Nghiên cứu khoa học Vietnam Journal of Food Control vol 5, no 2, 2022 507 Xác định hàm lượng tinh bột bền trong nền mẫu thực phẩm bằng phương pháp enzyme Đoàn Thu Thương1*, Mạc Thị Thanh Hoa1, Trần Hù[.]
Nghiên cứu khoa học Xác định hàm lượng tinh bột bền mẫu thực phẩm phương pháp enzyme Đoàn Thu Thương1*, Mạc Thị Thanh Hoa1, Trần Hùng Sơn1, 2, Cao Cơng Khánh1 Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Hà Nội, Việt Nam Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc (KIST), Seoul, Hàn Quốc (Ngày đến tòa soạn: 13/09/2022; Ngày chấp nhận đăng:03/10/2022) Tóm tắt Tinh bột bền hay cịn gọi tinh bột kháng (Resistant Starch) loại chất xơ quan tâm ngày nhiều nhờ tác động có lợi với sức khỏe người Nghiên cứu tiến hành thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tinh bột bền theo phương pháp AOAC 2002.02 Phương pháp thẩm định thông số đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lập trung gian, độ đạt theo yêu cầu AOAC Đánh giá độ vững phương pháp cách so sánh hàm lượng tổng tinh bột bền tinh bột tiêu hóa với hàm lượng tinh bột tổng số theo phương pháp AOAC 996.11 Phương pháp ứng dụng để phân tích 36 mẫu thực, kết cho thấy hàm lượng tinh bột bền khác nhau, dao động khoảng - 42 % tùy theo nguồn gốc, đặc điểm cấu trúc cách biến tính tinh bột Từ khóa: tinh bột bền, tinh bột kháng, AOAC 2002.02, chất xơ ĐẶT VẤN ĐỀ Q trình tiêu hóa tinh bột q trình gồm nhiều bước, bắt đầu α-amylase nước bọt miệng, sau α-amylase tuyến tụy cuối glucoamylase niêm mạc ruột, maltase- glucoamylase sucrase-isomaltase chuyển đổi thành sản phẩm đường đơn hấp thu trực tiếp vào mạch máu Tinh bột phân loại theo tốc độ tiêu hóa chúng: tinh bột tiêu hóa nhanh (rapidly digestible starch -RDS), tinh bột tiêu hóa chậm (slowly digestible starch-SDS) tinh bột bền (resistant starch-RS), RDS tiêu hóa ruột non dẫn đến đường huyết tăng nhanh SDS tiêu hóa với tốc độ chậm hơn, RS có khả chống lại thủy phân enzyme vòng 120 phút kể từ bắt đầu tiêu hóa, đó, RS khơng làm tăng đường huyết sau ăn Thay vào đó, vi sinh vật có sẵn ruột già lên men RS thành acid chuỗi béo ngắn (chủ yếu butyrat, propionat, acetat) khí (CO2, CH4, H2) Các acid béo chuỗi ngắn ruột già có ý nghĩa quan trọng sức khỏe ruột kết, ngồi việc giảm khả hình thành hội chứng ruột kích thích, bệnh viêm ruột, tim mạch, … [1-2] * Điện thoại: 0377187305 507 Email: doanthuthuong0202@gmail.com Vietnam Journal of Food Control - vol 5, no 2, 2022 Xác định hàm lượng tinh bột bền mẫu thực phẩm … Mặc dù q trình tiêu hóa in vivo tiêu hóa tinh bột mơi trường giả lập nhận quan tâm đáng kể, cần có phương pháp in vitro cải tiến, xác nhận để phản ánh trình tiêu hóa in vivo vơ số điều kiện mà tinh bột gặp phải q trình tiêu hóa động vật người Phân tích hàm lượng chất xơ tinh bột bền thực phẩm dựa q trình thủy phân carbohydrat có sẵn mẫu, kèm theo q trình phân giải protein để loại bỏ protein bao quanh tinh bột làm cho tinh bột dễ bị thủy phân amylase phương pháp Englyst để phân tích chất xơ thực phẩm [1] Các phương pháp thiết kế đặc biệt để xác định hàm lượng tinh bột bền thực phẩm bao gồm phương pháp AOAC 2002.02 phương pháp Englyst Phương pháp AOAC 991.43 xác định hàm lượng tổng chất xơ thực phẩm dạng cặn lọc mẫu thực phẩm sau phân hủy α-amylase điều nhiệt từ Bacillus licheniformis [3] Phương pháp nhanh chóng thích hợp để xác định tinh bột bền nhiệt, số loại tinh bột bền, chẳng hạn hạt tinh bột khoai tây sống (RS2), bị phá hủy trình xử lý mẫu Phương pháp Englyst (1992) để phân tích