THỬ NGHIỆM một số hợp CHẤT CHIẾT XUẤT từ THẢO dược TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH đốm TRẮNG DO VIRUS gây hội CHỨNG đốm TRẮNG (WSSV) TRÊN tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp, tơi gặp khó khăn định nhờ hướng dẫn giúp đỡ người khóa luận hồn thành Tơi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt trình học tập trường  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên hết lịng hướng dẫn giúp đỡ tơi trình thực tập tốt nghiệp  Các anh chị Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản anh chị Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Ban Giám đốc anh chị công ty Nam Khoa  Các bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học 27 chia sẻ vui buồn q trình học tập giúp đỡ tơi thời gian thực tập iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)” Thời gian thực từ tháng 03/2005 – 08/2005 Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (RIA 2) Đề tài thực đối tượng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh tôm sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm bố trí cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với hợp chất chiết xuất từ thảo dược nồng độ khác nhau, sau kiểm tra tác dụng hợp chất virus WSSV Sau sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu tác dụng hợp chất lên virus WSSV cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất vào thể tôm thí nghiệm Đánh giá tác dụng hợp chất dựa vào kết Reatime PCR tỷ lệ sống tơm thí nghiệm Kết đạt sau thí nghiệm với hợp chất ký hiệu D2, B, M: Ở nồng độ thử nghiệm 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để tác dụng lên lớp vỏ protein virus khơng có hiệu tác dụng virus Hợp chất B D2 có tác dụng lên virus WSSV nồng độ 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml) iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt vi Mục lục v Danh sách hình viii Danh sách bảng sơ đồ ix PHẤN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tình hình dịch bệnh tơm giới 2.2 Tình hình nuôi dịch bệnh tôm Việt Nam .4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch tôm sú 2.4 Khái quát bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng tôm sú 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 2.4.2 Khu vực phân bố 2.4.3 Ký chủ 2.4.4 Điều kiện phát sinh đường lây truyền 2.4.5 Cơ chế xâm nhập 2.4.6 Bệnh lý 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10 2.5.2 Sơ lược phương pháp PCR Realtime PCR 10 2.6 Một số dạng hợp chất thực vật 11 2.6.1 Alkaloid 11 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.6.2 Flavonoid 12 2.7 Một số cơng trình nghiên cứu sử dụng thực vật phòng trị bệnh cho đối tượng thuỷ sản 12 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Vật liệu sinh học 15 3.2.2 Dụng cụ hoá chất 15 3.2.2.1 Dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm 15 3.2.2.2 Dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm ướt 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp ly trích thu dịch chiết virus 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus tôm 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.4 Phương pháp PCR 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17 3.3.5 Phương pháp xác định số yếu tố mơi trường 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 3.4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 18 3.4.2 Thử nghiệm hợp chất sàng lọc tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus hợp chất vào tôm 19 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 20 4.1.1 Kết sàng lọc hợp chất D2 20 4.1.2 Kết sàng lọc hợp chất B 21 4.1.3 Kết sàng lọc hợp chất M 23 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2 Kết thử nghiệm sau tiêm tôm hỗn hợp virus WSSV hợp chất D2, B nồng độ khác 23 4.2.1 Kết thử nghiệm hợp chất D2 27 4.2.2 Kết thử nghiệm