Tap chi Y hoc Tham hoa va Bong So 3 30 6 2021 pdf 68 TCYHTH&B số 3 2021 NGHIÊN CỨU IN VIVO VÀ IN VITRO VỀ BĂNG CELLULOSE VI KHUẨN CHỨA HẠT NANO SULFADIAZIN BẠC SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỎNG Xiaoxiao Wen[.]
68 TCYHTH&B số - 2021 NGHIÊN CỨU IN VIVO VÀ IN VITRO VỀ BĂNG CELLULOSE VI KHUẨN CHỨA HẠT NANO SULFADIAZIN BẠC SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỎNG Xiaoxiao Wen, Yudong Zheng cộng Theo Progress in Natural Science: Materials International 25 (2015) 197–203 Lược dịch: Hoàng Mỹ Hạnh Bệnh viện Bỏng Qu c gia Lê H u Trác TÓM TẮT Sử dụng phương pháp siêu âm để tạo hạt Sulfadiazin Bạc (SSD) trạng thái phân tán đồng nhất, sau đ hạt micro SSD hạt nano SSD tách b ng phương pháp ly tâm Các hạt SSD c kích thước nhỏ ngâm tẩm vào màng cellulose vi khuẩn (BC) để tạo màng phức hợp BC-SSD sử dụng điều trị bỏng Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM để kiểm tra hình thái bề mặt màng BC-SSD Việc k t hợp SSD vào màng BC-SSD xác định b ng phương pháp nhiễu xạ tia X Các thử nghiệm kháng khuẩn ng nghiệm cho thấy BC-SSD c hiệu diệt khuẩn cao đ i với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh E.coli Hiệu BC-SSD trình liền v t thương bỏng đánh giá b ng mơ hình nghiên cứu chuột Nghiên cứu so sánh cho thấy v t thương điều trị b ng BC-SSD c t c độ liền v t thương cao S lượng vi khuẩn phân lập từ v t thương điều trị b ng BC-SSD nhiều so với nh m chứng Phân tích mơ học xác nhận ti n trình biểu mơ h a ti n triển t t v t thương điều trị b ng BC-SSD K t màng phức hợp BC-SSD c thể loại băng v t thương đầy triển vọng điều trị bỏng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1 2.1 Chuẩn bị hạt SSD Hỗn dịch SSD (2%, pH 7,0) nước phân tán máy nghiền tế bào siêu âm (SCIENTZ, JY92-II, China) 90 phút để thu hạt SSD Sau hỗn dịch hạt SSD ly tâm 30 Ngày nhận bài: 03/6/2021, Ngày duyệt bài: 18/6/2021 phút với tốc độ 3000 vòng/phút Các hạt SSD lơ lửng dung dịch hạt SSD kết tủa phân tách thành mẫu riêng biệt Đường kính hạt SSD xác định máy phân tích hạt (Beckman Colter, DelsaTM Nano C, USA) 2.2 Ngâm tẩm SSD vào BC Màng BC (do Công ty TNHH Hainan Yida Food, China sản xuất) ngâm 24h vào mẫu SSD riêng biệt, mẫu chứa hạt SSD dạng phân tán lơ lửng, TCYHTH&B số - 2021 mẫu chứa hạt SSD dạng kết tủa Sau mẫu làm khơ nhiệt độ phòng để loại bớt hàm ẩm dư thừa 2.3 Đặc tính màng phức hợp BCSSD 2.3.1 Phân tích kính hiển vi điện tử quét SEM Các mẫu nghiên cứu sấy thăng hoa thiết bị sấy đông khô chân không 500C Vàng phủ lên mẫu để tăng độ tương phản Ảnh mẫu nghiên cứu chụp độ phóng đại khác kính hiển vi điện tử quét SEM (Carl Zeiss, AURIGA Cross Beam FIB/SEM station, Germany) 2.3.2 Phân tích phương pháp nhiễu xạ tia X Cấu trúc màng BC-SSD phân tích máy nhiễu xạ tia X Dải góc quét từ 100 đến 700, tốc độ quét 100/phút 2.4 Đặc tính kháng khuẩn màng BC-SSD Tính kháng khuẩn màng BC-SSD nghiên cứu chủng vi khuẩn P aeruginosa (ATCC10211), E coli (ATCC44113) S aureus (ATCC26085) Gạc thông thường gạc thương phẩm có chứa bạc (Coloplasts Ag nonadhesive foam dressing) dùng để làm mẫu