tinh bột bền nhằm mơ q trình tiêu hóa người cách xác đạt ống nghiệm Phương pháp sử dụng dịch chiết xuất từ tụy tạng lợn thô trộn với amyloglucosidase để thủy phân tinh bột thời gian Các mẫu thường sử dụng thực phẩm nguyên hạt đun sôi thực phẩm sống trước thủy phân Phần dịch thu sau trình thủy phân enzym lấy sau 20 phút 120 phút để xác định tương ứng tinh bột tiêu hóa nhanh tinh bột tiêu hóa chậm; tinh bột bền xác định phần tinh bột chưa tiêu hóa cịn lại tổng lượng tinh bột mẫu Một số biến thể phương pháp sử dụng trypsin, acid chlohydric hai để mơ q trình tiêu hóa tốt q trình tiêu hóa sinh lý Tuy nhiên, phương pháp địi hỏi kỹ thuật điều kiện tuân thủ nghiêm ngặt thời gian [4-5] Phương pháp AOAC 2002.02 phương pháp glucogenic thiết kế để sử dụng với mẫu tinh bột thô cho phép đo trực tiếp tinh bột bền hạt tinh bột nguyên vẹn Các mẫu thủy phân 16 cách sử dụng α-amylase tụy lợn tinh khiết amyloglucosidase từ Aspergillus niger Phần lại thu sau phân hủy làm khô phân tán dung dịch kali hydroxit tiêu hóa cách sử dụng amyloglucosidase để tạo phần kháng tinh bột Tổng hàm lượng tinh bột mẫu xác định tổng phần tinh bột tiêu hóa tinh bột bền [3] Hàm lượng tinh bột tổng số xác định AOAC 996.1, sử dụng hệ enzyme amylase amyloglucosidase để thủy phân tinh bột, phương pháp đối chứng để xác định hàm lượng tinh bột tổng tống mẫu so với AOAC 2002.02 Hiện nay, tinh bột bền bổ sung vào sản phẩm cho bệnh nhân tiểu đường bánh kẹo, sữa … Dựa tính thực tế điều kiện phịng thí nghiệm, tính ứng dụng ưu điểm phương pháp, nghiên cứu sử dụng phương pháp Ref 508 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Đoàn Thu Thương, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Cao Công Khánh AOAC.2002.02 để thẩm định ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng tinh bột bền số mẫu thực thị trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: mẫu CRM tinh bột bền Megazyme 30 mẫu nguyên liệu thực phẩm, thực phẩm bổ sung có chứa tinh bột bền gửi đến Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia 06 mẫu thực phẩm có chứa tinh bột bền mua thị trường 2.2 Hóa chất Amyloglucosidase 3,300 Unit/mL; Pancreatic α-amylase (3 Ceralpha Units/mg); chất chuẩn Glucose mg/mL, thuốc thử GOPOD Megazyme hóa chất tinh khiết phân tích khác acid maleic, acid acetic, kali hydroxid, calci clorid, natri hydroxid, ethanol Merck 2.3 Thiết bị Máy đo quang phổ UV - VIS Biospectrometer Kinetic (sản xuất: Đức), bể điều nhiệt trì nhiệt độ 50 ± 0,5oC, cân phân tích số thiết bị phụ trợ khác phịng thí nghiệm 2.4 Nội dung nghiên cứu 2.4.1 Thẩm định phân tích mẫu thực Thẩm định phương pháp với thông số sau: - Đường chuẩn: chuẩn glucose - nhận biết thuốc thử GOPOD - Độ lặp lại: thực mẫu CRM, mẫu tinh bột bền hàm lượng cao, mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp - Độ tái lập: thực mẫu CRM, mẫu tinh bột bền hàm lượng cao, mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp; thực khác thời điểm điều kiện so với thí nghiệm xác định độ lặp lại - Độ đúng: phân tích mẫu CRM so sánh với giá trị chứng nhận Megazyme - Độ vững: so sánh thông qua hàm lượng tinh bột tổng số, xác định thông qua phương pháp tiêu chuẩn AOAC 996.11 Quy trình thực đánh giá độ vững theo AOAC 996.11 mơ tả Hình Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 509 Xác định hàm lượng tinh bột bền mẫu thực phẩm … Tinh bột Alpha amylase, 100oC, ± DMSO Maltodextrin Amyloglucosidase Glucose GOPOD Đo quang 510 nm Hình Sơ đồ quy trình phân tích mẫu theo AOAC 996.11 