hợp chất B 29 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất D2 thời gian 20 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất B thời gian 21 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất M thời gian 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 trước thí nghiệm 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 sau thí nghiệm 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B trước thí nghiệm 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B sau thí nghiệm 30 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG .TRANG Bảng 2.1 Tên số quốc gia năm xuất bệnh đốm trắng Bảng 2.2 Đánh giá khả phát bệnh đốm trắng phương pháp khác 10 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường q trình thí nghiệm 24 Bảng 4.2 Kết ghi nhận tỷ lệ tôm chết lơ q trình thí nghiệm 25 Bảng 4.3 Kết Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng hàm lượng DNA mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất trước thí nghiệm sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ .TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả tác dụng virus WSSV thể sống tôm sau ủ hỗn hợp virus thuốc thử nồng độ khác 19 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt sản phẩm thủy sản ngày tăng cao Vì thế, sản lượng thủy sản đáp ứng nhu cầu thị trường, nguồn lợi thủy sản ngày giảm khai thác q mức Trước tình hình việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt bùng phát nghề nuôi tôm biển thực tế khách quan nhu cầu cần thiết Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta phát triển mạnh vài thập kỷ gần đây, đặc biệt nghề nuôi tôm tỉnh ven biển Nghề nuôi tơm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn kỹ thuật ni cịn hạn chế Điều dẫn đến suy thối mơi trường ni bùng phát lây lan dịch bệnh Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm Một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Thiệt hại lên đến 100 % quần đàn từ - ngày kể từ phát tôm bệnh Có nhiều phương pháp phịng trị bệnh đốm trắng dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… tồn nhiều mặt hạn chế mức độ thành công chưa cao Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật phong phú Thảo dược từ xưa ứng dụng phịng trị bệnh có hiệu y học thú y Tuy nhiên lĩnh vực thuỷ sản chưa ứng dụng rộng rãi Thử nghiệm số hợp chất thảo dược phòng trị bệnh đối tượng nuôi thuỷ sản hướng nghiên cứu cần khai thác Được đồng ý Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thầy cô hướng dẫn, thực khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm số hợp chất chiết xuất từ thảo dược phòng trị bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon)” LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 19 3.4.2 Các nghiên cứu phòng thí nghiệm ướt Mục đích bố trí thí nghiệm để biết khả tác dụng virus WSSV thể sống tôm sau ủ hỗn hợp virus thuốc thử nồng độ khác Tơm sú khoẻ kích cỡ – 12 g/con Lô đối chứng âm không tiêm virus WSSV Lô đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV Các lơ thí nghiệm tiêm hỗn hợp dịch chiết virus thuốc thử nồng độ khác sau ủ Theo dõi ghi nhận hàng ngày tình trạng sức khoẻ tôm Tiến hành thu mẫu chết (nếu có) Sau 14 ngày Thu tồn mẫu kiểm tra lại kỹ thuật Realtime PCR đánh giá kết Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả tác dụng virus WSSV thể sống tôm sau ủ hỗn hợp virus thuốc thử nồng độ khác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 20 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng Hiệu trực tiếp hợp chất B, M, D2 virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) thử nghiệm cách cho 250 µl dịch chiết WSSV 250 µl với hợp chất B, M, D2 nồng độ khác vào eppendorf (1 ml) ủ hỗn hợp nhiệt độ (28 - 30oC), sau kiểm tra tồn virus hỗn hợp kỹ thuật PCR định tính khơng dùng NaOH - SDS q trình tách chiết