BẰNG kỹ THUẬT PCR với các cặp PRIMER được THIẾT kế dựa vào VÙNG DNA LIÊN kết với GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM sắc THỂ GIỚI TÍNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  HỒNG THỊ DUNG XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS LÊ ĐÌNH ĐƠN KS NGUYỄN VŨ PHONG Sinh viên thực HOÀNG THỊ DUNG KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  SEX DETERMINATION IN PAPAYA (Carica papaya L.) BY POLYMERASE CHAIN REACTION WITH PRIMER PAIRS DESIGNED IN SEXUAL CHROMOSOME REGION GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor PhD LÊ ĐÌNH ĐƠN Eng NGUYỄN VŨ PHONG Student HỒNG THỊ DUNG TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba Mẹ sinh thành, nuôi dƣỡng cho có ngày hơm Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ban Chủ Nhiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học tồn thể quý Thầy Cô Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận Thầy Nguyễn Vũ Phong, anh Nguyễn Văn Lẫm tận tình bảo giúp đỡ suốt thời gian qua Các thầy cô, anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt luận văn Các bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học khóa 28 giúp đỡ, động viên học tập nhƣ sống TP HCM, tháng 08 năm 2006 Hoàng Thị Dung iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT HỒNG THỊ DUNG, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH” Giáo viên hƣớng dẫn: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN KS NGUYỄN VŨ PHONG Nội dung thực hiện: ­ Khảo sát quy trình nhiệt để tìm quy trình nhiệt thích hợp cho cặp primer T1, W11 ­ Thực PCR mẫu DNA tổng số mẫu đu đủ với cặp primer T1, W11 ­ Thực multiplex PCR với cặp primer T1, W11 Kết đạt đƣợc: Đã tìm đƣợc quy trình nhiệt ổn định cho cặp primer T1, W11 Kết PCR: lƣỡng tính sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc 0,8 kb 1,5 kb Trên sản phẩm PCR thu đƣợc 0,8 kb Trên đực khơng có sản phẩm PCR Nhƣ vậy, nhận biết đƣợc giới tính đu đủ iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình viii Danh sách bảng ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu đu đủ 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc, phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Các giống đu đủ 2.1.5 Giới tính đu đủ 2.1.6 Di truyền học giới tính đu đủ 2.1.7 Yêu cầu ngoại cảnh 10 2.1.8 Giá trị dinh dƣỡng ý nghĩa kinh tế 11 2.1.9 Tình hình sản xuất trồng trọt 12 2.2 Kỹ thuật PCR 13 2.2.1 Lịch sử PCR 13 2.2.2 Nguyên tắc PCR 14 2.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 14 2.2.4 Ƣu điểm nhƣợc điểm PCR 17 2.2.5 Nguyên tắc xác định giới tính đu đủ 18 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3 Một số nghiên cứu nƣớc nƣớc 18 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Địa điểm thời gian 22 3.1.1 Địa điểm 22 3.1.2 Thời gian 22 3.2 Vật liệu thiết bị 22 3.2.1 Hóa chất 22 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 22 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu trại thực nghiệm 23 3.3.2 Ly trích DNA từ đu đủ phƣơng pháp CTAB 23 3.3.3 Thực phản ứng PCR 25 3.3.4 Điện di sản phẩm PCR 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết ly trích DNA 29 4.2 Kết PCR với cặp primer T1 30 4.2.1 Quy trình