KHOA HỌC CÔNG NGHỆ BỆNH CHẾT HÉO DO I\IẤM Ceratocystis manginecans GÂY HẠI CÀY XOAIXI TA Nguyễn Minh Chí1 TÓM TẮT 1 Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Xoan ta là loài[.]
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ BỆNH CHẾT HÉO DO I\IẤM Ceratocystis manginecans GÂY HẠI CÀY XOAIXI TA Nguyễn Minh Chí1 TĨM TẮT Xoan ta loài trồng phổ biến vùng Đông Bắc bộ, Tây Bắc bộ, Bắc Trung bộ, Nam Trung Tây Nguyên góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu gỗ nhiều năm qua Tuy nhiên, bệnh chết héo gây hại rừng trồng Xoan ta có xu hướng lan nhanh Nghiên cứu nhằm xác định triệu chứng, giám định lồi thử tính gây bệnh nấm gây chết héo rừng trồng Xoan ta tỉnh Hịa Binh Thanh Hóa Nấm gây bệnh chết héo rưng trồng Xoan ta với triệu chứng điền hình vị bị bệnh có vết loét, gỗ bị thâm đen xanh đen, sùi nhựa bọt nước Khi bị bệnh, tán héo dần từ xuống sau bị chết Kết giải trình tự gen cặp mồi pTla pTlb xác định mười mầu nấm gây bệnh chết héo rừng trồng Xoan ta tỉnh Hịa Binh Thanh Hóa lồi Ceratocystis manginecans Các mẫu nấm phân lập từ bị bệnh có tính gây bệnh trung binh đến mạnh đối vói Xoan ta năm tuổi Để quản lý hiệu bệnh chết héo rừng trồng Xoan ta, cần nghiên cứu bổ sung giải pháp quản lý phù hợp cho Xoan ta, loài chủ nấm gây bệnh chết héo Từ khóa: Bệnh chết héo, Ceratocystis manginecans, gây bệnh nhãn tạo, Xoan ta ĐẶT VẤN DỀ Xoan ta {Melia azedarach L.), hay cịn gọi vói tên khác Sầu đơng, phân bố tự nhiên miền Nam Trung Quốc quốc gia vùng Đông Nam Á Xoan ta gỗ lớn, rụng vào mùa khơ, thân trịn, thẳng Chiều cao đạt tói 20 m - 30 m, đường kính ngang ngực có thé đạt 40 cm [11] Cây Xoan ta trổng phổ biến nhiều địa phưong thuộc vùng Đòng Bắc bộ, Tây Bắc bộ, Bác Trung bộ, Nam Trung Tây Nguyên [22] nguồn sinh kế góp phần cải thiện đời sống người dân Tuy nhiên, loài thường bị Sâu đục (Hypsipyla robustà) gây hại [5], đặc biệt rừng trồng loài Ngoài ra, năm qua ghi nhận bệnh chết héo gây hại Xoan ta Hòa Bình Thanh Hóa Các lồi nấm thuộc chi Ceratocystis thường gây bệnh nghiêm trọng, chí gây chết hàng loạt nhiều loài trồng vùng nhiệt đới [8], c íimbriata ghi nhận tác nhân gây bệnh chết héo phổ biến nhiều lồi giói [8], [23], gây chết héo hàng loạt rừng trồng bạch đàn Congo [14], Cà phê Colombia Venezuela [9] Các loài c inquinans, c sumatrana, c microbasis, c manginecans c acaciivora xác định nguyên nhân gây bệnh chết héo rừng trồng Keo tai tượng Keo liềm Indonesia [15], [16], Nấm c manginecans xác định nguyên nhàn gây bệnh chết héo nghiêm trọng nhiều loài trồng Indonesia Malaysia, có rừng trồng lồi keo [16], Nấm c manginecans xác định sinh vật gây bệnh chết héo phổ biến Keo tai tượng Indonesia [6], [16], Kết giám định dựa việc so sánh trinh tự chuỗi ADN khẳng định mẫu nấm gây bệnh chết héo keo thu miền Trung miền Nam Việt Nam c manginecans [6] Bệnh chết héo nấm c