TẠP CHÍ CÔNGIHITM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN PROPIONỈBACTERỈUM ACNES GÂY MỤN TRỨNG CÁ TỪ CAO CHIÊT LÁ VÀ TRÁI CÂY ỔI SẺ (PSIDIUM GUAJAVA L ) • TRƯƠNG THỊ Ý NHI TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm mục đích đ[.]
TẠP CHÍ CƠNGIHITM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN PROPIONỈBACTERỈUM ACNES GÂY MỤN TRỨNG CÁ TỪ CAO CHIÊT LÁ VÀ TRÁI CÂY ỔI SẺ (PSIDIUM GUAJAVA L.) • TRƯƠNG THỊ Ý NHI TĨM TẮT: Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá khả kháng vi khuẩn Propionibacterium acnes gây mụn trứng cá cao chiết ưái ổi sẻ (Psidium guajava L.) Hàm lượng vitamin c loại cao chiết trái mẫu trái/acid đạt cao (2.548± 166 mg/100 g cao chiết), mẫu trái/nước (1.335±166 mg/100 g cao chiết), loại cao chiết thu có khả kháng vi khuẩn Propionibacterium acnes thực phương pháp khuyếch tán giếng thạch cụ thể: cao lá/ethanol có giá trị MIC (mg/mL) MBC (phương pháp pha loãng) (mg/mL) 1,25 100 mg/mL, cao trái/nước cao trái/acid có giá trị giống nhau, giá trị MIC (mg/mL) MBC (mg/mL) 0,625 100 mg/mL Qua kết nghiên cứu cho thấy tiềm loại cao chiết từ trái ổi sẻ có hiệu kháng vi khuẩn, cần có nghiên cứu tương lai tập trung vào tinh hợp chất thiên nhiên có ổi sẻ ứng dụng thực tiễn chất chiết xuất hữu ích Từ khóa: kháng khuẩn, Propionibacterỉum acnes, Psidium guajava, vitamin c Đặt vân đề Cây ổi sẻ (Psidium guajava L.) thuộc họ Myrtaceae, dễ tìm, dễ trồng sử dụng phổ biến giá trị dinh dưỡng cao, khả kháng viêm kháng nhiều loại vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Các hợp chất tìm thấy ổi sẻ tannin, flavonoid vitamin c cao đóng vai trị hoạt động kháng khuẩn hiệu Mụn trứng cá chứng rối loạn mơ lót xám có liên quan đến bất thường sản xuất bã nhờn có đặc điểm xuất triệu chứng viêm (mụn nhọt, mụn mủ nốt sần) tổn thương khác Rất nhiều yếu tố hormon, tăng sản xuất bã chế độ ăn uông gây mụn trứng cá Đặc 366 SỐ 12-Tháng 5/2022 biệt, vi khuẩn P acnes kết hợp với tế bào chết nằm da chất nhờn da tiết gây nên nhân mụn, chịu ảnh hưởng viêm nhiễm nấm ngồi da gây nên tình trạng mụn mủ, mụn bọc, với biểu viêm, sưng đỏ, nóng đau Trong nghiên cứu này, việc khảo sát khả kháng vi khuẩn gây mụn trứng cá P acnes cao chiết trái ổi sẻ thực nhằm mục tiêu đánh giá hoạt tính sinh học chúng nhằm hướng tới ứng dụng sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên Đổì tưựng phương pháp nghiên cứu Đối tượng thí nghiệm: Lá ổi sẻ (Psidìum guajava L.) thu vườn địa bàn thành phố Cần Thơ Vi sinh vật sử dụng để nghiên cứu HĨA HỌC-CƠNG NGHỆ THựC PHẨM vi khuẩn Propionibacterium acnes phân lập từ bệnh nhân bị mụn trứng cá Q trình trích cao chiết từ trái ổi sẻ: q trình trích cao thực theo mô tả Trương Thị Ý Nhi (2021) a Trích cao chiết ổi sẻ: Lá ổi tươi thu từ nhà vườn rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô đến khối lượng không đổi 60°C 72 Lá sau khô nghiền để thu bột khô Cao ổi sẻ trích phương pháp soxhlet, mẫu bột ổi khơ ly trích với ethanol 95% tỷ lệ 1:10 (w/v) 18 Cơ cạn dịch trích máy cô quay chân không nhiệt độ 60°C để thu cao ổi b Trích cao chiết ổi sẻ: Trái ổi chín thu cho đẹp khơng có dấu hiệu nhiễm khuẩn sâu bệnh Quả tách bỏ hạt thu phần