đối chứng âm tính dương tính tương ứng Các chủng S aureus, E coli P aeruginosa nuôi cấy môi trường nuôi cấy tụ cầu, môi trường xanh methylen-eosin môi trường thạch máu tương ứng, sau dung dịch mơi trường ni cấy pha lỗng với nước muối vô trùng để đạt tới nồng độ 1x105 CFU/ml 69 Đối với phương pháp khuếch tán đĩa thạch, mẫu BC-SSD nghiên cứu cắt thành miếng hình trịn đường kính 6mm, hấp vơ trùng nồi hấp autoclav 1200C 20 phút Tiếp theo miếng BC-SSD đặt vào đĩa thạch cấy vi khuẩn (tổng số miếng cho đĩa), đĩa thạch ủ ấm 370C 24h sau đưa để xác định vùng ức chế vi khuẩn Đối với với phương pháp pha loãng ống nghiệm, mẫu nghiên cứu BC-SSD (trọng lượng 0,4g) cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 2,5ml mơi trường cấy vi khuẩn, sau lắc 24h 370C Số lượng vi khuẩn có ống nghiệm xác định cách đổ dàn dung dịch ống nghiệm lên đĩa thạch dinh dưỡng Tỷ lệ giảm số lượng vi khuẩn tỷ lệ kìm khuẩn xác định theo công thức sau: % tỷ lệ kìm khuẩn = (B-A)/(Bx100) Trong đ : A - số lượng hình thành khuẩn lạc/ml (CFU/ml) mẫu sau 24h; B - số lượng khuẩn lạc hình thành (CFU/ml) mẫu đối chứng âm tính sau 24h 2.5 Tiến trình liền vết thương bỏng in vivo 2.5.1 Thử nghiệm in vivo Chuột Wistar (trọng lượng 250g) sử dụng nghiên cứu Tất trình nghiên cứu tuân theo quy tắc đạo đức Sau gây mê với liều 45mg Natri Pentobarbital cho 1kg cân nặng, chuột cạo lông khử trùng cực ethanol 75% Sử dụng vật nóng 60 0C, áp sát vào vùng da cạo lông lưng chuột 20 giây để tạo vết bỏng có đường kính 70 TCYHTH&B số - 2021 20mm x 20mm Các vết thương che phủ màng BC-SSD-s, nhóm đối chứng sử dụng gạc y tế thông thường Ở ngày thứ 4, 7, 10 14 sau gây bỏng, thay đổi vết thương chuột đánh giá thông qua thay đổi hình thái đại thể, mơ bệnh học vi sinh tất nhóm 2.5.2 Tốc độ liền vết thương Ở ngày thứ 4,7,10 14 sau gây bỏng thực nghiệm, kích thước vết thương xác định cách đo kích thước ảnh chụp vết thương, sử dụng phần mềm Image-Pro plus 6.0 Tốc độ liền vết thương xác định sau: Tốc độ liền vết thương (%) = (A0 – At)/A0 x 100 Trong đ : A0, At diện tích vết thương ban đầu diện tích vết thương sau khoảng thời gian t 2.5.3 Số lượng vi khuẩn Ở thời điểm xác định, giấy lọc vô trùng áp lên bề mặt vết thương, sau quay tờ giấy theo chiều kim đồng hồ 30 giây Các giấy lọc tiếp tục cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml nước muối vô trùng cấy chuyển tiếp lên bề mặt đĩa thạch để xác định số lượng vi khuẩn 2.5.4 Phân tích mơ học Mẫu sinh thiết lấy từ khu vực vết thương xử lý formalin Các mẫu sinh thiết nhúng paraffin nhuộm hematoxylin eosin (H&E) kỹ thuật nhuộm trichrom Masson Các phép đo độ dày lớp biểu bì hạ bì dựa phép đo phần mô nhuộm H&E, sử dụng phần mềm phân tích ảnh (Olympus Cellsens Entry, Tokyo, Japan) 2.6 Phân tích thống kê Phân tích thống kê liệu thực phương pháp phân tích phương sai chiều (ANOVA), với độ tin 95% (P < 0,05) Tất liệu biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn KẾT QUẢ 3.1 Kích thước hạt SSD Biểu đồ Chỉ phân bố khác kích thước hạt SSD TCYHTH&B số - 2021 71 Các hạt SSD không nghiền nhỏ phương pháp