nhiệt 30 4.2.2 Quy trình nhiệt 31 4.2.3 Quy trình nhiệt 31 4.2.4 Quy trình nhiệt 32 4.3 Kết PCR với cặp primer W11 33 4.4 Kết PCR với cặp primer T1 W11 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT g: micro gram l: micro lít m: micro mol M: micro mol/lít bp: base pair CTAB: cetytrimethylammonium bromide ctv: cộng tác viên DAF: DNA amlification fingerprinting dNTP: deoxyribonucleotide – – triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ha: hecta kb: kilo base ng: nano gram nm: nano mol PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis PCR: polymerase chain reaction PSDM: papaya sex determination marker RAPD: random amplified polymorphic DNA SCAR: sequence characterized amplified region Ta: annealing temperature TAE: Tris Acetic EDTA TE: Tris EDTA Tm: melting temperature UI: unit international vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ (Carica papaya L.) Hình 2.2 Hoa đu đủ Hình 2.3 Hoa đu đủ lƣỡng tính Hình 2.4 So sánh hoa đu đủ hoa đu đủ lƣỡng tính Hình 2.5 Hoa đu đủ đực Hình 2.6 Chromosome giới tính thực vật 10 Hình 2.7 Kết khuếch đại DAF DNA đu đủ với primer 19 Hình 2.8 Kết PCR 10 giống đu đủ 20 Hình 2.9 Kết PCR với cặp primer SDP-1 SDP-2 20 Hình 4.1 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích 29 Hình 4.2 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích 29 Hình 4.3 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 30 Hình 4.4 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 31 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 32 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với cặp primer W11 theo quy trình nhiệt 33 Bảng 4.7 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 W11 theo quy trình nhiệt 34 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1 Kết lai chéo cá thể đu đủ có giới tính khác cuả Storey Bảng 1.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ giới 12 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer T1 27 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer W11 27 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng multiplex PCR 28 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 Chuyển mẫu nghiền vào eppendorf 1,5 ml, nên lấy lƣợng mẫu đến vạch 0,3 - 0,5 ml eppendorf Cho 700 µl dung dịch ly trích đƣợc làm nóng 60oC vào ống eppendorf Trộn hịa tan cho đồng Ủ eppendorf bồn ủ 60oC, - Trộn hòa phản ứng đồng 15 phút/lần Thêm vào 700 µl phenol-chloroform-isoamyl alcohol, lắc nhẹ nhàng dung dịch đồng màu trắng sữa Ly tâm 13.000 vòng/phút, 15 phút, 25oC Chuyển dịch bên vào eppendorf (khoảng 600 µl) Thêm 600 µl chloroformisoamyl alcohol, lắc nhẹ nhàng Ly tâm 13.000 vòng/phút, 15 phút, 25oC Chuyển dịch bên vào eppendorf (khoảng 500 µl) Thêm vào 300 µl isopropanol lạnh, lắc nhẹ xuất dịch huyền phù Ủ -20oC , qua đêm Ly tâm 13.000 vòng/phút, 15 phút, 4oC Bỏ dịch bên trên, thu kết tủa Rửa tủa ethanol 70% lạnh ( thêm khoảng 500 µl ethanol 70% lạnh) Ly tâm 13.000 vòng/phút, 15 phút, 4oC Bỏ dịch bên trên, làm khô kết tủa tự nhiên hồn tồn Hịa tan kết tủa với 50 µl TE nƣớc cất vơ trùng Trữ dung dịch DNA điều kiện 4oC cho việc sử dụng thƣờng xuyên, trữ lâu dài -20oC Điện di để kiểm tra kết Quy trình ly trích