Quy trình thực theo theo AOAC 2002.02 mơ tả Hình Hình Sơ đồ quy trình phân tích mẫu 510 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Đoàn Thu Thương, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Cao Công Khánh Mẫu trắng đệm acetate 100 mM, pH 4,5 thực tạo màu thuốc thử đồng thời với chuẩn mẫu thủy phân Quinoneimine phức hợp có màu tím đỏ thu sau phản ứng glucose (sản phẩm tạo thành sau thủy phân tinh bột) phản ứng với thuốc thử GOPOD, tạo chênh lệch hấp thụ quang Abs (Absorbance) bước sóng 510 nm Abs mẫu thử so sánh với tín hiệu chuẩn glucose tạo màu tương tự mẫu thử Kết hàm lượng tinh bột bền xác định theo công thức: K P × Q′ × S × T × MNN MVW P × QY × S × T × N, Z O= DàF GượJK L × = MNNK P′ × N, M × U × MNNN MXN P′ × U A chênh lệch độ hấp thụ 0,1 mL dung dịch mẫu thử so với mẫu thử trắng; A’ chênh lệch độ hấp thụ 0,1 mL dung dịch chuẩn so với mẫu thử trắng; D hệ số pha loãng mẫu; V thể tích định mức (mL); C’ nồng độ điểm chuẩn glucose (µg/mL); 0,1 thể tích dịch sử dụng tạo màu thuốc thử; 100/1000 hệ số chuyển đổi từ µg/mg sang g/100g; m khối lượng phần mẫu thử, tính mg; 162/180 hệ số chuyển đổi từ gluccose tự sang glucose liên kết Ghi : tín hiệu Abs mẫu so với điểm chuẩn chênh lệch khoảng ± 20% 2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu thống kê phần mềm Microsoft Excel 2020 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thẩm định phương pháp Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu AOAC, Tiến hành phân tích mẫu CRM (Mẫu 1), mẫu tinh bột bền hàm lượng cao (Mẫu 2), mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình (Mẫu 3) mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp (Mẫu 4) 3.1.1 Đường chuẩn Tiến hành tạo màu thuốc thử với chuẩn đường Glucose, thực với dãy nồng độ 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 mg/mL Ghi lại Abs (Absorbance) bước sóng 510 nm Kết Bảng cho thấy khoảng nồng độ khảo sát (0,1 - 1,0 mg/mL) có tương quan tuyến tính giá trị Abs đo nồng độ, hệ số tương quang hồi quy R2 = 0,9999; giá trị Bias < 15% Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 511 Xác định hàm lượng tinh bột bền mẫu thực phẩm … Bảng Đường chuẩn Glucose C (mg/mL) Abs C' (mg/mL) Bias Glucose 1.2 y = 1.0887x + 0.0123 R² = 0.9999 0,100 0,200 0,500 1,000 a b 0,123 0,231 0,552 1,103 1,0887 0,0123 0,102 0,201 0,496 1,002 - 1,64 - 0,42 0,86 - 0,18 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 3.1.2 Độ lặp lại - Độ tái lập Tiến hành phân tích mẫu CRM (Mẫu 1), mẫu tinh bột bền hàm lượng cao (Mẫu 2), mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình (Mẫu 3) mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp (Mẫu 4) Kết thể Bảng Bảng Độ lặp lại độ tái lập phương pháp Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Hàm lượng trung bình g/100g 38,5 41,7 12,1 1,48 Độ lặp lại (n = 6) Độ tái lập (n = 9) RSD % Yêu cầu RSD % Yêu cầu 1,72 % 1,71 % 1,17 % 2,63 % < 1,90 % < 1,90 % < 1,90 % < 2,70 % 1,59 % 1,37 % 1,15 % 5,46 % < 3,00% < 3,00 % < 4,00 % < 6,00 % Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ lặp lại độ tái lập có RSD đáp ứng yêu cầu AOAC khoảng hàm lượng từ 1,48% - 41,7% mẫu thực Theo hướng dẫn AOAC, phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng tinh bột bền khoảng - 64%, số liệu thực tế Bảng cho thấy mức hàm lượng 1,48% (< 2%) phương pháp đáp ứng tốt Vì vậy, phương pháp áp dụng để phân tích mẫu thực tế thị trường mức hàm lượng tinh bột bền khác 3.1.3 Độ Tiến hành phân tích mẫu CRM Megazyme có