Nghiên cứu ảnh hưởng của Cao Trái Nhàu (Morinda Citrifolia L. Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid docx

TCNCYH 27 (1) - 2004 Nghiên cứu ảnh hởng của cao trái nhàu (Morinda Citrifolia L. Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Vinh Hà, Vũ Thị Ngọc Thanh Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu ảnh hởng của cao lỏng trái Nhàu (CTN) lên một số chỉ số miễn dịch của chuột nhắt bị gây suy giảm miễn dịch CY. Với liều 6 g/ kg/ngày dùng theo đờng uống trong 5 ngày liên tục, CTN làm tăng trọng lợng lách và tuyến ức tơng đối, tăng số lợng bạch cầu lympho, mônô, diệt tự nhiên, tăng tỉ lệTBTHHMC, TBTQDH và tăng cờng PƯBVKNOA so với lô chuột chỉ tiêm CY đơn thuần không đợc dùng thêm thuốc thử. i. Đặt vấn đề Cây Nhàu còn đợc gọi là cây Giầu, cây Ngao núi, cây Nhầu núi, tên khoa học là Morinda citrifolia, họ cà phê Rubiaceae. Cây Nhàu, từ lâu đã đợc nhân dân sử dụng làm thuốc hạ huyết áp, thuốc bổ nâng cao sức đề kháng của cơ thể [3]. Nhiều công trình nghiên cứu của Phan Thị Phi Phi và cộng sự đã chứng minh tác dụng kích thích miễn dịch của rễ Nhàu toàn phần trên invitro, invivo và lâm sàng [4, 5]. Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng chống khối u và kích thích miễn dịch của trái cây Nhàu trồng ở Hawai [6], [7], [8]. ở Việt Nam cho đến nay cha có công trình nghiên cứu nào về trái Nhàu đợc công bố. Để có thể tìm đợc một nguồn dợc liệu dồi dào hơn, có tác dụng kích thích miễn dịch, mục tiêu của đề tài này là nghiên cứu tác dụng của cao trái Nhàu lên một số chỉ tiêu miễn dịch của chuột nhắt bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid. ii. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu: 1.1. Thuốc: Cao mềm trái Nhàu tỉ lệ 1:5 (1 gam cao chứa 5 gam dợc liệu) do xí nghiệp Dợc phẩm trung ơng 25 cung cấp. Khi sử dụng đợc pha loãng trong dung môi nớc đến tỉ lệ 1:1. - Cyclophosphamid (CY): dạng thuốc bột, biệt dợc Endoxan, lọ 200 mg, của hãng ASTA Medica, Đức. - Levamisol: dạng bột trắng, hàm lợng 98,6% do phòng Hoá Lý I, Viện Kiểm nghiệm trung ơng cung cấp. 1.2. Động vật thực nghiệm: - Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, cả hai giống, cân nặng 20 2 g do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng cung cấp. 1.3. Dụng cụ và hoá chất: - Nhũ dịch OA (Ovalbumin + Al (OH) 3 , dung dịch BSA (Boruine Serum Albumin), hồng cầu cừu đủ tiêu chuẩn phòng thí nghiệm. 28 TCNCYH 27 (1) - 2004 - Kính hiển vi quang học Olympus CH20 của Nhật và các dụng cụ chuẩn của phòng thí nghiệm Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh trờng Đại học Y Hà Nội. 2. Phơng pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng đợc chia thành 4 lô. Lô 1: chuột không bị tác động gì. Lô 2: chuột đợc tiêm màng bụng CY liều duy nhất 200 mg/kg. Lô 3: chuột đợc tiêm CY (liều nh lô 2), đợc uống levamisol liều 100 mg/kg trong 5 ngày sau tiêm CY. Lô 4: chuột đợc tiêm CY (liều nh lô 2), đợc uống cao trái Nhàu liều 6g/kg trong 5 ngày sau tiêm CY. Ngày thứ 6 giết chuột đánh giá các chỉ số sau: - Các chỉ số chung: + Trọng lợng lách tơng đối (TLLTĐ) và tuyến ức tơng đối (TLTƯTĐ) đợc tính là trọng lợng lách, tuyến ức tơng ứng với 100g thể trọng chuột. + Số lợng bạch cầu, công thức bạch cầu trong máu ngoại vi. - Các thông số đánh giá miễn dịch dịch thể: Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm (TBTHHMC). Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết (TBTQDH). - Thông số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào: Phản ứng bì với kháng nguyên OA (PƯBVKNOA) iii. Kết quả 1. Nghiên cứu đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch: 1.1. Trọng lợng lách và tuyến ức tơng đối: Tr ọ n g l ợ n g tơn g đối ( %o ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Trọng l ợng lách t ơng đối TL tuyến ức t ơng đối Lô 1 (Chứng sinh học) Lô 2 (Tiêm CY) Lô 3 (Tiêm CY + levamisol) Lô 4 (Tiêm CY + Nhàu) *** ** *** * * * Thôn g s ố *: p < 0,05 ; **: p < 0,01 ; ***: p < 0,001 Biểu đồ 1. ảnh hởng của cao trái Nhàu lên trọng lợng lách và tuyến ức tơng đối Kết quả ở biểu đồ 1 cho thấy: TLLTĐ của các lô chuột có tiêm CY đều giảm so với lô 1. ở lô 2 TLLTĐ giảm rõ rệt. ở lô 3 và 4, TLLTĐ giảm nhẹ so với lô 1, nhng so với lô 2, TLLTĐ lại tăng có ý nghĩa. TLLTĐ ở các chuột uống cao trái Nhàu cao hơn ở chuột uống levamisol và gần tơng 29 TCNCYH 27 (1) - 2004 đơng với giá trị của lô 1. TLTƯTĐ ở lô 3 và 4 tăng lên so với lô 2 nhng sự khác biệt không có ý nghĩa. 1.2. Số lợng bạch cầu (SLBC): SLBC (nghìn/mm 3 ) 0 2 4 6 8 10 Lô 1 (Chứng sinh học) Lô 2 (Tiêm CY) Lô 3 (Tiêm CY + levamisol) Lô 4 (Tiêm CY + Nhàu) ** ** * Lô chu ộ t Biểu đồ 2. ảnh hởng của cao trái Nhàu đến số lợng bạch cầu ở máu ngoại vi Kết quả ở biểu đồ 2 cho thấy: SLBC ở lô 2 giảm rõ rệt so với lô 1. ở lô 3 và 4 SLBC tăng cao hơn so với lô 1 nhng sự khác biệt không có ý nghĩa. Tuy nhiên, mức tăng này có ý nghĩa so với lô 2. 1.3. Công thức bạch cầu (CTBC): Bảng 1. ảnh hởng của cao trái Nhàu đến công thức bạch cầu ở máu ngoại vi Số lợng tuyệt đối các loại bạch cầu (BC/mm 3 ) Thông số Lô 1 (n=10) Lô 2 (n=10) Lô 3 (n=10) Lô 4 (n=15) BCMTT 2591 507 1550 598 ** 1486 491 ** 1499 502 ** BC lympho 2829 377 1907 354 ** 4879 501 *** 4662 409 *** BC mô nô 93 18 51 19 * 128 35 * 87 29 * BCNK 67 13 37 12 * 141 48 ** 280 51 *** BC a acid 71 12 64 11 72 14 67 10 BCMTT: bạch cầu múi trung tính, BCNK: bạch cầu diệt tự nhiên Kết quả ở bảng 1 cho thấy: SLBC các loại ở lô 2 giảm rõ rệt so với lô 1. ở lô 3 và 4 SLBC lympho, mô nô và NK tăng rõ rệt so với lô 1 và so với lô2. SLBC a acid hầu nh không thay đổi ở tất cả các lô chuột. SLBC đa nhân trung tính giảm rõ rệt ở cả 3 lô: 2, 3, 4 so với lô 1 nhng không có sự khác biệt giữa các lô. 30 TCNCYH 27 (1) - 2004 2. Nghiên cứu ảnh hởng của cao trái Nhàu lên đáp ứng miễn dịch dịch thể: 2.1.Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm Bảng 2. ảnh hởng của cao trái Nhàu đến tỷ lệ TBTHHMC Lô nghiên cứu Tỷ lệ TBTHHMC (%) p (so với lô1) p (so với lô 2) Lô 1 (n=10) 13,7 3,2 p<0,001 Lô 2 (n=10) 2,6 0,5 p<0,001 Lô 3 (n=10) 4,1 0,6 p<0,001 p<0,01 Lô 4 (n=15) 4,0 1,3 p<0,001 p<0,01 Kết quả ở bảng 2 cho thấy: tỷ lệ TBTHHMC ở các lô 2, 3, 4 đều giảm rõ rệt so với lô 1. Tuy nhiên, ở hai lô 3 và 4 tỷ lệ này tăng lên có ý nghĩa so với lô 2. Tỷ lệ TBTHHMC không có sự khác nhau giữa lô 3 và lô 4. 2.2. Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết Bảng 3. ảnh hởng của cao trái Nhàu đến tỷ lệ tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết Lô nghiên cứu Tỷ lệ TBTQDH (%) p (so với lô 1) p (so với lô 2) Lô 1 (n=10) 15,2 3,1 p<0,05 Lô 2 (n=10) 9,6 2,9 p<0,05 Lô 3 (n=10) 13,4 1,7 p>0,05 p<0,05 Lô 4 (n=15) 15,4 2,3 p>0,05 p<0,05 Kết quả ở bảng 2 cho thấy: tỷ lệ TBTQDH ở lô 2 giảm rõ rệt với lô 1. ở lô 3 và 4, tỷ lệ này tơng đơng với lô 1 nhng lại tăng lên rõ rệt so với lô 2. 3. Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào: Phản ứng bì ( mm) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Lô 1 (Chứng sinh học) Lô 2 (Tiêm CY) Lô 3 (Tiêm CY + levamisol) Lô 4 (Tiêm CY + Nhàu) ** ** ** Lô chu ộ t Biểu đồ 3. ảnh hởng của cao trái Nhàu đến phản ứng bì với kháng nguyên OA 31 TCNCYH 27 (1) - 2004 Kết quả ở biểu đồ 3 cho thấy: PƯBVKNOA ở lô 2 giảm rõ rệt so với lô1. Phản ứng bì ở chuột lô 3 và 4 thay đổi không có ý nghĩa so với lô 1 nhng so với lô 2 phản ứng này tăng lên rõ rệt. iv. Bàn luận 1. ảnh hởng của cao trái Nhàu lên các chỉ số chung Theo dõi trọng lợng lách và tuyến ức tơng đối có thể đánh giá đợc phần nào đáp ứng miễn dịch dịch thể do các lympho bào B đảm nhận và miễn dịch tế bào do các lympho bào T đảm nhận [2]. CY là một tác nhân alkyl hoá tế bào, nhờ cơ chế alkyl hoá DNA nên CY ngăn chặn sự sao chép và phiên mã của DNA dẫn đến ức chế sự phân bào. CY nhạy cảm với các tế bào đang phân chia trong đó có các tế bào của hệ thống miễn dịch. Do tác dụng nh vậy nên CY làm giảm trọng lợng tơng đối các cơ quan lympho và SLBC ở các lô chuột tiêm CY. Kết quả ở biểu đồ 1 cho thấy ở lô 4 TLLTĐ, TLTƯTĐ và SLBC tăng lên rõ rệt so với lô 2, đặc biệt SLBC lympho và mônô tăng lên rõ rệt so với cả lô 1 và lô 2 trong khi BCMTT không thay đổi, điều này cho thấy CTN làm giảm tác dụng ức chế miễn dịch do CY gây ra. Tác dụng này có thể do CTN tăng cờng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mạnh hơn trên miễn dịch không đặc hiệu. 2. ảnh hởng của cao trái Nhàu lên đáp ứng miễn dịch dịch thể ở chuột nhắt trắng tỷ lệ lympho bào T có thụ thể tự nhiên với hồng cầu cừu rất ít, chỉ chiếm 1-2%. Trong khi tỷ lệ này rất cao đạt 80-90% ở lympho bào B, đây là đặc tính khác biệt giữa hai loại lympho bào B và T giữa ngời và chuột nhắt trắng, nhờ đó có thể đánh giá một phần cấu trúc bề mặt và khả năng kết hợp kháng nguyên của lympho bào B thông qua tỷ lệ TBTHHMC. Tỷ lệ TBTQDH không những đánh giá đợc khả năng tiết kháng thể đặc hiệu của các lympho B mà còn đánh giá đợc các thụ thể bề mặt của tế bào này với C3 của bổ thể [2]. Kết quả ở bảng 2, 3 cho thấy: CTN làm tăng rõ rệt cả hai chỉ số trên ở lô 4 so với lô 2. Nh vậy CTN đã làm tăng số lợng của các tế bào miễn dịch dẫn tới tăng trọng lợng các cơ quan lympho, tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của các lympho bào B với kháng nguyên đặc hiệu. 3. ảnh hởng của cao trái Nhàu lên đáp ứng miễn dịch tế bào Phản ứng bì với kháng nguyên OA có giá trị để đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào với kháng nguyên OA của các lympho bào T đảm nhận [2]. Kết quả ở biểu đồ 3 cho thấy: CTN làm tăng phản ứng này rõ so với lô 2. Điều này cho thấy CTN cũng làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào nhng không bằng levamisol. ở lô 3 uống levamisol, phản ứng bì tăng lên rất cao (hơn cả lô 1), điều này càng khẳng định levamisol có tác dụng kích thích miễn dịch u tiên trên các lympho bào T hơn các lympho bào B. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các tác giả trong nớc và nớc ngoài [1, 4, 5]. Theo Hirazumi [6] trong trái Nhàu chứa một hàm lợng lớn polysaccharid và các protein liên kết polysaccharid, chính các chất này có hoạt tính chống khối u ở chuột thể hiện qua sự ức chế phát triển của khối ung th, điều hoà hệ thống miễn dịch của vật chủ. Theo Wang và Hirazumi [6, 7, 8] cơ chế tác dụng của trái Nhàu là làm tăng giải phóng các chất trung gian có hoạt tính trong quá trình đáp ứng miễn dịch nh TNF , IL1 , IL10, IL12, IFN và nitric oxit. 32 TCNCYH 27 (1) - 2004 5. Phạm Huy Quyến (1996), Tác dụng kích thích miễn dịch của dịch chiết rễ cây Nhàu trên súc vật thí nghiệm, Luận án Phó tiến sĩ Y học, Trờng Đại học Y Hà Nội. v. Kết luận CTN liều 6g/kg thể trọng làm tăng cờng hồi phục các chỉ số miễn dịch ở chuột nhắt trắng đợc gây suy giảm miễn dịch bằng CY. 6. Hirazumi A., Furusawa E. (1999), An immonomodulatory polysaccharide - rich substance from the fruit juice Morinda citrifolia (Noni) with antitumour activity, Phytother Res, Aug, 13 (5), pp.380- 387. Tài liệu tham khảo 1. Phạm Thị Vân Anh (2003), Nghiên cứu độc tính và sự ảnh hởng của cao trái Nhàu lên một số chỉ tiêu miễn dịch của súc vật thực nghiệm, Luận văn thạc sỹ y học, Trờng Đại học Y Hà Nội. 7. Wang M.Y., Su C. (2001), Cancer preventive effect of Morinda citrifolia (Noni), Annals of the NewYork Academy of sciences, 952, pp.161 - 168. 2. Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh (1997), Miễn dịch học, Trờng Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất bản Y học. 8. Wang M.Y., West B.J., Jensen C.J. (2002), Morinda citrifolia (Noni): a literature review and recent advances in Noni research, Acta Pharmacol Sin, Dec, 23 (12), pp.1127-1141. 3. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 306-307. 4. Phạm Huy Quyến, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh (1994), Nghiên cứu invitro tác dụng kích thích miễn dịch của chất chiết toàn phần rễ lá Morinda citrifolia, Tạp chí Y học Việt Nam, (Số9), tr 21-26 Summary Studying influence of fruit Morinda citrifolia extract (MC) in immune index on CY induced immuno suppressive mice The fluid extract of MC (1 ml contains 1 gram fruit of MC) was used to evaluate its influence in immune index on immuno suppressive mice by CY. Our experimental results show that: The fluid extract of MC in dose of 6gram/kg body weight per oral route daily in 5 day consecutive course has increased relative weight of spleen and thymus, total leucocytes count, number of lymphocyte, natural killer and monocyte, rate of immune B rosette forming cells, plaque forming cells, the dermoreaction with OA antigen compare group that has been only injected CY without using any drug. 33 . - 2004 Nghiên cứu ảnh hởng của cao trái nhàu (Morinda Citrifolia L. Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid. của đề tài này l nghiên cứu tác dụng của cao trái Nhàu l n một số chỉ tiêu miễn dịch của chuột nhắt bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid.