác tiến hành phân tích bốn mẫu gồm phịng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp thủy phân tryptophan Các kết nêu Bảng A.3 Mỗi mẫu thực năm phép phân tích lặp lại Bảng A.3 Mẫu Thức ăn hỗn hợp cho lợn (CRM 117) Mẫu Mẫu Bột cá có hàm Bột đậu tương lượng chất béo (CRM 119) thấp (CRM 118) Mẫu Bột sữa gầy (CRM 120) Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết 7 7 Số lượng kết thử nghiệm từ phòng thử nghiệm lại 25 30 30 30 2,064 8,801 6,882 5,236 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, g/kg 0,021 0,101 0,089 0,040 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,04 1,15 1,30 0,76 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr), g/kg 0,059 0,283 0,249 0,112 Giá trị trung bình, , g/kg LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Mẫu Mẫu Thức ăn hỗn hợp cho lợn (CRM 117) Mẫu Bột cá có hàm Bột đậu tương lượng chất béo (CRM 119) thấp (CRM 118) Mẫu Bột sữa gầy (CRM 120) Độ lệch chuẩn tái lập, sR, g/kg 0,031 0,413 0,283 0,221 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 1,48 4,69 4,11 4,22 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR), g/kg 0,087 1,156 0,792 0,619 Phụ lục B (Tham khảo) Các lưu ý phương pháp B.1 Các điều kiện sắc ký cụ thể sau giúp cho việc tách tryptophan α-metyl tryptophan tốt Việc rửa giải thực sau làm cột gradient: Cột sắc ký lỏng: Cột C18, kích thước 125 mm x mm, cỡ hạt µm tương đương Nhiệt độ cột: 32 °C Pha động: A: 0,001 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + (phần thể tích) B: metanol Chương trình gradient: 100% A 0%B 15 100 % A 0%B 17 60 % A 40 % B 19 60 % A 40 % B 21 100 % A 0%B 33 100% A 0%B Tốc độ dòng: 1,2 ml/min Tổng thời gian chạy: Khoảng 33 B.2 Việc chạy sắc ký thay đổi tùy theo loại HPLC vật liệu nhồi cột sử dụng Hệ thống chọn phải có khả tách đường tryotophan chất nội chuẩn Tuy nhiên, điều quan trọng sản phẩm phân hủy tách khỏi tryptophan chất nội chuẩn Dịch thủy phân không chứa chất nội chuẩn phải chạy sắc ký để kiểm tra đường tạp chất chất nội chuẩn Điều quan trọng thời gian chạy đủ dài để rửa giải tất sản phẩm phân hủy, ngồi pic rửa giải chậm cản trở việc chạy sắc ký sau Hệ thống sắc ký cần cho đáp ứng tuyến tính dải vận hành Đáp ứng tuyến tính phải đo nồng độ không đổi (chuẩn) chất nội chuẩn nồng độ khác tryptophan Điều quan trọng cỡ pic trytophan chất nội chuẩn nằm dải tuyến tính hệ thống HPLC/huỳnh quang Nếu pic tryptophan và/hoặc pic chất nội chuẩn thấp cao phải lặp lại phép phân tích với cỡ mẫu thay đổi thể tích cuối B.3 Nếu để q lâu, bari hydroxit trở nên khó hịa tan Điều dẫn đến dung dịch không phép xác định HPLC cho kết thấp tryptophan Phụ lục C (Tham khảo) Chuẩn bị mẫu thử: Ví dụ phép phân tích tryptophan tinh khiết premix Bảng C.1 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Dung dịch nội Nồng độ tryptophan tự Hệ số pha chuẩn đặc dự kiến dung loãng (3.16), dịch, d ml g/l Tryptophan tự dự kiến, Khối lượng mẫu, % g/1 000 ml - 10 5,00 g ml thành 100 ml 50 từ 0,002 đến 0,010 10 - 20 2,50 g ml thành 100 ml 50 từ 0,005 đến 0,010 20 - 40 1,25 g ml thành 100 ml 50 từ 0,005 đến 0,010 40 - 60 0,80 g ml thành 100 ml 50 từ 0,006 đến 0,009 60 - 80 0,60 g ml thành 100 ml 50 từ 0,007 đến 0,009 80 - 100 0,50 g ml thành 100 ml 50 từ 0,008 đến 0,010 Pha loãng Phụ lục D (Tham khảo) Các kết phép thử liên phòng thử nghiệm