DNA virus Việc khơng sử dụng NaOH - SDS trình tách chiết DNA virus nhằm hạn chế hoá chất tác dụng lên virus, làm phơi trần DNA virus, không đánh giá tác dụng hợp chất lên virus WSSV Sản phẩm PCR sau đem điện di chụp hình kết 4.1.1 Kết sàng lọc hợp chất D2 M Hình 4.1: Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất D2 thời gian 28 - 30 oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 (10 mg/ml DMSO) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 21 Giếng 5: Mẫu đối chứng dương Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm Giếng 7: Mẫu đối chứng âm Giếng M: Thang DNA chuẩn Kết điện di cho thấy: Trên gel sau điện di ghi nhận có xuất vạch sáng giếng 1, 2, 3, Điều có nghĩa hợp chất D2 nồng độ 2,5 mg/ml, mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml DMSO có tác động lên lớp vỏ virus làm phá vỡ cấu trúc vỏ protein virus để phơi trần DNA virus Trong trường hợp hợp chất D2 làm thay vai trò NaOH – SDS việc ly trích DNA Nếu so mức độ sáng tối chụp hợp chất D2 nồng độ với dịch virus thử nghiệm ta thấy yếu Điều cho thấy hiệu tác dụng hợp chất D2 lên virus WSSV tốt chưa cao 4.1.2 Kết sàng lọc hợp chất B M Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất B thời gian 28 - 30 oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất B (10 mg/ml DMSO) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 22 Giếng 5: Mẫu đối chứng dương Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm Giếng 7: Mẫu đối chứng âm Giếng M: Thang DNA chuẩn Kết điện di cho thấy gel sau điện di xuất vạch sáng giếng 1, 2, 3, tương tự trường hợp hợp chất D2 Nếu so sánh mức độ sáng tối vạch sáng giếng 1, 2, 3, yếu so với vạch sáng giếng đối chứng dương dịch virus thử nghiệm Tuy nhiên so với hợp chất D2 hợp chất B nồng độ tương tự có độ sáng mạnh Điều cho thấy hiệu tác dụng hợp chất B lên virus WSSV cao so với hợp chất D2 Mặt khác, độ sáng tăng dần từ nồng độ 2,5 mg/ml đến 7,5 mg/ml, độ sáng nồng độ 7,5 mg/ml 10 mg/ ml gần Điều cho thấy hợp chất B nồng độ có vai trị định phá vỡ lớp vỏ protein virus Nồng độ cao phạm vi định hiệu tác dụng mạnh 4.1.3 Kết sàng lọc hợp chất M M Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất M thời gian 28 – 300C Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất M (2,5 mg/ml) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất M (5 mg/ml) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất M (7,5 mg/ml) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 23 Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất M (10 mg/ml) Giếng 5: Mẫu đối chứng dương Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm Giếng 7: Mẫu đối chứng âm Giếng M: Thang DNA chuẩn Kết điện di (Hình 4.3) cho thấy nồng độ (2,5 mg/ml; 5,0 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10,0 mg/ml) hợp chất M khơng có xuất vạch sáng nào, nồng độ hợp chất M chưa đủ liều lượng để tác dụng lên lớp vỏ protein virus WSSV hợp chất M khơng có hiệu tác dụng virus WSSV Những kết đánh giá bằmg mắt thường thí nghiệm In vitro, để biết hàm lượng DNA mẫu thử trước sau sử dụng hợp chất có sai khác ý nghĩa hay khơng, hỗn hợp (D2 B) thực với phản ứng Realtime PCR Đồng thời để xác định khả bất hoạt thật hợp chất lên virus WSSV, cần phải cảm nhiễm hỗn hợp vào thể tôm Dựa vào kết sàng lọc hợp chất trên, tiến hành thử nghiệm hợp chất D2 B 4.2 Kết thử nghiệm sau tiêm tôm hỗn hợp virus WSSV thuốc D2, B nồng độ khác Sau trộn chung dịch virus WSSV với hợp chất B D2 nồng độ khác ủ nhiệt độ 28 - 30oC, ta tiến hành cảm nhiễm trực tiếp tôm nuôi để đánh giá khả hoạt động virus WSSV thể tơm Tơm sú thí nghiệm có khối lượng trung bình - 12 gam/con Tơm thu tình trạng khoẻ bệnh Trước bố trí thí nghiệm, tơm ni thời gian ngày để tơm thích nghi với mơi trường tôm kiểm tra mầm bệnh virus (WSSV, Taura Syndrome virus, MBV, YHCV) nhóm