CoA QC = 39 ± 2%, kết phân tích thể Bảng Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu vật liệu chuẩn chứng nhận Megazyme So với CoA mẫu CMR, độ lệch thực tế từ 0,1 - 0,8% (< 2%) Để đạt độ tốt, trình xử lý mẫu, trình thủy phân ban đầu ống ly tâm đặt nằm ngang, đảm bảo tiếp xúc bề mặt enzyme mẫu, tránh lắng cặn, tuân thủ điều kiện thời gian nhiệt độ Quá trình ly tâm, thu cắn cần thực nhiệt độ thấp, đồng thời thực nhẹ nhàng trình nhấc mẫu sau ly tâm giảm bớt sai số mẫu 512 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Đoàn Thu Thương, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Cao Công Khánh Bảng Độ thu hồi phương pháp mẫu CRM Hàm lượng (g/100g) Độ lệch % Yêu cầu Kết luận 39,1 0,1 38,7 0,3 39,3 0,3 37 - 41 % Đạt 38,5 0,5 38,2 0,8 39,1 0,1 3.1.4 Độ vững AOAC 996.11 (AACC 76-13.01) phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng tinh bột tổng số Hàm lượng tinh bột tổng số theo phương pháp xác định tinh bột bền (AOAC 2002.02) xác định tổng phần tinh bột tiêu hóa tinh bột bền Độ vững phương pháp xác định dựa thông số thu thực mẫu CRM (mẫu 1), tinh bột bền có hàm lượng cao (mẫu 2) tinh bột bền có hàm lượng thấp (mẫu 4) Kết thu được xác định theo bảng với α mức ý nghĩa, lấy giá trị α = 0,05 (tương ứng với độ tin cậy 95%) Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Bảng So sánh hai phương sai Hệ số F thực nghiệm α = 0,05; 2,11 k1 = 8; k2 = α = 0,05 2,86 k1 = 5; k2 = α = 0,05 3,99 k1 = 5; k2 = F tra bảng 3,44 5,05 5,05 Bảng So sánh hai giá trị trung bình Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Hệ số α = 0,05 k =16 α = 0,05 k =10 α = 0,05 k =10 Độ lệch chuẩn chung Sc2 Tthực nghiệm Ttra bảng 0,367 0,039 2,12 2,12 0,337 2,228 4,17 2,05 2,228 Nhận xét: Kết thực nghiệm mẫu cho thấy - Giá trị phương sai Fthực nghiệm < Ftra bảng, hai phương sai có khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê - So sánh hai giá trị trung bình cho thấy tthực nghiệm < ttra bảng, khác biệt hai giá trị trung bình khơng có ý nghĩa thống kê Từ số liệu so sánh phương sai giá trị trung bình cho thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê hai phương pháp AOAC 996.11 (AACC 76-13.01) (AOAC 2002.02) Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 513 Xác định hàm lượng tinh bột bền mẫu thực phẩm … 45 41.2 42.4 3.2 Phân tích mẫu thực tế Phương pháp AOAC 2002.02 áp dụng để phân tích mẫu thực Các mẫu nghiên cứu 30 mẫu khách hàng gửi đến Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, tên mẫu khách hàng cung cấp mã hóa phân thành nhóm: thực phẩm bổ sung (BS), tinh bột bền tự nhiên (TN), bột đậu đen (DD), tinh bột biến tính (BT), bột đậu xanh (ĐX) mẫu thực phẩm chứa tinh bột bền mua thị trường phân thành nhóm thực phẩm (TP) Kết phân tích hàm lượng tinh bột bền mơ tả Hình HÀM LƯỢNG (%) 40 35 22.4 30 16 9.17 8.77 12.1 9.13 4.08 3.57 3.29 5.9 8.63 7.86 2.26 3.69 2.78 8.4 7.74 10.1 10.6 14 5.73 3.68 0.79 1.61 1.02 1.08 1.22 10 11.7 9.74 11.4 15 15.1 20 18.1 18.6 25 TPBS Kháng tinh bột Bột đậu đen tự nhiên BS1 DD3 ĐX3 BS2 DD4 ĐX4 BS3 DD5 ĐX5 TN1 DD6 ĐX6 TN2 DD7 ĐX7 Tinh bột biến tính TN3 DD8 ĐX8 TN4 BT1 TP1 Bột đậu xanh TN5 BT2 TP2 TN6 BT3 TP3 TN7 BT4 TP4 Thực phẩm DD1 ĐX1 TP5 DD2 ĐX2 TP6 Hình Hàm lượng tinh bột bền 36 mẫu thực Kết thực nghiệm 36 mẫu thực cho thấy hàm lượng tinh bột bền có dao động lớn từ 1- 42 %, điều lý giải mẫu có nguồn gốc, đặc điểm cấu trúc biến tính tinh bột khác Phương pháp có độ phủ rộng, ứng dụng để phân tích mẫu thị trường KẾT LUẬN Tinh bột bền