thịt quả, lây 2.000 g thịt chia làm hai phần nhau: phần (1) xay nghiền với nước cất với tỷ lệ 1:2 (w/v); phần (2) xây nghiền với nước cất có bổ sung citric acid 5% với tỷ lệ 1:2 (w/v) Hỗn hợp ủ lắc 10°C đem lọc chân không thật nhanh Dịch lọc đem trữ -20°C, sau đơng khơ chân khơng thu cao chiết dạng bột, bỏ phần bã Phân tích hàm lượng ascorbic acid có mẫu cao chiết trái ổi sẻ: Theo mô tả Nguyễn Minh Chơn (2008) Thuốc thử DIP 0,001N pha đệm phosphate pH = Mẩu cao chiết 100 mg pha 10 IĨ1L HC1 1%, định mức đến 50 mL với citric acid 1%, để yên 15 phút, lọc qua giấy lọc (đường kính lỗ lọc 13pm) Chất chuẩn vitamin c tiến hành với tỉ lệ tương tự (4 mg với 20 mL HC11%, định mức đến 100 mL với citric acid) Chuẩn độ: Lây 10 mL dịch lọc cho vào bình tam giác 100 mL Dùng microburet với DIP 0,00IN để chuẩn độ đến lúc xuất màu hồng bền sau 30 giây Mầu đối chứng hỗn hợp citric acid HC1 tỉ lệ tương tự không chứa cao chiết Các nghiệm thức tiến hành với lần lặp lại Phân lập định danh dòng vi khuẩn gây mụn Mẫu vi khuẩn gây mụn lấy từ sinh viên bị mụn trứng cá Trường Đại học cần Thơ, phân lập môi trường BHI agar sau: Mẫu bệnh phẩm pha lỗng nước cất có độ pha lỗng 10'2, 10', 10-4 Hút dung dịch nồng độ giọt nhỏ lên đĩa thạch, ú môi trường kỵ khí theo Kishishita (1980) mơi trường kỵ khí bình hút ẩm (không chứa hạt hút ẩm, đốt nến, đậy nắp để tạo điều kiện kỵ khí), ủ 37°c từ 5-7 ngày (CO2: N2,10%: 90%) Chọn khuẩn lạc phù hợp với nghiên cứu Polugari (2016) Phan Thị Bích Dun (2017) Sau định danh kỹ thuật sinh học phân tử Khả kháng vi khuẩn p acnes gây mụn trứng cá từ cao chết trái ổi sẻ a Phương pháp khuếch tán giếng thạch Theo mô tả Sardana (2016) Cao chiết pha loãng DMSO thành nồng độ khác Chuẩn bị đĩa môi trường: môi trường BHI agar, dày mm Huyền phù vi khuẩn: nuôi cấy đạt mật số vi khuẩn p acnes khoảng 106 CFU/ mL Hút 100 pL trải mẫu lên đĩa môi trường BH1 agar để ráo, sau tạo giếng đường kính khoảng mm Mỗi giếng nhỏ 60 pL cao chiết pha DMSO Đem ủ mẫu mơi trường kỵ khí, 37°c 48 b Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ cao chiết nhỏ nhát mà khơng thấy phát triển vi khuẩn p acnes thực theo phương pháp Đỗ Trung Đàm (2006) Cao chiết pha loãng thành nồng độ 10mg/mL, mg/mL; 2,5 mg/mL; 1,25 mg/mL 0,625 mg/mL Tiến hành tương tự mô tả phương pháp đục giếng thạch c Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nồng độ thấp cao chiết làm giảm 99 - 99,5% lượng VI khuẩn, giết chết phát triển vi khuẩn p acnes Theo mô tả Đỗ Trung Đàm (2006) cao chiết pha loãng thành nồng độ đến 80, 100, 120, 140 mg/mL Ong eppendorf cho 100 pL cao chiết, 100 pL huyền phù vi khuẩn p acnes (1x106 CFU/ mL) 500 p.L mơi trường BHI lỏng, ủ kỵ khí 37°c 72 Mẩu trải đĩa BHI agar, ủ 48 Sau ủ, tiến hành quan sát đĩa petri, đĩa petri khơng có phát triển vi khuẩn nồng độ MBC cao chiết Thống kê phân tích số liệu: Các số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Excel phân tích thơng kê phần mềm SPSS Satistics 20, phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, giá trị trung bình so sánh kiểm định Turkey Kết thảo luận 3.1 Kết trích cao ổi sẻ Các tiêu theo dõi trình bày Bảng SỐ 12-Tháng 5/2022 3Ĩ7 TẠP CHÍ CƠNG