Thực theo quy trình Kurt Weising ctv (1995), nhƣng có vài thay đổi Nghiền khoảng - g mẫu tƣơi dung dịch N2 lỏng cối chày đƣợc khử trùng Nghiền thật kỹ mẫu mịn có màu xanh nhạt Mẫu đƣợc giữ lạnh khơng đƣợc để mẫu bị rã biến màu, tốt nên sử dụng mẫu tƣơi Cắt nhỏ mẫu, tách bỏ gân cho dễ nghiền Chuyển mẫu nghiền vào eppendorf 1,5 ml, nên lấy lƣợng mẫu đến vạch 0,3 - 0,5 ml eppendorf Cho 700 µl dung dịch ly trích đƣợc làm nóng 60oC vào ống eppendof Trộn hịa tan cho đồng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 Ủ eppendorf bồn ủ 60oC, qua đêm Trộn hòa phản ứng vài lần, 15 phút/lần Thêm vào 700 µl chloroform-isoamyl alcohol, lắc nhẹ nhàng dung dịch đồng màu trắng sữa Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 25oC Chuyển dịch bên vào eppendorf (khoảng 600 µl) Thêm 600 µl chloroformisoamyl alcohol, lắc nhẹ nhàng Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 25oC Chuyển dịch bên vào eppendorf (khoảng 500 µl) Thêm vào 300 µl isopropanol lạnh, lắc nhẹ xuất dịch huyền phù Ủ -20oC, qua đêm Ly tâm 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC Bỏ dịch bên trên, thu kết tủa Rửa tủa ethanol 70% lạnh ( thêm khoảng 500 µl ethanol 70% lạnh) Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC Bỏ dịch bên trên, làm khô kết tủa tự nhiên hồn tồn Hịa tan kết tủa với 50 µl TE nƣớc cất vô trùng Trữ dung dịch DNA điều kiện 4oC cho việc sử dụng thƣờng xuyên, trữ lâu dài -20oC Điện di để kiểm tra kết 3.3.3 Thực phản ứng PCR Quy trình nhiệt phản ứng PCR Thử nghiệm quy trình nhiệt để tìm quy trình nhiệt thích hợp cho phản ứng PCR Quy trình nhiệt 1: Tách(denaturation) đoạn DNA: 95oC, phút Tách đoạn DNA: 95oC, 1phút Bắt cặp (annealing): 48oC, 45 giây Lập lại 30 chu kỳ Kéo dài (polymerization): 72oC, phút 72oC, phút.Giữ bảo quản 4oC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 Quy trình nhiệt 2: Tách (denaturation) đoạn DNA: 95oC, phút Tách đoạn DNA: 95oC, 1phút Bắt cặp (annealing): 58oC, 45 giây Lập lại 30 chu kỳ Kéo dài (polymerization): 72oC, phút 72oC, phút Giữ bảo quản 4oC Quy trình nhiệt Tách(denaturation) đoạn DNA: 95oC, phút Tách đoạn DNA: 95oC, 1phút Bắt cặp (annealing): 54oC, 45 giây Lập lại 30 chu kỳ Kéo dài (polymerization): 72oC, phút 72oC, phút Giữ bảo quản 4oC Quy trình nhiệt Tách (denaturation) đoạn DNA: 95oC, phút Tách đoạn DNA: 95oC, 1phút Bắt cặp (annealing): 50oC, 45 giây Lập lại 30 chu kỳ Kéo dài (polymerization): 72oC, phút 72oC, phút Giữ bảo quản 4oC Bố trí thí nghiệm phản ứng PCR Thực PCR theo trình tự sau: Bƣớc 1: thực PCR với cặp primer T1 Thiết kế phản ứng PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer T1 Thành phần Nồng độ cuối phản ứng µl DNA Buffer PCR 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (50mM) 1,5 mM 0,75 µl dNTP’s Mix 0,2 mM 0,5 µl T1-F (10mM) 0,4 mM µl T1-R (10 mM) 0,4 mM µl (10 mM/each) Taq DNA polymerase 1U 0,2 µl (5U/µl) Nƣớc cất vơ trùng 18,05 µl Tổng cộng 25 µl Bƣớc 2: thực PCR với cặp primer W11 Thiết kế phản ứng PCR Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer W11 Thành phần Nồng độ cuối phản ứng µl DNA Buffer PCR 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (50mM) 1,5 mM 0,75 µl 0,2 mM/dNTP 0,5 µl dNTP’s Mix (10 