PHÂN lập và ĐỊNH DANH tác NHÂN gây BỆNH đốm lá cây cải NGỌT tại TP HCM BẰNG kỹ THUẬT PCR và GIẢI TRÌNH tự VÙNG 16s 23s rDNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN VĂN KỲ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí minh -2006- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN TRẦN VĂN KỲ KS HỒNG XN QUANG Thành phố Hồ Chí Minh -2006- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATING AND IDENTIFYING AGENT CAUSED Brassica chinensis L LEAF SPOT DISEASE IN HO CHI MINH CITY USING POLYMERASE CHAIN REACTION AND SEQUENCING 16S – 23S rDNA REGION GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D, LE DINH DON TRAN VAN KY MSc, HOANG XUAN QUANG HCMC, 09/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Ban chủ nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho chúng tơi  TS Lê Đình Đơn KS Hồng Xn Quang hƣớng dẫn tận tình cho tơi suốt q trình thực tập giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp  TS Bùi Minh Trí, Trƣởng Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, anh chị sinh thành, dạy dỗ ủng hộ tinh thần nhƣ vật chất cho  Các anh chị làm việc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh hết lịng giúp đỡ, chia động viên tơi suốt thời gian làm khóa luận  Các bạn sinh viên thực tập Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi  Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 28 chia sẻ tơi vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Phân lập định danh tác nhân gây bệnh đốm cải Tp HCM phƣơng pháp PCR giải trình vùng 16S – 23S rDNA” đƣợc thực từ ngày tháng năm 2005 đến ngày 30 tháng năm 2006 trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam Đề tài sinh viên Trần Văn Kỳ thực dƣới hƣớng dẫn TS Lê Đình Đơn KS Hoàng Xuân Quang Đối tƣợng nghiên cứu vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris gây bệnh đốm cải Hiện nay, vùng trồng rau Huyện Củ Chi, Hóc Mơn quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm gây thiệt hại lớn cho nông dân trồng rau cải Triệu chứng điển hình bệnh xuất đốm nhỏ có kích thƣớc – mm rau Khi bệnh phát triển, đốm bệnh lớn dần, lên kết lại dẫn đến rau bị vàng chết Bệnh làm giảm suất nhƣ chất lƣợng rau cải Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh kỹ thuật PCR, giải trình tự gen nhằm làm sở cho nghiên cứu phòng trị bệnh sau Các nội dung nghiên cứu bao gồm: Phân lập tác nhân gây bệnh từ mẫu bệnh thu đƣợc từ vùng trồng rau huyện Củ Chi, Hóc Mơn quận 12, thành phố Hồ Chí Minh Dùng kỹ thuật PCR giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh Kết thu đƣợc nhƣ sau: Phân lập đƣợc dòng vi khuẩn gây bệnh đốm vùng trồng rau thuộc huyện Củ Chi, Hóc Mơn quận 12, Tp HCM Sử dụng kỹ thuật PCR khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu giải trình tự gen hrpF đặc trƣng vi khuẩn gây bệnh Do hạn chế phƣơng pháp giải trình tự gen không mang lại kết Tuy nhiên, kết PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas campestris pv campestris ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nghiên cứu nƣớc 2.1.1 Lịch sử phát phân bố 2.1.2 Tác nhân triệu chứng bệnh 2.1.3 Tác động kinh tế bệnh 2.1.4 Sinh lý, sinh thái điều kiện phát triển bệnh 2.1.5 Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn gây bệnh 2.1.6 Phƣơng pháp phân lập dịnh danh tác nhân gây bệnh 2.1.7 Những nghiên cứu phát dịnh danh tác nhân gây bệnh phƣơng pháp sinh học phân tử………………… .10 2.2 Tổng quan nghiên cứu nƣớc 12 2.3 Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) 13 2.3.1 Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) 13 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.2 Ribosome DNA (rDNA) 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 15 3.1 Thời gian địa điểm 15 3.1.1 Thời gian 15 3.1.2 Địa điểm 15 3.2 Vật liệu 15 3.3 Hóa chất 15 3.3.1 Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn 15 3.3.2 Các hóa chất dùng điện di 16 3.3.3 Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) 16 3.3.4 Môi trƣờng 17 3.4 Dụng cụ, thiết bị 17 3.5 Phƣơng pháp 17 3.5.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh 17 3.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh 18 3.5.3 Phƣơng pháp chủng bệnh rau cải trồng nhà lƣới 18 3.5.3.1 Phƣơng pháp trồng kí chủ 18 3.5.3.2 Chủng bệnh 19 3.5.4 Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 20 3.5.5 Phƣơng pháp PCR 20 3.5.5.1 Khuếch đại đoạn DNA vùng ITS vi khuẩn 20 3.5.5.2 Khuếch đại đọan DNA gen hrpF 22 3.5.6 Phƣơng pháp điện di đọc kết qủa 22 3.5.6.1 Điện di gel agarose 22 3.5.6.2 Đọc kết điện di 22 3.5.7 Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR 23 3.5.7.1 Chuẩn bị khuôn DNA 23 3.5.7.