THƯƠNG Bảng Kết chiết cao ổi sẻ Cao trích từ ổi thực phương pháp soxhlet với Kết Chỉ tiêu theo dõi dung môi ethanol (8,24%) cho Lá Ổi sẻ Tráiổi/nước Trái ổi/add thấy hiệu suất cao so với Khối lượng mâu tươi (g) 1000 1000 1000 dung môi khác nghiên cứu Tambe et al Độ ẩm tuyệt đối (%) 80,00 85,17 85,17 (2014) acetone (4,48%), Khối lượng khơ dùng ly trích (g) 200 petroleum (2,11%) Khối lượng tươi trước đông khô (g) 1000 425 525 3.2 Hàm lượng ascorbic acid có cao chiết trái ổi Khối lượng cao thô (g) 1,65 6,40 23,49 Hàm lượng vitamin c có Hiệu suất trích dựa khối lượng khô (%) 8,24 cao chiết trái ổi sẻ Hiệu suất trích dựa khơi lượng tươi (%) 1,65 1,50 4,47 thể Hình Trong đó, mẫu trái/acid đạt cao Nguồn: Tính tốn tác giả (2.548±166mg/100 g cao chiết), mẫu trái/nước Hình 1: Hàm lượng vitamin c có mầu cao chiết (1.335±166mg/100 g cao chiết) Kết phù hợp với lý thuyết vitamin c dễ tan nước bền môi trường acid nên hàm lượng vitamin c mẫu trái/acid cao mẫu trái/nước Kết cao so với nghiên cứu khác mà Nwaichi et al (2015) cụ thể 216.05+9.64 mg/100 g Nguồn: Tính tốn tác giả trái ổi tươi Chính có hàm lượng cao vitamin c nên Hình 2: Đặc điểm khuẩn lạc tế bào vi khuẩn p acnes phân cao chiết có hoạt tính tốt lập hoạt động kháng oxy hóa, A - Tế bào vi khuẩn độ phóng đại 1.000 lần kháng viêm B - Tế bào vi khuẩn kính hiển vi điện tủ quét SEM với độ 3.3 Kết phân lập phóng đợi 11.000 lần định danh vi khuẩn p acnes c - Khuẩn lạc dòng vi khuẩn p Clones mơi trường TYEG Dịng vi khuẩn p acnes phân lập từ mẫu bệnh phẩm xác định thơng qua đặc điểm hình thái, phản ứng sinh hóa kỹ thuật sinh học phân tử Một số đặc điểm vi khuẩn p acnes phân lập thể Hình Theo mơ tả Polugari đậm đến nhạt Trên môi trường BHI khuẩn lạc có (2016) Phan Thị Bích Dun (2017), đặc điểm ghi nhận dòng p acnes phân lập màu trắng Đường kính khuẩn lạc có kích thước sau: khuẩn lạc có dạng trịn, mơ cao dao động 0,8-1,8 mm sau 5-7 ngày nuôi cấy Tế bào vi khuẩn có hình que, Gram dương, có hồn tồn bề mặt mơi trường, bìa ngun, khơng nhầy Khuẩn lạc môi trường BHI agar phản ứng sinh hóa dương tính với catalase, có bổ sung bromocresol purple, có màu vàng từ indole 3Ĩ8 SỐ 12-Tháng 5/2022 HĨA HỌC-CƠNG NGHỆ THựC PHẨM Kết giải trình tự gen 16S - rRNA dòng vi khuẩn phân lập nhưsau: Đoạn gen dài 1.408 nucleotide, tương đồng với Propionibacterium acnes (Cutibacterium acnes), độ tương đồng 96% 3.4 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn p acnes Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết trái ổi sẻ thử phương pháp khuếch tán giếng thạch với chủng vi khuẩn p acnes Kết trình bày Hình Bảng Cao chiết trái ổi sẻ có tạo vịng kháng khuẩn cho thây khả kháng khuẩn có hiệu cao chiết DMSO (đôi chứng âm) khơng tạo vịng kháng khuẩn Đối chứng dương Climydacin (1 mg/mL) cho hiệu kháng khuẩn với d=14,100 mm Hiệu Hình 3: Kết vịng kháng vi khuẩn p acnes ba loại cao chiết Ghi chú: Nồng độ cao chiết (mg/mL); (+) Clindamycin mg/mL; (-) DMSO Bảng Kết khảo sát khả ức chế vi khuẩn p acnes Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Nổng độ cao chiết (mg/mL) Lá/ ethanol Trái/ nước Trái/aicd 20 11,933d± 0,153 11,833c± 0,404 12,367c± 0,764 40 14,133c±0,321 