đóng vai trị prebiotic, ngày quan tâm Phương pháp định lượng hàm lượng tinh bột bền theo AOAC 2002.02 công bố tiến hành rộng rãi với ưu điểm Phương pháp thẩm định đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lập, độ đúng, độ vững đạt yêu cầu AOAC mẫu CRM mẫu thực Phương pháp ứng dụng để phân tích 36 mẫu thực tế, kết cho 514 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Đoàn Thu Thương, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Cao Công Khánh thấy hàm lượng tinh bột bền khác nhau, dao động khoảng - 42 % tùy theo nguồn gốc, đặc điểm cấu trúc cách biến tính tinh bột Kết liệu ban đầu để đánh giá hàm lượng tinh bột bền thực phẩm Phương pháp phù hợp để ứng dụng xác định hàm lượng tinh bột bền thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D F Birt, T Boylston, S Hendrich et al., “Resistant Starch: Promise for Improving Human Health,” Advances in Nutrition, vol 4, no.6, pp 587-601, 2013 [2] Csiro, “Understanding resistant starch and its role in gut health” [Online] Available: https://www.csiro.au/en/research/health-medical/nutrition/resistant-starch [Accessed 09/12/2022] [3] AOAC, “Official methods of analysis of AOAC International [cited 2013 Jan 4]” [Online] Available: http://www.eoma.aoac.org/ [Accessed 09/12/2022] [4] H N Englyst, S M Kingman, and J H Cummings, “Classification and measurement of nutritionally important starch fractions,” European Journal of Clinical Nutrtition, vol 46 (Supp 2), S33-50, 1992 [5] H N Englyst, M E Quigley, and G J Hudson, “Determination of dietary fibre as non-starch polysaccharides with gas-liquid chromatographic, high-performance liquid chromatographic or spectrophotometric measurement of constituent sugars” Analyst (Lond), vol 119, no 7, pp.1497-1509, 1994 Determination of resistant starch content on food samples by enzyme method Doan Thu Thuong1, Mac Thi Thanh Hoa1, Tran Hung Son1, 2, Cao Cong Khanh1 National Institute for Food Control, Hanoi, Vietnam Korea Institute of Science and Technology (KIST), Seoul, Korea Abstract Resistant Starch is a type of fiber of increasing interest due to its beneficial effects on human health This study has validated the method of determining resistant starch content according to AOAC 2002.02 method The method has been validated with parameters of calibration curve, repeatability, intermediate reproducibility, and accuracy as required by AOAC The robustness of the method was evaluated by comparing the content of total resistant starch and digestible starch with the total starch content according to the AOAC 996.11 method The method has been applied to analyze 36 real samples, the results show that the content of resistant starch varies, ranging from - 42 % depending on the origin, structural characteristics and the way starch is modified Keywords: resistant starch, AOAC 2002.02, fiber Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 515 ... tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp - Độ tái lập: thực mẫu CRM, mẫu tinh bột bền hàm lượng cao, mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền. .. để xác định hàm lượng tinh bột tổng số Hàm lượng tinh bột tổng số theo phương pháp xác định tinh bột bền (AOAC 2002.02) xác định tổng phần tinh bột tiêu hóa tinh bột bền Độ vững phương pháp xác. .. hành phân tích mẫu CRM (Mẫu 1), mẫu tinh bột bền hàm lượng cao (Mẫu 2), mẫu tinh bột đậu xanh có hàm lượng tinh bột bền trung bình (Mẫu 3) mẫu tinh bột bền có hàm lượng thấp (Mẫu 4) Kết thể Bảng