manginecans gây hại rừng trồng lồi keo có xu hướng lan rộng nghiêm trọng hon Việt Nam, đặc biệt địa phưong co diện tích rùng trồng tập trung với quy mô lớn [17], [18] Hầu hết cày bị nhiễm bệnh chết làm ảnh hưởng trực tiếp đến nâng suất rừng trồng [17], Ngoài ra, nấm Ceratocystis manginecans ghi nhận nguyên nhân gây bệnh chết héo Sưa [3], gây chết héo rừng trồng loài bạch đàn [21] rừng trồng Lát hoa [4] Việt Nam Kết điều tra Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rưng năm qua ghi nhận tượng Xoan ta bị bệnh chết héo Bài báo trình bày kết nghiên cứu triệu chứng bệnh chết héo, đặc điểm hiển vi, tính gây bệnh kết giám định mẫu nấm gây bệnh chết héo gây hại Xoan ta Hịa Bình Thanh Hóa Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ + - THÁNG 2/2022 57 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VẬT UỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÒI GÚU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu thân Xoan ta bị bệnh chết héo Hịa Bình Thanh Hóa Các mẫu nấm c manginecans thu Xoan ta bị bệnh chết héo 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định triệu chứng bệnh chết héo Quan sát thân để xác định vết bệnh đặc điểm vết bệnh Mô tả đổi màu vỏ gỗ xung quanh vết bệnh Mô tả đặc điểm sùi bọt, mức độ tổn thương vỏ, gỗ vết bệnh mô tả đặc điểm tán bị bệnh chết héo - Phương pháp thu mẫu, phân lập nghiên cứu đặc điểm hình thái nấm gày bệnh chết héo Điều tra thu 10 mẫu bị bệnh Mai Châu, Hịa Bình Mường Lát, Thanh Hóa, tỉnh mẫu Chọn có biểu bị héo bị chết héo vói đặc trưng tán bị héo để lấy mẫu thân bị bệnh Phàn lập mẫu bệnh theo phương pháp Moller De Vay (1968) [10], cụ thể sau: Cưa mẫu thân bị bệnh thành mẩu nhỏ, chọn vị trí bị bệnh để chẻ lấy lát mông Lấy mẫu bệnh chẻ nhỏ kẹp vào lát cà rốt dày mm - mm dùng parafin lại để đĩa petri nhiệt độ 25GC - 28°c Sau ngày - ngày tiến hành phân lập, dùng que cấy nhọn lấy bào tử, cấy môi trường PDA Tiếp tục nuôi nấm, làm cách cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm môi trường PDA theo dõi sinh trưởng, phát triển nấm Mơ tả đặc điểm hình thái giai đoạn phát triển nấm, đo kích thước chụp ảnh hệ sợi cá." dạng bào tử, mô tả hình thái màu sắc kinh hiển vi quang học BX50 - Phươngpháp gây bệnh nhân tạo Đánh giá tinh gây bệnh mầu nám tren Xoan ta năm tuổi vườn ươm theo phưong pháp gây bệnh nhân tạo O’Gara va cs (1996) [12], Dùng đục trịn đường kính 0,3 mm đục bỏ vo thân, đục miếng thạch có chứa sợi nấm vói đường kính mm, úp vào lỗ tạo thân, đặt bơng giấy ẩm phía ngồi dùng băng paraffin băng lại, cơng thức đối chứng sử dụng PDA không chứa nấm gây bệnh Mỗi cơng thức thí nghiệm với 10 cây/cơng thức/lặp lặp lại lần Sau 60 ngày tiến hành kiểm tra đo chiều dài vết bệnh Phân cấp bị bệnh Xoan ta dựa chiều dài vết bệnh tình trạng thể bảng Bảng Phân cấp bị bệnh chết héo Xoan ta Biểu bên ngồi Chỉ số bệnh Khơng