Vibrio (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, V alginolyticus) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường q trình thí nghiệm Nhiệt độ mơi trường nước 27 - 28oC pH trung bình 7,78 – 7,87 Độ mặn (‰) 15 COD (mg/l) 11,32 OD (mg/l) 4,1 Sau ni ngày bắt đầu cảm nhiễm cho tôm cách tiêm 0,1 ml hỗn hợp dịch virus hợp chất D2, B pha theo nồng độ khác dung môi DMSO (ủ 28 - 30oC) vào đốt bụng thứ tôm Các hỗn hợp kiểm tra phương pháp Realtime PCR trước cảm nhiễm tơm Thí nghiệm bố trí sau: Lô 1: Đối chứng âm tiêm dung dịch TN 1X Lô 2: Đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV Lô 3, Lô 4, Lô 5, Lô 6: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV hợp chất D2 nồng độ (2,5 mg/ml; mg/ml; 7,5 mg/ml 10,0 mg/ml) Lô 7, Lô 8, Lô 9, Lô 10: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV hợp chất B nồng độ (2,5 mg/ml; mg/ml; 7,5 mg/ml 10,0 mg/ml) Sau tiêm, hầu hết lơ thí nghiệm có tơm chết Số tôm chết bị sốc sau tiêm Trong ngày đầu, tơm có tượng bỏ ăn ăn Nhưng sang ngày tơm lơ thí nghiệm có dấu hiệu bắt mồi tốt Từ ngày thứ trở đi, tôm lô đối chứng âm, lô tiêm hỗn hợp dịch virus hợp chất khoẻ mạnh, khả hoạt động linh hoạt Tuy nhiên, đến ngày thứ 7, lô đối chứng dương cho tiêm dịch virus, số bắt đầu có dấu hiệu bỏ ăn Sang ngày thứ 9, lô đối chứng dương có chết, quan sát thấy chết thân bị đỏ, vỏ mềm có xuất đốm trắng đầu ngực Ở lô khác tôm hoạt động tốt khơng có tượng bị chết Tỷ lệ tơm chết q trình thí nghiệm trình bày Bảng 4.2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 Bảng 4.2 Kết ghi nhận tỷ lệ tơm chết lơ q trình thí nghiệm Lơ thí nghiệm Ngày theo dõi Tỷ lệ tơm chết lơ q trình thí nghiệm (%) Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô 10 20 22 11 30 22 0 25 10 20 22 18 11 30 22 25 10 20 22 18 11 30 22 25 20 30 22 18 22 30 22 25 20 30 22 18 22 30 22 25 20 30 22 18 22 30 22 25 20 30 22 18 22 30 22 25 20 30 33 18 22 30 22 25 20 30 33 18 22 30 22 25 20 10 30 55 18 22 30 22 25 20 11 30 55 18 22 30 22 25 20 12 30 78 18 22 30 22 25 20 13 30 78 18 22 30 22 25 20 14 30 78 18 22 30 22 25 20 Sau 14 ngày thu toàn mẫu tôm để xét nghiệm Realtime PCR Các kết Realtime PCR thu sau: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 Bảng 4.3: Kết Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng hàm lượng DNA mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất thí nghiệm trước thí nghiệm sau thí nghiệm Hàm lượng DNA/2µl Tỷ lệ tơm chết (%) Sau cảm nhiễm Sau thí nghiệm Tỷ lệ nhiễm (%) sau thí nghiệm 10,7.10 o 18 33 231.102 95,7.10 o 11 22 43 38,18 279.102 101.10o 30 30 40 24,24 38,62 503.102 67.10 o 22 22 28 B (2,5 mg/ml) 24,96 39,65 327.102 37,2.10 o 30 B (5 mg/ml) 28,10 38,56 50,4.10 47.10 o 0 27 B (7,5 mg/ml) 27,72 38,48 63,5.10 58.10 o 25 25 40 B (10 mg/ml) 26,38 38,55 141.102 61,6.10 o 10 20 40 24,02 25,32 630.102 245.102 22 78 100 Không Không phát phát 0 20 30 Chỉ tiêu so sánh Chu kỳ ngưỡng (Ct) mẫu Trước thí Sau thí Trước thí Sau thí nghiệm nghiệm nghiệm nghiệm D2 (2,5mg/ml) 26,13 40,27 163.102 D2 (5 mg/ml) 25,55 38,33 D2 (7,5 mg/ml) 25,23 D2 (10 mg/ml) Liều lượng hợp chất Đối chứng dương Đối chứng âm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 4.2.1 Kết thử nghiệm hợp chất D2 Kết thu bảng 4.3 cho thấy: - Ở nồng độ D2 (2,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 26,13 trước thí nghiệm 40,27 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 163.102 10,7.100 Tỷ lệ tôm chết % sau cảm nhiễm 18 % sau 14 ngày - Ở nồng độ D2 (5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 25,55 trước thí nghiệm 38,33 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 231.102 95,7.100 Tỷ lệ tôm chết 11 % sau cảm nhiễm 22 % sau 14 ngày - Ở nồng độ D2 (7,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 25,23 trước thí nghiệm 38,18 