siêu âm ly tâm kích thước hạt lớn với phân bố kích thước rộng Đường kính hạt SSD sau siêu âm ly tâm giảm Các hạt SSD-s SSD-p sau ly tâm có kích thước trung bình tương ứng 282,3 ± 22,7nm 2149,5 ± 173,6 nm với phân bố kích thước hạt nhỏ dần lại 2E, 2F) Thêm vào đó, thấy màng phức hợp BC-SSD-s mảnh số lượng hạt SSD bám dính vào so với màng phức hợp BC-SSD-p khả phân bố SSD-s vào mạng lưới BC tốt so với BC-SSD-p Có thể thấy hạt SSD-s phù hợp với việc kết hợp với màng BC kích thước trung bình lỗ màng BC xấp xỉ hàng trăm nanometers Để xác định cấu trúc tinh thể BC, SSD BC-SSD sử dụng phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X (Biểu đồ 3) Đối với BC nguyên thể, đỉnh nhiễu xạ quan sát góc 14,80, 16,30 and 22,60 tương ứng với mặt phẳng tinh thể (1-10), (110), (200) Đối với SSD, đỉnh nhiễu xạ quan sát góc 8,80, 10,210 18,490 tương ứng với mặt phẳng (002), (010) (020) Trong BC-SSD-p BC-SSD-s, đỉnh nhiễu xạ BC giữ nguyên, cho thấy hạt SSD không làm ảnh hưởng tới cấu trúc tinh thể BC Các đỉnh nhiễu xạ SSD bên BC-SSD-p quan sát góc 10,210 18,490 cao so với đỉnh nhiễu xạ SSD quan sát bên BCSSD-p 3.2 Cấu trúc BC-SSD 3.2.1 Hình thái BC BC-SSD Biểu đồ hình ảnh hiển vi SEM BC BC-SSD độ phóng đại khác Quan sát biểu đồ 2-D, thấy BC có cấu trúc mạng lưới dạng sợi với độ xốp cao Ở độ phóng đại thấp quan sát hạt SSD-s SSD-p bám dính màng BC Ở độ phóng đại cao (Biểu đồ (A)-(C)) quan sát thấy cấu trúc BC không thay đổi sau ngâm tẩm với SSD (Biểu đồ 3.2.2 Cấu trúc tinh thể BC BC-SSD 72 TCYHTH&B số - 2021 3.3 Đặc tính kháng khuẩn BC-SSD Tác dụng kháng khuẩn BC-SSD S aureus, E coli P aeruginosa xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Biểu đồ 4) Trong tất thử nghiệm, BC-SSD-s BC-SSDp cho thấy có vùng ức chế vi khuẩn, cịn gạc thơng thường khơng xuất vùng ức chế vi khuẩn Màng phức hợp BC- SSD-p tạo vùng ức chế vi khuẩn cao BC-SSD-s nồng độ SSD BCSSD-p cao so với BC-SSD-s Tuy nhiên, màng BC-SSD-s có hiệu kháng khuẩn tốt với vùng ức chế vi khuẩn tương đương với loại băng thương mại chứa Bạc (Băng Coloplast Ag) TCYHTH&B số - 2021 Tác dụng kháng khuẩn BC-SSD chủng vi khuẩn điển hình được xác định phương pháp pha loãng ống nghiệm Kết khuẩn Bảng Cả màng BC-SSD-s BC-SSD-p có hiệu kháng khuẩn cao 99% chủng vi khuẩn E coli, S aureus P aeruginosa Kết cho thấy hiệu kháng khuẩn BC-SSD-s tương tự với hiệu kháng khuẩn băng thương mại chứa bạc (sự khác biệt không đáng kể với P > 0,05) Do BC-SSD-s sử dụng băng vết thương kháng khuẩn 73 3.4 Tác dụng in vivo BC-SSD trình liền vết thương vết bỏng Do hạt SSD BC-SSD-p lớn để thâm nhập vào mạng lưới cấu trúc dạng sợi BC nên BC-SSD-s lựa chọn để thử nghiệm tác dụng điều trị vết bỏng Các hạt SSD kích cỡ lớn rơi khỏi màng BC gây ảnh hưởng xấu tới khả tương thích sinh học tế bào 3.4.1 Kiểm tra tổng thể Hình cho biết hình ảnh đại thể vết thương trình điều trị thời điểm 4, 7, 10 14 ngày Hiệu liền vết thương 74 nhóm sử dụng BC-SSD-s cao so với nhóm sử dụng gạc thơng thường Ngày thứ 4, khơng thấy có tượng nhiễm trùng tượng co rút vết thương nhóm sử dụng BC-SSD-s, nhóm sử