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 24 3.5.7.3 Tinh sản phẩm khuếch đại 25 3.5.7.4 Chạy điện di ghi nhận tín hiệu máy sequencer 25 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5.7.5 Quy trình tóm tắt bƣớc đọc trình tự 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết thu thập phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh 27 4.2 Kết chủng bệnh rau cải trồng nhà lƣới 28 4.3 Kết ly trích pha lỗng DNA vi khuẩn 31 4.4 Kết phản ứng PCR 32 4.4.1 Kết PCR khuếch đại vùng ITS 32 4.4.2 Kết điện di tinh sản phẩm PCR 32 4.4.3 Kết PCR khuếch đại vùng hrpF 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid ng : nano gram cDNA : complementary DNA nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base SDS : Sodium dodecyl sulphate PDA : Potato Dextrose agar RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction UV : Ultra violet CC : Củ Chi HM : Hóc Mơn Q12 : Quận 12 DC : Đối chứng vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1 Sự phát triển số lồi vi khuẩn Xanthomonas mơi trƣờng bán chọn lọc Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR……………………………………… 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 Xan 322…21 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCR XCF……… 21 Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự……………………… 23 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho phản ứng đọc trình tự…………… 24 Bảng 4.1 Danh mục dòng vi khuẩn sử dụng đề tài……………… 26 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngồi ruộng rau Hình 4.2 Vết bệnh cải thu thập ngồi ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi a b Hình 4.3 Ni cấy vi khuẩn mơi trƣờng thạch (a) vi khuẩn ly trích từ bệnh môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau phân lập mơi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 4.2 Kết chủng bệnh rau cải trồng nhà lƣới Cây kí chủ bệnh trồng nhà lƣới sau chủng ngày đƣợc tiến hành quan sát triệu chứng Kết cho thấy dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 Q12 – gây triệu chứng bệnh cải trồng nhà lƣới So sánh vết bệnh tạo cải thu thập ruộng cải đƣợc chủng nhà lƣới, chúng tơi nhận thấy khơng có khác biệt triệu chứng Ở nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi, ta thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập mô, gây hoại tử mô tế bào Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu đen rõ rệt Cịn khơng bị nhiễm, tế bào vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo thành vết sẹo màu trắng, khơng có triệu chứng bệnh a b c d LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 Hình 4.4 Vết bệnh sau chủng vết thƣơng khơng bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi (a) đốm bệnh sau chủng ngày; (b) vết thương kim châm tạo không bị bệnh; (c) đốm bệnh sau chủng ngày nhuộm dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo chủng không nhiễm bệnh nhuộm dung dịch Alcohollic lactophenol Đốm bệnh a b Hình 4.5 Lá cải sau chủng bệnh ngày, bên phải gân không bị nhiễm bên trái bị nhiễm (a) cải sau chủng bệnh ngày; (b) cải sau chủng bệnh ngày nhuộm dung dịch Alcohollic lactophenol 4.3 Kết ly trích pha lỗng DNA vi khuẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 Q trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trị quan trọng nghiên cứu DNA thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu hàm lƣợng độ tinh Sau tiến hành tách chiết theo quy trình mẫu vi khuẩn, thu đƣợc kết nhƣ sau: DNA thu đƣợc Phần tạp nhiễm Hình 4.6 Kết ly trích DNA từ dịng vi khuẩn (genomic DNA) 1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC Qua kết điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều tạp nhiễm Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, tiến hành pha loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA dung dịch TE Kết qủa thu đƣợc thể qua band diện di: Hình 4.7 Kết hiệu chỉnh nồng độ DNA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Thơng thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh enzyme RNAse nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm Tuy nhiên, dựa vào hình trên, chúng tơi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ khiết cao, đó, khơng cần thiết phải tinh Hơn nữa, trình tinh làm gãy DNA mức độ 4.4 Kết phản ứng PCR 4.4.1 Kết phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp primer, nhiệt độ kéo dài, cân đối thành phần phản ứng Sau hồn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen vùng ITS, tiến hành phản ứng mẫu DNA ly trích Kết thu đƣợc khả quan So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, nhận thấy sản phẩm PCR từ dòng thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 1,1kb Kích thƣớc sản phẩm hồn toàn trùng khớp với nghiên cứu Goncalves, E.R Rosato, Y.B 1,1kb Hình 4.8 Kết khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA 1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC Sản phẩm PCR đƣợc tinh đọc trình tự Trình tự DNA có đƣợc so sánh với liệu ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 4.4.2 Kết tinh sản phẩm PCR Chọn hai mẫu CC1 HM2 để tiến hành tinh theo quy trình GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham Company) Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết tinh sản phẩm PCR 4.4.3 Kết PCR vùng hrpF Theo Young Jin Park ctv (2004), primer XCR XCF thiết kế dựa trình tự gen hrpF có tính chun biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris có kích thƣớc 535 bp Chúng tơi thực phản ứng PCR dùng cặp mồi dòng vi khuẩn CC1, CC2, HM1, HM2 Q12 – Kết thu đƣợc nhƣ sau: - Các dòng CC1, CC2, HM2 Q12 – tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hồn tồn phù hợp với báo cáo Young Jin Park ctv (2004) Do đó, kết luận dịng vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris - Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv citri không tạo sản phẩm khuếch đại - Riêng dịng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc kb Tuy kết dƣơng tính nhƣng chƣa thể có kết luận định danh dịng vi khuẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 kb 535 bp Hình 4.10 Kết khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF 1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết thúc đề tài, thiết lập đƣợc quy trình phân lập định danh vi khuẩn gây bệnh đốm cải Tp HCM Quy trình đƣợc thực nhƣ sau: Thu thập mẫu bệnh vùng trồng rau trọng điểm Tp HCM: Tiến hành khảo sát ruộng rau, thu thập mẫu xuất đốm nhỏ màu nâu đen, rửa đất cát, ủ ẩm bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc phân lập Phân lập vi khuẩn từ đốm bệnh lá: Rửa nƣớc vòi, mẫu bệnh chọn đốm bệnh màu xanh giọt dầu để phân lập Khử trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng – 10 phút Hút dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ 28oC 24 – 48 Chọn khuẩn lạc trịn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích Chủng bệnh cải bệnh trồng nhà lƣới phƣơng pháp tạo vết thƣơng cách xâm kim nhiễm vi khuẩn vết thƣơng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Ly trích DNA từ vi khuẩn phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi khuẩn tăng sinh môi trƣờng LB lỏng Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử dụng cặp primer Xan1330 Xan322 làm vật liệu giải trình tự Thực phản ứng với thành phần nêu Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2 Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF XCR khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF Thành phần phản ứng chu trình nhiệt nhƣ trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.3 Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng định vi khuẩn gây bệnh thuộc lồi Xanthomonas campestris pv campestris Chúng tơi xác định đƣợc dòng CC1, CC2, HM1 Q12–1 gây bệnh đốm cải Tp HCM vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris 5.2 Đề nghị Tiến hành khảo sát, nghiên cứu quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn rau họ thập tự Cụ thể mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long, Lâm Đồng, Long An tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu phổ kí chủ rộng (cây họ thập tự) Hồn thành đề tài mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA vi khuẩn gây bệnh, đối chiếu với liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có sở Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng vi khuẩn gây bệnh kỹ thuật RFLP LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2000 Di truyền phân tử Nhà xuất nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Trang 195 – 231 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Trang 197 – 206 Lê Lƣơng Tề Vũ Triệu Mân, 1999 Bệnh vi khuẩn virút hại trồng NXB Giáo Dục Hà Nội Trang 99 – 100 Mai Thị Vinh Phạm Văn Biên, 1985 Bệnh hại rau cải số vùng rau ngoại thành Tp Hồ Chí Minh Thơng báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam Nguyễn Văn Thắng Trần Khắc Thi, 1996 Sổ tay người trồng rau Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang Trần Thanh Tùng, 1997 Những bệnh hại quan trọng số loại rau trồng phổ biến Tp Hồ Chí Minh biện pháp phịng trừ Thơng báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Bradbury, J.F., 1986 Guide to plant pathogenic bacteria Wallingford, UK: CAB International Gaetan, S., and Lopez, N., 2005 First outbreak of bacterial leaf spot caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina Plant Disease 89: 683 – 684 Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002 Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences Inetrnational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52: 355 – 361 10 John P Curran, 2002 Automated DNA sequencing (ABI PRISM 3100) Training Manuals/Protocols 11 Klement, Z., 1982 Hypersensitivity Phytopathogenic Prokaryotes Pages 149 – 177 12 M S Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C., Madden, L.V., and Hoitink, H.A., 2003 Isolation and characterization of rhizobacteria from composts that suppress the severity of bacterial leaf spot of radish Phytopathology 93: 1292 – 1300 13 Massomo, S.M.S., Hanne Nielsen, Mabagala, R.B., Keld Mansfield – Giese, John Hockenhull, and Mortensen, C.N., 2003 Identification and characterisation of Xanthomonas campestris pv campestris strains from Tanzania by pathogenicity tests, Biolog, rep – PCR and fatty acid methyl ester analysis European Journal of Plant Pathology 109: 775 – 789 14 Moffett, M.L., Trimboli, D., and Bonner, L.A., 1976 A bacterial leaf spot disease of several Brasssica varieties, Aust Plant Pathology Soc 5: 30 – 32 15 Pernezny, K., and Dickstein, E., 2003 An outbreak of bacterial leaf spot disease of cabbage in Southrn Florida caused by Xanthomonas campestris pv armoraciae Plant Disease 87: 872 – 873 16 Ruissen, M.A., and Gielink, A.J.,1993 The development of black rot in cabbage as a result of difference in guttation between cultivars Proceedings LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 of the Eight International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, 9-12 June 1993, Versailles, France Pages 178 – 185 17 Shaad, N.W., 1994 Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, second edition APS PRESS, The American Phytopathological Society 165 pages 18 Steven T Koike, Azad, H.R., and Cooksey, D.A., 2001 Xanthomonas leaf spot of cantip: a new disease caused by pathovar Xanthomonas campestris Plant Disease 85: 1157 – 1159 19 Van den Ackerveken, G.F., Marois, E., and Bonas, U 1996 Recognition of the bacteria avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell Cell 87: 1307 – 1316 20 Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 1993 Conservation of secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal bacteria Trends Microbiol 1: 175 – 180 21 Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998 Entry of Xanthomoas campestris pv campestris into hydathodes of Arabidopis thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis Molecular Plant – Microbe Interaction 11: 537 – 543 22 Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006 Identification of isolates that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv raphani and pathogenic and genetic coparison with related pathovars Phytopathology 96: 735 – 745 23 Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000 Bacterial leaf spot of leaf crucifery in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas campestris Plant disease 84: 1008 – 1014 24 Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000 Bacterial leaf spot of leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv maculicola Plant Disease 84: 1015 – 1020 25 Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong Suk Park, 2004 Sensitive and specific detection of Xanthomonas LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 campestris pv campestris by PCR using species specific primer based on HrpF gene sequence Microbiological Resarch 159: 419 – 423 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Cách thức pha số hóa chất cần thiết Pha Phenol - Hịa tan 100 g phenol (tinh thể) đặt bồn ủ nhiệt 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol hịa tan) - Sau phenol tan hồn tồn, thêm vào 100 ml dung dịch bazơ 0.5M, pH8 - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên cách cẩn thận Lƣu ý thao tác nên thực tủ hood phải giữ phenol tối để tránh oxy hóa nguy hiểm đến sức khỏe - Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch tris HCl 0.5M, pH8 - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên - Lập lại chu kỳ lần Sau phủ lên dung dịch phenol thu đƣợc lớp TE 1X (50 ml) - Bảo quản phenol tối (dùng bình đựng có màu tối bịt kín bình giấy bạc) Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, mM EDTA, pH8 Trƣớc hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8 Cho dung dịch Tris HCl EDTA vào nƣớc tinh Khuấy chuẩn độ pH đến Thành phần môi trƣờng Chuẩn bị môi trƣờng PDA (potato dextrose agar): Nguyên liệu Liều lƣợng - Khoai tây gọt vỏ 500 g - Dextrose 10 g - Agar 15 g - Nƣớc cất lít LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khoai tây cắt thành miếng, cho vào lít nƣớc đun sơi 40 phút Lọc, thêm nƣớc cho đủ lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan máy khấy từ, dịch môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng nồi hấp 121oC 30 phút Sau hấp, để nguội đến 50o C đổ vào đĩa petri - Môi trƣờng YGC: Glucose 5g Yeast extract agar 5g Calcium carbonate 40 g Agar 15g Nƣớc lít - Mơi trƣờng LB: NaCl 10g Yeast extract 5g Peptone 10g Nƣớc lít Hịa tan lần lƣợt chất nƣớc máy khuấy từ Hấp 121 oC 20 phút Pha dung dịch Alcohollic lactophenol Hóa chất Tỉ lệ thể tích Lactic acid Phenol Glycerol Nƣớc Ethanol LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S. .. luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: ? ?Phân lập định danh tác nhân gây bệnh đốm cải Tp HCM phƣơng pháp PCR giải trình vùng 16S – 23S rDNA? ?? đƣợc thực từ ngày tháng năm 2005 đến ngày 30... nhằm định danh tác nhân gây bệnh Kết thu đƣợc nhƣ sau: Phân lập đƣợc dòng vi khuẩn gây bệnh đốm vùng trồng rau thuộc huyện Củ Chi, Hóc Mơn quận 12, Tp HCM Sử dụng kỹ thuật PCR khuyếch đại vùng 16S