có vết bệnh thân, cày khỏe Chiều dài vết bệnh nhỏ cm Chiều dài vết bệnh từ cm đến nhỏ 10 cm bát đầu chuyển màu vàng Chiều dài vết bệnh từ 10 cm đến nhỏ 15 cm chuyển màu vàng bát đầu héo Chiều dài vết bệnh lớn 15 cm bị héo, khơ, rụng, chết phía có chứa ADN làm khn cho phản ứng Phương pháp định loại nấm gây bệnh PCR ADN sau tách chiết giữ - 20°C Tách ADN: Sinh khối chia nhỏ đưa vào Phân đoạn rADN vi sinh vật khuyếch ống eppendorí 1,5 ml bổ sung 500 pl X ssc Lắc đại bàng mồi pTla ủ 99°c 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút phút Hút bỏ phần dịch tiến (TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG) pTlb hành rửa tế bào lần nước cất vô trùng Thêm (GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC), thiết bị khoảng 100 ịil hạt thủy tinh có đường kính 0,2 mm - C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) với 0,5 mm (Roth, Đức), 100 pl dung dịch chương trình nhiệt thiết lập vói pha biến tính phenol/chloroform (tỉ lệ 1: 1) 100 pl nước cất vô 94°c phút 30 chu kỳ nhiệt (94°c trùng Lắc 1.400 vòng/phút 10 phút máy 30 giây, 52°c 30 giây 72°c Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau ly tâm phút) Q trình khuyếch đại hồn tất 72°c 13.000 vòng/phút 10 phút Lấy phần dịch trong 10 phút sau sản phẩm PCR bảo quản 10°C 58 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ + - THÁNG 2/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Sản phẩm PCR sau khuyếch đại phân tích trình tự hãng 1st BASE (Malaysia) Các chuỗi ADN so sánh với sở liệu GenBank thơng qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide nucleotide đạt National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ Các chuỗi liên quan chuyển tải sau xử lý phần mềm BioEdit [7] - Phương pháp xử lý sốliệu Chỉ số bệnh trung binh (R) xác định theo /; ni.vi còng thức: R = - — N Trong đó: ni số bị bệnh cấp bệnh i, vi trị số cấp bệnh thứ i, N tổng số điều tra Trên sở số bệnh trung bình, mức độ bị bệnh xác định dựa số bệnh (R) vói mức sau: R = : Không bị bệnh < R < : Bị bệnh nhẹ < R < : Bị bệnh trung bình < R < : Bị bệnh nặng < R < : Bị bệnh nặng Xử lý sổ liệu bàng phần mềm Excel phần mềm GenStat 12.1 để phân tích tièu thống kê KẾT QUÁ NGHẼN cúu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh chết héo Xoan ta Triệu chứng điển hình bệnh chết héo Xoan ta thân cành bị bệnh có vết lt (Hình Id), thâm (Hình le) vết lõm phần vỏ vỏ gỗ xung quanh vị tri vết bệnh bị đổi màu, chảy nhựa sùi bọt nước Ở vị trí vết bệnh, gỗ bị chuyển sang màu nâu đen màu xanh đen Khi vỏ cày gỗ bị chuyển màu, tản bắt đầu héo (Hình lc) Hầu hết bị nhiễm bệnh sau tháng đến tháng chết làm ảnh hường đến suất rừng trồng (Hình a, b) Kết điều tra cho thấy, bệnh chết héo gây hại tập trung Xoan ta giai đoạn tuổi đến tuổi Việc nhận biết triệu chưng bệnh quan trọng nhằm xác định chinh xác bị bệnh đặc biệt giai