mM/dNTP) W11-F (10mM) 0,4 mM µl T1-R (10 mM) 0,4 mM µl Taq DNA polymerase 1U 0,2 µl (5U/µl) Nƣớc cất vơ trùng Tổng cộng 18,05 µl 25 µl LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Bƣớc 3: sau tối ƣu hóa đƣợc phản ứng PCR với cặp primer T1,W11, tiến hành PCR với cặp primer Thiết kế phản ứng multiplex PCR: Bảng 3.3 Thành phần phản ứng multiplex PCR Thành phần Nồng độ cuối phản ứng µl DNA Buffer PCR 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (50mM) 1,5 mM 0,75 µl dNTP’s Mix 0,2 mM 0,5 µl (10 mM/each) Cặp T1(10mM) 0,4 mM/primer µl Cặp W11(10 mM) 0,4 mM/primer µl Taq DNA polymerase 1U 0,2 µl (5U/µl) Nƣớc cất vơ trùng Tổng cộng 18,05 µl 25 µl 3.3.4 Điện di sản phẩm PCR Đổ gel 1% Cho 0,125 g agarose vào 12,5 ml dung dịch 0,5X TAE Đun sơi hỗn hợp lị viba phút Để nguội dung dịch agarose đến 50 - 55oC, đổ vào khn (có gắn lƣợc) Chờ đến agarose đơng đặc hoàn toàn (sau 30 phút), gỡ lƣợc đặt miếng gel bể điện di theo chiều điện di, cho dung dịch đệm 0,5X TAE vào ngập miếng gel Điện di Hút µl dung dịch sản phẩm PCR + µl dung dịch nạp mẫu điện di, trộn bơm vào giếng gel Đập nắp buồng điện di, cắm điện cực Điện di 100V, 250mA, 30 phút Nhuộm gel với ethidium bromide 0,05%, 15 phút Chụp hình ghi nhận kết điện di máy tính với phần mềm Quatity-one LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết ly trích DNA Để chuẩn bị mẫu DNA tốt cho phản ứng PCR, chúng tơi thực vài thay đổi từ quy trình ban đầu Kurt Weising ctv (1995) Kết ly trích nhƣ sau: Quy trình ly trích DNA tổng số Phần tạp Hình 4.1 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích Quy trình ly trích 2 10 11 12 DNA tổng số Phần tạp Hình 4.2 DNA tổng số ly trích từ đu đủ theo quy trình ly trích LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 Do thực phản ứng PCR nhiễm sắc thể giới tính nên chất lƣợng DNA ba yếu tố quan trọng, định kết PCR Vì vậy, q trình ly trích, chúng tơi cố gắng hồn thiện tốt bƣớc quy trình Hình 4.1 cho thấy quy trình ly trích tƣơng đối ổn định Lƣợng DNA thu đƣợc nhiều Chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt, khơng bị gãy (khơng bị smear) nhƣng cịn nhiều tạp, cần phải xử lý RNase trƣớc chạy PCR Ly trích theo quy trình 2, thu đƣợc DNA tổng số có chất lƣợng tốt, khơng bị gãy (khơng bị smear), kéo sợi, cịn tạp, chƣa đƣợc xử lý với RNase Lƣợng DNA thu đƣợc mẫu khác nhau, lƣợng mẫu sử dụng khơng Đối với thực vật, quy trình ly trích Kurt Weising ctv,1995, đƣợc đánh giá phƣơng pháp giúp thu đƣợc DNA tổng số có chất lƣợng tốt Chúng nhận thấy bƣớc nghiền mẫu quan trọng Cần phải nghiền mẫu thật mịn, từ màu xanh đậm chuyển sang màu xanh nhạt Để thu đƣợc lƣợng DNA nhiều hơn, tăng thời gian ủ mẫu với dung dịch ly trích vài qua đêm tùy theo đối tƣợng mẫu Các thao tác làm nhẹ nhàng tránh làm gãy DNA 4.2 Kết PCR với cặp primer T1 Trong nghiên cứu này, quy trình nhiệt ba yếu tố quan trọng, định kết PCR Vì vậy, chúng tơi khảo sát phản ứng PCR lần lƣợt với quy trình nhiệt mục 3.3.3 4.2.1 Quy trình nhiệt 1 Sản phẩm PCR mẫu – thực PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 1(95oC/ phút, lặp lại 30 chu kỳ o o : 95 C /1 phút, 48 C /45 giây, 72oC/1 phút,72oC/7 phút, 4oC), điện di gel agarose 1%,ở 100V, 250 mA, 30 