13,200b± 0,656 14,100b±0,624 60 15,967b± 0,666 14,167b± 0,543 16,067a± 0,473 80 18,033a± 0,603 16,233a± 0,651 17,633a± 0,666 MIC(mg/mL) 1,250 0,625 0,625 MBC(mg/mL) 100 100 100 Climydacin (1 mg/mL) 14,100±0,814 Nguồn: Tính tốn tác giả SỐ 12-Tháng 5/2022 3Ĩ9 TẠP CHÍ CÔNG THƯƠNG kháng khuẩn cao chiết tăng tăng nồng độ cao Hiệu kháng khuẩn tốt ghi nhận cao trái/nước trái/acid (0,625 mg/mL) so với cao lá/ethanol (MIC đạt 1,250 mg/mL) loại cao đạt giá trị MBC mức 100 mg/mL khảo sát Các nghiên cứu khác giá trị MIC cao chiết khác ức chế p acnes nhắc đến nghiên cứu Ihsan et al (2014) cao chiết ethanol vỏ trái lựu (MIC nằm khoảng 600 - 750 pg/mL); dịch chiết hoa Lài dung môi ethanol (MIC 0,049 mg/mL) theo nghiên cứu Kumar et al (2007) Các dịch chiết có hiệu ức chế vi khuẩn p acnes thấp so với cao chiết trái ổi sẻ Tuy nhiên, hiệu ức chế vi khuẩn p acnes cao trái ổi sẻ thấp so với cao thô ethanol vỏ trái lựu kháng vi khuẩn p acnes có MIC 7,81 pg/mL theo Werayut et al (2010) Cao chiết từ trái ổi sẻ thu nghiên cứu có hàm lượng vitamin c cao khả kháng khuẩn tốt, hiệu kháng khuẩn thấp so với vài nghiên cứu khác 4, Kết luận Mầu trái ổi sẻ có độ ẩm 80,00% 85,17%, với hiệu suất trích cao dựa khối lượng tươi lá/ethanol 1,65%; trái/nước 1,51%; trái/acid 4,75% Hàm lượng vitamin c loại cao chiết trái mẫu trái/acid đạt cao (2.548±166 mg/100 g cao chiết), mẫu trái/nước (1.335+166 mg/100 g cao chiết), loại cao chiết thu có khả kháng vi khuẩn p acnes Qua kết kháng khuẩn cho thấy giá trị MIC cao trái nhỏ MIC cao lá/ethanol, MIC trái/nước trái/acid xấp xỉ Giá trị MBC cho loại cao Khả kháng khuẩn cao chiết lá/ ethanol xác định dãy nồng độ cao từ l,25-80mg/mL, giá trị MIC MBC 1,25 100 mg/mL Khả kháng khuẩn cao chiết trái/nước trái/acid xác định dãy nồng độ cao từ 0,625-80mg/mL, giá trị MIC MBC 0,625 100 mg/mL ■ TÀI LIỆU THAM KHẢO: Kishishita, Ushijima, Ozaki and Ito (1980) New Medium for Isolating Propionibacteria and Its Application to Assay of Normal Flora of Human Facial Skin Applied and environment Microbiology 40:1100-1105 Đỗ Trung Đàm, (2006) Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo NXB Khoa học kỹ thuật Tambe, R., Singhal, R.G., Bhise, K., Kulkami, M (2014) Phytochemical screening and HPTLC fingerprinting of leaf extracts of Psidium guajava Linn Journal of Pharmacognosy and phytochemistry 2014 3(l):52-56 Polugari, R., Maria, S.R and Shailaja, D (2016) Isolation and molecular characterization of acnecausingPropionibacteriumacnes International Journal ofScientific and Research Publications 6(6):809-814 Sardana K., Gupta, T., Kumar, B., Gautam, H.K and Garg, V.K (2016) Cross-sectional Pilot study of antibiotic resistance in Propionibecterium acnes strains in Indian acne patients using 1ÓS-RNA polymerase chain reaction: acomparison among treatment modalities including antibiotics, benzoyl peroxide, and isotrentinoin Indian J Dermatol 2016.61(1): 45-52 Phan Thị Bích Duyên, (2017) Đánh giá khả kháng Propionibaterium acnes Candida albicanx MI 175 cao chiết vỏ trái mãng cụt cao chiết khóm Luận văn cao học Trường Đại học cần Thơ Thành phố cần Thơ Werayut, p., Chomnawang, M.T., Supabphol, R