dụng băng gạc thơng thường có tượng da bị xuất huyết Ngày thứ 7, vết thương nhóm sử dụng BC-SSD-s có tượng hình thảnh vảy nhóm sử dụng gạc có mủ 3.4.2 Sự giảm kích thước vết thương Tốc độ liền vết thương tính tốn biểu thị biểu đồ 5G Sau ngày, tốc độ liền vết thương nhóm dùng BC-SSD-s cao so với nhóm sử TCYHTH&B số - 2021 Ngày thứ 10, vết thương nhóm sử dụng gạc thơng thường bắt đầu hình thành vảy nhóm sử dụng BCSSD-s liền vết thương phần có tượng bong vảy Ngày 14, phần lớn vết thương nhóm dùng màng BC-SSD-s khỏi hẳn Tuy nhiên nhóm dùng gạc thơng thường lác đác xuất sưng tấy mẩn đỏ dụng gạc thông thường với khác biệt có ý nghĩa thống kê Ở ngày thứ 14, tỷ lệ liền vết thương nhóm sử dụng BCSSD-s 92,35%, nhóm sử dụng gạc thơng thường 78,83%, điều chứng minh màng BC-SSD-s có TCYHTH&B số - 2021 hiệu cao việc thúc đẩy tiến trình liền vết thương vết bỏng 3.4.3 Sự giảm vi khuẩn bề mặt vết thương Quan sát biểu đồ 5H thấy số lượng vi khuẩn bề mặt vết thương có xu hướng tăng ngày Tuy nhiên số lượng vi khuẩn vết thương sử dụng BC-SSD-s thấp so với nhóm sử dụng gạc thơng thường Sau ngày bắt đầu có giảm đáng kế số lượng vi khuẩn vết thương nhóm Nhóm sử dụng BC-SSD-s số lượng vi khuẩn giảm xuống 103 CFU/cm sau ngày Tuy nhiên nhóm sử dụng gạc thơng thường, ngày 14, số lượng vi khuẩn mức 104 CFU/cm 3.4.4 Kiểm tra mô học Kết kiểm tra mô học mẫu thử nghiệm mẫu đối chứng thể biểu đồ Quan sát mẫu H&E thấy tiến trình biểu mơ hóa nhóm sử dụng BC-SSD tốt so với nhóm sử dụng gạc thơng thường Ở ngày 14, nhóm sử dụng BC-SSD-s nhóm chứng quan sát cấu trúc lớp biểu bì hạ bì Tuy nhiên, vết thương nhóm dùng BCSSD-s lành hẳn khơng có tượng sừng hóa biểu bì nhóm chứng có tượng kéo dài mơ biểu bì vào lịng vết thương Hơn cấu trúc mơ học nhóm đối chứng xếp khơng có tổ chức nhóm sử dụng BC-SSD-s Độ dày trung bình lớp biểu bì hạ bì tính tốn cách đo hình thái mơ học vùng vết thương (Biểu đồ 5I) Độ dày biểu bì trung bình nhóm sử dụng BC-SSD-s 63mm, nhóm chứng 41 mm 75 Độ dày hạ bị trung bình nhóm sử dụng BC-SSD-s 149mm nhóm chứng 95mm Sử dụng phương pháp nhuộm trichrome Masson, sinh thiết mô cho thấy collagen sản sinh nhiều nhóm sử dụng BC-SSD-s Ở ngày thứ 14, quan sát sợi collagen trưởng thành lớp hạ bì nhóm sử dụng BC-SSD-s, nhóm đối chứng sợi collagen chưa trưởng thành BÀN LUẬN Bỏng tổn thương phức tạp, phương pháp điều trị vết bỏng ảnh hưởng đáng kể đến thời gian liền vết thương Băng vết thương bỏng lý tưởng cần có khả ngăn chặn xâm nhập vi khuẩn Trong nghiên cứu này, chứng minh rằng, nghiên cứu in vivo in vitro, màng phức hợp chứa BC SSD có khả chống lại phát triển vi khuẩn Để đưa hạt SSD vào hệ thống mạng lưới BC, đường kính hạt SSD cần kiểm sốt phạm vi thích hợp Sau ly tâm, hạt SSD-s có kích cỡ trung bình 282,3 nm, kích cỡ phù hợp cho thâm nhập hạt SSD vào mạng lưới sợi màng BC BC tập hợp mạng lưới sợi nhỏ, có cấu trúc xốp cao có tính ưa nước, điều giải thích cho đặc tính hút nước mạnh độ bền kéo cao BC Việc ngâm tẩm SSD vào BC không làm ảnh hưởng tới cấu trúc mạng lưới nano 3D BC, tính chất màng BC giữ nguyên hệ phức hợp