phút Kích thƣớc dự đốn 0,8 kb Sản phẩm PCR khơng đặc hiệu phần tạp Hình 4.3 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Thực PCR mẫu 1, 2, 3, với quy trình nhiệt 1, ngồi sản phẩm mong muốn có kích thƣớc dự đốn 0,8 kp, cịn có sản phẩm không đặc hiệu khác Chứng tỏ, primer bắt cặp không đặc hiệu Trong sản phẩm PCR thu đƣợc tạp thành phần dƣ phản ứng PCR Nhƣ vậy, cặp primer T1, nhiệt độ Ta = 48oC thấp, chƣa tối ƣu cho cặp primer T1 hoạt động 4.2.2 Quy trình nhiệt Khi thực PCR mẫu 1, 2, 3, theo quy trình nhiệt 2, khơng thu đƣợc sản phẩm PCR Có thể nhiệt độ Ta = 58 oC cao, dẫn đến primer bắt cặp với DNA mẫu Tiếp tục, tiến hành PCR với quy trình nhiệt 4.2.3 Quy trình nhiệt Sản phẩm PCR thu đƣợc thực PCR mẫu – với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt 1(95oC/ phút, lặp lại 30 chu kỳ : 95oC /1 phút, 54oC /45 giây, 72oC/1 phút,72 C/7 phút, C), điện Kích thƣớc dự đốn 0,8 kb di gel agarose 1%, Phần tạp o o 100V, 250 mA, 30 phút Hình 4.4 Sản phẩm PCR với cặp primer T1 theo quy trình nhiệt Với quy trình nhiệt 3, mẫu thu đƣợc sản phẩm PCR nhƣng cịn tạp Các mẫu 3, khơng thu đƣợc sản phẩm PCR Nhƣ vậy, nhiệt độ Ta= 54oC cịn cao, chƣa thích hợp cho primer T1 hoạt động LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 4.2.4 Quy trình nhiệt 4 L 10 N 0,8 kb Hình 4.5 Sản phẩm PCR với quy trình nhiệt L: ladder (1 kb) N: đối chứng âm (khơng có DNA) - - 10 sản phẩm PCR khuếch đại cặp primer T1 thực PCR mẫu – 10 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5%,ở 50V, 250mA, 60 phút Sản phẩm PCR thu đƣợc từ quy trình nhiệt mẫu – band mong muốn (0,8 kp), khơng có sản phẩm khơng mong muốn, tạp, lƣợng sản phẩm nhiều Mẫu 10 mẫu đực khơng thu đƣợc sản phẩm PCR Nhƣ vậy, thực PCR theo quy trình nhiệt cho kết tốt Khác với kết nghiên cứu Magdalita (2002), với cặp primer T1, thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 0,8 kb Trong đó, thực PCR với cặp primer T1, Magdalita thu đƣợc sản phẩm có kích thƣớc 1,3 kb Qua nghiên cứu Parasnis (2000) Deputy (2002) kết thu đƣợc thực phản ứng PCR, cho giống yếu tố quan trọng nhất, ảnh hƣởng đến kết PCR Do hạn chế thời gian, thực phản ứng PCR giống đu đủ Thái LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 4.3 Kết PCR với cặp primer W11 Nhiệt độ Tm cặp primer W11 56,9oC 50,5oC Nhiệt độ Tm cặp primer T1 58,5oC 50,5oC Do nhiệt độ Tm cặp primer W11 tƣơng đƣơng với cặp T1, tiến hành PCR với cặp primer W11 theo quy trình nhiệt L N 10 1,5 kb Hình 4.6 Sản phẩm PCR với cặp primer W11 theo quy trình nhiệt L: ladder (2 kb) N: đối chứng âm (khơng có DNA) 2, 3, 4, 10 sản phẩm PCR khuếch đại cặp primer W11 theo quy trình nhiệt (95oC/ phút, lặp lại 30 chu kỳ : 95oC /1 phút, 50oC /45 giây, 72oC/1 phút,72oC/7 phút, 4oC) có kích thƣớc khoảng1,5 kb, điện di gel agarose 1,5%, 50V, 250 mA, 60 phút Khi thực PCR mẫu 2, 3, thu đƣợc sản phẩm PCR tốt, khơng có tạp, có band mong muốn Tuy nhiên, lƣợng sản phẩm khơng nhiều (band mờ), lƣợng DNA mẫu Với mẫu 10, khơng thu đƣợc sản phẩm PCR Qua kết Hình 4.5 Hình 4.6, chúng tơi xác định đƣợc giới tính lấy mẫu Các mẫu 2, 3, lƣỡng tính Các mẫu 1, 5, 6, 8, Mẫu 10 đực Với cặp primer W11, thu đƣợc kết khác Magdalita Chúng thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb, cịn sản phẩm PCR mà Magdalita thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 0,8 kb Trên giới, nhà khoa học nhƣ Deputy, (2002), Magdalita, (2002) Liu, (2004) sử dụng cặp primer T1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 W11 để xác định giới tính đu đủ Họ nghiên cứu nhiều giống đu đủ với số lƣợng mẫu lớn, lập lại thí nghiệm – lần, kết thu đƣợc xác (94% 100%) Chứng tỏ, T1 W11 cặp primer đặc hiệu cho giới tính đu đủ Do đó, theo chúng tơi, vùng DNA liên kết với gen quy định giới tính nhiễm sắc giới tính giống đu đủ khác có vài khác biệt 4.4 Kết PCR với cặp primer T1 W11 L H F 10 N 1,5 kb 0,8 kb Bảng 4.7 Sản phẩm PCR với cặp primer theo quy trình nhiệt L: ladder (2 kb) N: đối chứng âm (không có DNA) H sản phẩm PCR thực PCR mẫu với cặp primer W11 F sản phẩm PCR thực PCR mẫu với cặp primer T1 – sản phẩm PCR thu đƣợc thực multiplex PCR mẫu -6 với cặp primer T1 W11 Khi chạy multiplex PCR với mẫu, thu đƣợc band 0,8 kp mẫu 2, 4, (Hình 4.7) Đối chiếu với kết thu đƣợc Hình 4.5 Hình 4.6, chúng tơi cho phản ứng multiplex PCR chƣa thành công thành phần phản ứng chƣa tối ƣu cho phản ứng multiplex PCR xảy Đặc biệt, tỉ lệ primer phản ứng multiplex PCR quan trọng Cần phải tiến hành khảo sát nồng độ primer để tìm tỉ lệ primer thích hợp phản ứng Để tối ƣu phản ứng, thực khảo sát thêm thành phần quan trọng khác phản ứng nhƣ MgCl , dNTP’s, Taq DNA polymerase LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phƣơng pháp ly trích Thực phản ứng PCR chromosome giới tính nên chất lƣợng DNA quan trọng Qua kết ly trích rút kết luận: quy trình ly trích mục 3.3.4 quy trình đơn giản, giúp thu đƣợc DNA có chất lƣợng tốt Qua thực nghiệm, chúng tơi nhận thấy, với mẫu DNA ly trích theo quy trình 2, khơng cần phải tinh sạch, cần pha lỗng DNA, thực thành cơng phản ứng PCR Kỹ thuật PCR Dựa vào kết chạy PCR xác định đƣợc giới tính đu đủ với mức độ xác cao Bƣớc đầu tìm đƣợc quy trình nhiệt tƣơng đối ổn định cho cặp primer T1 W11 Tuy nhiên, giới hạn thời gian, chƣa tối ƣu đƣợc thành phần phản ứng multiplex PCR với cặp primer T1 W11 Từ kết thu đƣợc, cho yếu tố quan trọng ảnh hƣởng kết PCR nghiên cứu gồm giống, chất lƣợng DNA, quy trình nhiệt 5.2 Đề nghị Vì nghiên cứu để tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu nhƣ nuôi cấy mô đu đủ, chuyển gen đu đủ, lai tạo giống, với kết đạt đƣợc, chúng tơi có vài đề nghị sau: - Tiếp tục hồn thiện phƣơng pháp xác định giới tính đu đủ kỹ thuật PCR với cặp primer T1 W11 - Tiến hành xác định giới tính giống đu đủ trồng nƣớc ta - Tiến tới giải trình tự sản phẩm PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nơng nghiệp Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền học phân tử Nhà xuất nông nghiệp Bùi Trang Việt, 2005 Sinh học tế bào Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 434 trang Dƣơng Tấn Lợi, 2002 Kỹ thuật trồng ăn (ca cao, đu đủ) 61 trang Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998 Sinh học phân tử (Khái niệm- Phương phápỨng dụng) Tái lần thứ Nhà xuất Giáo dục, TP HCM 301 trang Nguyễn Đức Lƣợng, 2002 Công nghệ gen Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Hối, Dƣơng Minh Võ Thanh Hoàng, Khoa Trồng