tryptophan tryptophan tinh khiết premix có chứa % tryptophan Năm 2011, so sánh liên phòng thử nghiệm tiến hành để đánh giá đặc tính hiệu phương pháp phương pháp phân tích xác định tryptophan tự tryptophan tinh khiết premix có % tryptophan thương mại Trong tổng số, mười sáu mẫu tương ứng có tám cặp mẫu mù gửi đến mười tám phòng thử nghiệm Mười bảy phòng thử nghiệm báo cáo kết mẫu Năm phòng thử nghiệm bị loại trừ khơng tn theo quy định Hàm lượng tryptophan thu vật liệu thử dải từ 1,26 g/100 g đến 49,99 g/100 g hỗn hợp premix từ 90,30 g/100 g đến 99,78 g/100 g tryptophan tinh khiết thương mại Các giá trị đo phù hợp với giá trị dự kiến đưa nhà sản xuất premix, ngoại trừ giá trị thấp (giá trị dự kiến sai mẫu premix 1) Bảng D.1 Tryptophan Premix Premix Premix Premix tinh khiết (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan tự 2,5 %) tự 10,0 %) tự 15,0%) tự 50,0%) tự 90,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 94,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 96,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 98,0%) Số lượng phòng thử nghiệm sau trừ ngoại lệ, p 12 11 12 11 12 11 12 11 Giá trị trung bình X, g/100 g 1,26 9,94 19,33 49,99 90,30 93,84 95,77 99,78 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, g/100 g 0,07 0,14 0,42 0,46 0,63 0,71 0,86 0,51 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CVr, (sr/X%) 5,26 % 1,38% 2,18 % 0,93 % 0,69 % 0,76 % 0,90 % 0,51 % Giới hạn lặp lại, r 0,19 0,38 1,18 1,30 1,75 1,99 2,42 1,42 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Tryptophan Premix Premix Premix Premix tinh khiết (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan (Tryptophan tự 2,5 %) tự 10,0 %) tự 15,0%) tự 50,0%) tự 90,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 94,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 96,0%) Tryptophan tinh khiết (Tryptophan tự 98,0%) Độ lệch chuẩn tái lập, sR, g/100 g 0,12 0,30 0,64 1,05 1,18 1,13 1,29 0,96 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CVR (sR/X%) 9,50 % 3,04 % 3,31 % 2,11 % 1,30% 1,20% 1,34% 0,96 % Giới hạn tái lập R, g/100 g 0,34 0,85 1,79 2,95 3,29 3,16 3,60 2,67 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Commission Directive 2000/45/EC of July 2000, establishing Community methods of analysis for the determination of vitamin A, vitamin E and tryptophan in feedingstuffs [2] Interlaboratory comparisons report from BIPEA: RCIL n° 2011-2012- 0334: Precision test “Determination of free tryptophan in premixes and pure products” LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 ... dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, sử dụng dung dịch kiểm sốt tryptophan Dung dịch kiểm soát chuẩn bị phân tích dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, phải lấy từ nhà sản xuất khác với nhà sản xuất chất chuẩn (3.2)... vạch Bảo quản nhiệt độ -18 °C tối đa bốn tuần 3.17 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tryptophan chất nội chuẩn 3.17.1 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn dùng để phân tích tryptophan thức ăn chăn nuôi, (c = 0,010... chuẩn (3.17.2) nồng độ chất nội chuẩn phải tương tự (c = 0,010 g/l) nồng độ chất nội chuẩn dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (c = 0,010 g/l, 3.17.2) Xem Phụ lục A ví dụ việc chuẩn bị mẫu thử Lọc vài mililit