màng BC-SSD 76 Như báo cáo, màng BCSSD có hiệu diệt khuẩn cao in vitro Trong nghiên cứu này, màng phức hợp BC-SSD-p cho vùng ức chế vi khuẩn rộng so với màng BC-SSD-s hàm lượng SSD BC-SSD-p cao Tuy nhiên màng BC-SSD-s cho hiệu diệt khuẩn tốt Các hạt SSD màng BC-SSD-p khó thẩm thấu sâu vào bên màng Các hạt SSD cỡ lớn rơi khỏi màng Một số nghiên cứu cho thấy lượng lớn SSD gây tác dụng phụ làm chậm trình liền vết thương tác dụng gây độc tế bào Do màng BC-SSD-s lựa chọn đánh giá mơ hình nghiên cứu chuột Đánh giá tác dụng màng BC-SSDs nghiên cứu in vivo thông qua so sánh tác dụng liền vết thương với nhóm đối chứng sử dụng băng gạc thơng thường Màng BC-SSD-s làm giảm tình trạng sưng nề vết bỏng, thúc đẩy nhanh trình liền vết thương Từ nghiên cứu in vivo, cho thấy màng BC-SSD-s có tính kháng khuẩn trì hiệu kháng khuẩn lên tới 14 ngày Các vùng bỏng nông dễ dàng chuyển thành bỏng sâu có tình trạng nhiễm trùng Do điều quan trọng giảm tình trạng nhiễm trùng xâm nhập cách giảm số lượng vi khuẩn vết thương Quan sát mẫu sinh thiết nhuộm màu hematoxylin eosin (H&E) thấy nhóm sử dụng BC-SSD-s có tái biểu mơ hóa sớm so với nhóm chứng Đối với mẫu sinh thiêt sử dụng kỹ thuật nhuộm trichrom Masson, cho thấy có xuất Collagen nhiều nhóm sử dụng BC-SSD so với nhóm chứng TCYHTH&B số - 2021 Các kết nhóm sử dụng BC-SSD có tốc độ liền vết thương cao so với nhóm chứng Điều giảm vi khuẩn vết thương Với việc loại bỏ vi khuẩn vết thương, giai đoạn sau trình chữa lành vết thương thúc đẩy cách hiệu Ở nhóm chứng, xuất vi khuẩn vi sinh vật ức chế việc đóng vết thương tiến trình liền vết thương bị chậm lại Nhóm sử dụng BCSSD, lớp biểu bì dày đáng kể ngày thứ 14 so với nhóm chứng Kết in vivo tác dụng làm liền vết thương kháng khuẩn nhóm sử dụng BC-SSD tốt so với nhóm chứng KẾT LUẬN Màng phức hợp BC-SSD có hiệu kháng khuẩn có tính tương thích sinh học sử dụng loại băng vết thương Đã tạo hạt nano SSD phân tán tốt với phân bố kích thước hẹp việc đưa SSD vào BC không làm ảnh hưởng đến cấu trúc tổng thể mạng lưới nanofibril BC Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa, màng phức hợp BC-SSD cho thấy có hiệu kháng khuẩn S aureus, P aeruginosa E coli Trên nghiên cứu in vivo, màng phức hợp BC-SSD có tác dụng ngăn chặn nhiễm khuẩn Quan sát hình ảnh mơ học, vết thương điều trị BC-SSD có tốc độ biểu mơ hóa sớm so với nhóm đối chứng Do màng BC-SSD chứng minh có hiệu việc diệt khuẩn chữa lành vết bỏng ... định, gi? ?y lọc vô trùng áp lên bề mặt vết thương, sau quay tờ gi? ?y theo chi? ??u kim đồng hồ 30 gi? ?y Các gi? ?y lọc tiếp tục cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml nước muối vô trùng c? ?y chuyển tiếp lên... BC-SSD-s cao so với nhóm sử TCYHTH&B số - 2021 Ng? ?y thứ 10, vết thương nhóm sử dụng gạc thơng thường bắt đầu hình thành v? ?y nhóm sử dụng BCSSD-s liền vết thương phần có tượng bong v? ?y Ng? ?y 14, phần... dụng phần mềm phân tích ảnh (Olympus Cellsens Entry, Tokyo, Japan) 2.6 Phân tích thống kê Phân tích thống kê liệu thực phương pháp phân tích phương sai chi? ??u (ANOVA), với độ tin 95% (P < 0,05)