trọt, Đại học Cần Thơ, 1996 Cây đu đủ Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 20 trang Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Uyển, 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập Nhà xuất nông nghiệp 10 Nhiều tác giả, 2002 Phương pháp nhân giống ăn Nhà xuất dân tộc Hà Nội 11 Phạm Thành Hổ, 2003 Di truyền học Nhà xuất giáo dục 613 trang 12 Trần Thế Tục - Đoàn Thế Lƣ, 2002 Cây đu đủ kỹ thuật trồng Nhà xuất lao động - xã hội Hà Nội 52 trang 13 Trần Thế Tục, 1999 Kỹ thuật trồng xoài, na, đu đủ, hồng xiêm Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 14 Brown T A., 1995 Gene cloning, an introduction Chapman & Hall 334 pages LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 15 Detuty J C., et al Molecular marker for sex determination in papaya, 2002 Theor Appl Genet 106 p 107 – 111 16 Henry R J, 1997 Practical applications of plant molecular biology Chapman & Hall 258 pages 17 Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995 DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press 322 pages 18 Magdalita P M and Mercado C P., 2002 Sex determination in papaya by PCR PCARRD, Los Banos, Laguna, Philippines 19 Magdalita P M., Drew R A., Adkins S W and Godwin I D.,1997 Morphological, molecular and cytological analyses of Carica papaya x C cauliflora interspecific hybrids Theoretical and applied Genetics 95 p 224 – 229 20 McPherson M J and Moller S G., 2000 PCR BIOS 276 pages 21 Paranis A S., Gupta V S., Tamhanhar S A., Ranjekar P K., 1999 Microsatellite (GATA)n reveal sex specific differences in papaya Theor Appl Genet 99 p 1047 – 1052 22 Paranis A S., Gupta V S., Tamhanhar S A., Ranjekar P K., 2000 A highly reliable sex diagnotic PCR assay for mass screening of papaya Molecular Breeding p 337 -344 23 Sambrook and Russell, 2001 Molecular cloning, a laboratory manual Volume Third edition CSHL Press p 8.1 - 8.24 24 Somri S., Jobin M.,Drew R A., Lawson W and Graham M W.,1998 Developing molecular marker for sex prediction in papaya Acta Horticulture p 24 – 29 25 Sondur S N., Manshardt R M and Stiles J I., 1996 A genetic linkage map of papaya based on radomly amplified polymorphic DNA markers Theor Appl Genet 99 p 547 – 553 26 Zhiyong Liu, et al, 2004 A primitive Y chromosome in papaya marks incipient sex chromosome evolution Nature 427 p 348 – 352 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 27 www.hawaiiag.owww.elsevier.com/locate/scihorti 28 www.nature.com/nature LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 29 http://www.ogtr.gov.au/pdf/ir/papaya.pdf 30 www.sciencedirect.com/sciencerg/harc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH LUẬN VĂN KỸ... 08/2006 “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH CÂY ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR VỚI CÁC CẶP PRIMER ĐƢỢC THIẾT KẾ DỰA VÀO VÙNG DNA LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH GIỚI TÍNH TRÊN NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH” Giáo... đốn giới tính? ?? Somri, Magdalita sử dụng cặp primer T1 W11 để dự đốn giới tính đu đủ Các primer T1 W11 đƣợc thiết kế dựa vào vùng DNA liên kết với gen quy định giới tính nhiễm sắc thể giới tính