đoạn bị nấm gây bệnh xâm nhiễm Hình Triệu chứng bệnh chết héo Xoan ta: a rừng trồng Xoan ta bị bệnh Mường Lát, Thanh Hóa; b rừng trồng Xoan ta bị bệnh Mai Châu, Hịa Bình; c bị chết héo; d, e vết bệnh thân NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ + - THÁNG 2/2022 59 KHOA HỌC CÒNG NGHỆ 3.2 Kết phân lập mơ tả đặc điểm hình thái mẫu nấm 6,1 ụm Bào tử áo có chiều dài từ 16,5 ụm - 24,2 pm, chiều rộng từ 11,1 ụm -14,4 pm (Hình 2) Từ 10 mẫu bị bệnh phân lập 10 mẫu nấm gây bệnh chết héo Quan sát mẫu nấm kính hiển vi cho thấy cấu trúc chứa bào tử túi hình cầu gần cầu, có màu nâu đen đến đen, chiều dài từ 136 pm - 295 pm, chiều rộng từ 95 pm 200 ụm, sợi cổ nấm dài từ 206 ym - 633 pm Bào tử hữu tính có hình mũ chiều dài từ 4,4 Ịim - 8,6 ụm, chiều rộng từ 2,0 pm - 4,8 pm Bào tử vô tinh sản sinh từ sợi sơ sinh có hình trụ chiều dài từ 11,2 ptn - 19,3 pm, chiều rộng từ 1,6 pm - 5,0 pm, bào tử vơ tính sản sinh từ sợi thứ sinh có hình trống chiều dài từ 5,0 pm - 9,5 pm chiều rộng từ 2,6 pm - Căn vào đặc điểm hình thái 10 mẫu nấm phàn lập từ Xoan ta, so sánh vói đặc điểm phân loại Kile (1993) [8], Roux cs (2000) [14], Phạm Quang Thu cs (2016) [18] xác định 10 mẫu nấm nghiên cứu Ceratocystis sp., thuộc họ Ceratocystidaceae, Microascales, lóp Sordariomycetes, ngành nấm túi Ascomycota Đặc điểm bào tử loài nấm thuộc chi Ceratocystis có nhiều đặc điểm tương đồng Do đó, để xác định xác đến lồi, cần tiếp tục nghiên cứu giải trình tự đối chiếu với trình tự tham chiêu ngân hàng gen Hình Đặc điểm hình thái nấm gây bệnh chết héo: a bào tử hình mũ; b bào tử vơ tính hình trụ; c bào tử vơ tính hình trống; d bào tử áo (Chlamydospores) 3.3 Tính gây bệnh mẫu nấm Tính gây bệnh 10 mẫu nấm Ceratocystis sp phân lập từ Xoan ta bị bệnh chết héo cơng thức đối chứng (PDA) có sai khác rõ, kết đánh giá tính gây bệnh mẫu nấm tổng họp bảng 60 Kết tổng họp bảng cho thấy, tính gây bệnh mẫu nấm có sai khác rõ mặt thống kê (Fpr < 0,001) Căn kết phân cấp bệnh thơi điểm 60 ngày sau gây bệnh nhân tạo, tính gày bệnh mẫu nấm Xoan ta thí nghiệm chia thành ba nhóm gồm: gây bệnh mạnh (3 mẫu), gây bệnh mạnh (4 mẫu), gây bệnh NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ + - THÁNG 2/2022 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ trung bình (3 mẫu) Trong số này, mâu XT4, XT7 XT10 (Hình 3a) có tính gây bệnh mạnh, triệu TT 10 11 Mầu nấm XT1 XT2 XT3 XT4 XT5 XT6 XT7 XT8 XT9 XT10 Đối chúng Lsd Fpr chứng đặc điểm vết bệnh thí nghiệm gióng triệu chứng bệnh rùĩig trồng Bảng Tính gây bệnh mẫu nẩm Xoan ta Địa điểm thu mảu Cấp bệnh trung binh Mai Châu, Hòa Bình l,92c Mai Châu, Hịa Bình 2,91e Mai Châu, Hịa Bình 2,04c Mai Châu, Hịa Binh 3,06ef Mai Châu, Hịa Bình l,88c Mường Lát, Thanh Hóa l,40b Mường Lát, Thanh Hóa 3,16f Mường Lát, Thanh Hóa 2,26d Mường Lát, Thanh Hóa 2,30d Mường Lát, Thanh Hóa 3,16f 0,00a 0,197