and Gritsanapan, w (2010) Free radical scavenging and anti acne activities of mangosteen fruit rind extracts prepared by different extraction methods Pharmaceutical Biology 48:2,182-186 Kumar, G.S., Jayaveera, K.N., Kumar, C.K.A, Umachigi, P.S., Vrushabendra, B.M.S and Kumar, D.V.K (2007) Antimicrobial effects of Indian medicinal plants against acne-inducing bacteria Trop J Pharm Res 2007 6:717-723 370 SỐ 12-Tháng 5/2022 HÓA HỌC-CÔNG NGHỆ THựC PHẨM Nguyễn Minh Chơn (2008) Phân tích định lượng ascorbic acid enzyme peroxidase Hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ IV: Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học Công nghệ thực phẩm NXB Khoa học Kỹ thuật 10 Nwaichi, E.O., Chuku, L.c and Oyibo, N.J (2015) Profile of Ascorbic Acid, Beta-Carotene and Lycopene in Guava, Tomatoes, Honey and Red Wine Int J Curr Microbiol App Sci (2015) 4(2): 39-43 11 Trương Thị Ý Nhi, Nguyễn Minh Chơn (2021) Khảo sát khả kháng oxy hóa cao chiết trái ổi sẻ (Psidium guajavaL.) Tạp chí Cơng Thương, số7 tháng 3/2021, tr 156-161 Ngày nhận bài: 8/3/2022 Ngày phản biện đánh giá sửa chữa: 6/4/2022 Ngày chấp nhận đăng bài: 16/4/2022 Thông tin tác giả: ThS TRƯƠNG THỊ Ý NHI Khoa Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Tây Đô ASSESSING THE ANTI PROPIONIBACTERIVM ACNES PROPERTY OF LEAF AND FRUIT EXTRACTS FROM PSIDIUM GUAJAVA L • Master TRUONG THI Y NHI Faculty of Applied Biology Tay Do University ABSTRACT: This study is to examine the anti Propionibacterium acnes property of leaf and fruit extracts from Psidium guajava L The vitamin c content in the leaf extract and fruit exưact in the íruiưacid sample reached the highest content of 2.548 ± 166 mg/100 gr extract, followed by the fruit/water sample (1,335 ± 166 mg/100 gr extract) Three types of obtained extract show antibacterial activity against Propionibacterium acnes in well diffusion assay In which, the leaf extract/ethanol has the MIC value of 1.250 mg/ml and the MBC (broth macrodilution method) value of 100 mg/ml The fruit extract/ distilled water and fruit extract/ acid have similar MIC value of 0.625 mg/ml and similar MBC value of 100 mg/ml Experimental results show potentiality of leaf and fruit extract from Psidium guajava L in antioxidant and antibacterial activity Therefore, more researches in purification of natural compounds in Psidium guajava L extract are required in the future for further application Keywords: antibacterial, Propionibacterium acnes, Psidium guajava, vitamin c So 12-Tháng 5/2022 371 ... al (2007) Các dịch chiết có hiệu ức chế vi khuẩn p acnes thấp so với cao chiết trái ổi sẻ Tuy nhiên, hiệu ức chế vi khuẩn p acnes cao trái ổi sẻ thấp so với cao thô ethanol vỏ trái l? ??u kháng vi. .. cao l? ?/ ethanol, MIC trái/ nước trái/ acid xấp xỉ Giá trị MBC cho loại cao Khả kháng khuẩn cao chiết l? ?/ ethanol xác định dãy nồng độ cao từ l, 25-80mg/mL, giá trị MIC MBC 1,25 100 mg/mL Khả kháng khuẩn. .. acid HC1 tỉ l? ?? tương tự không chứa cao chiết Các nghiệm thức tiến hành với l? ??n l? ??p l? ??i Phân l? ??p định danh dòng vi khuẩn gây mụn Mẫu vi khuẩn gây mụn l? ??y từ sinh vi? ?n bị mụn trứng cá Trường Đại