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 279.102 101.100 Tỷ lệ tôm chết 20 % sau cảm nhiễm 20 % sau 14 ngày - Ở nồng độ D2 (10 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 24,24 trước thí nghiệm 38,62 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 503.102 67.100 Tỷ lệ tôm chết 22 % sau cảm nhiễm 22 % sau 14 ngày Theo Jim McMenamin (2004), mức khác biệt hàm lượng DNA có ý nghĩa trước sau thí nghiệm 102 Ở nồng độ 2,5 mg/ml hàm lượng DNA trước sau thí nghiệm có khác biệt > 102, mặt khác tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày so với sau cảm nhiễm khơng có khác biệt lớn, chứng tỏ nồng độ 2,5 mg/ml, hợp chất D2 có hiệu tác dụng lên virus WSSV Ở nồng độ mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml, mức khác biệt hàm lượng DNA lớn 102, Tỷ lệ tôm chết sau cảm nhiễm sau 14 ngày khơng có khác biệt lớn khơng thay đổi Như hợp chất D2 nồng độ mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml có tác dụng hiệu lên virus WSSV So sánh với lô đối chứng dương cho thấy hàm lượng DNA lô đối chứng dương sau thí nghiệm so với trước thí nghiệm khơng có khác biệt ý nghĩa (245.102 sau thí nghiệm 630.102 trước thí nghiệm), tỷ lệ tơm chết sau 14 ngày 78 % khác biệt lớn so với tỷ lệ chết 22 % sau cảm nhiễm, mẫu tôm chết mẫu tôm thu sau 14 ngày lô đối chứng âm diện virus WSSV chứng tỏ virus hoạt động bình thường không sử dụng hợp chất D2 Như hợp chất D2 nồng độ 2,5 mg/ml, mg/ml, 7,5 mg/ml 10 mg/ml trộn chung với dịch virus WSSV cảm nhiễm tơm thí nghiệm ghi nhận có khả ức chế hoạt động WSSV thể tôm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Ghi chú: D2 (2,5 mg/ml) D2 (5 mg/ml) D2 (7,5 mg/ml) D2 (10 mg/ml) Hình 4.4: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 trước thí nghiệm Hình 4.5: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus hợp chất D2 sau thí nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 4.2.2 Kết thử nghiệm hợp chất B Kết thu bảng 4.3 cho thấy: - Ở nồng độ B (2,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 24,96 trước thí nghiệm 39,65 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 327.102 37,2.10 Tỷ lệ tôm chết % sau cảm nhiễm % sau 14 ngày - Ở nồng độ B (5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 28,1 trước thí nghiệm 38,56 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 50,4.102 47.100 Tỷ lệ tôm chết % sau cảm nhiễm % sau 14 ngày - Ở nồng độ B (7,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 27,72 trước thí nghiệm 38,48 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 63,5.102 58.100 Tỷ lệ tôm chết 25 % sau cảm nhiễm 25 % sau 14 ngày - Ở nồng độ B (10 mg/ml) chu kỳ ngưỡng 26,38 trước thí nghiệm 38,55 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA 141.102 61,6.100 Tỷ lệ tôm chết 10 % sau cảm nhiễm 20 % sau 14 ngày Theo Jim McMenamin (2004), mức khác biệt hàm lượng DNA có ý nghĩa trước sau thí nghiệm 102 Ở nồng độ 2,5 mg/ml hàm lượng DNA trước sau thí nghiệm có khác biệt > 102, mặt khác tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày so với sau cảm nhiễm khơng có khác biệt lớn chứng tỏ nồng độ 2,5 mg/ml, hợp chất B có hiệu tác dụng lên virus WSSV Ở nồng độ mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml, mức khác biệt hàm lượng DNA lớn 102, Tỷ lệ tôm chết sau cảm nhiễm sau 14 ngày khơng có khác biệt lớn khơng thay đổi Như hợp chất B nồng độ mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml có tác dụng hiệu lên virus WSSV So sánh với lô đối chứng dương cho thấy hàm lượng DNA lô đối chứng dương sau thí nghiệm so với trước thí nghiệm khơng có khác biệt ý nghĩa (245.102 sau thí nghiệm 630.102 trước thí nghiệm), tỷ lệ tơm chết sau 14 ngày 78 % khác biệt lớn so với tỷ lệ chết 22 % sau cảm nhiễm, chứng tỏ virus hoạt động bình thường khơng sử dụng hợp chất B Như hợp chất B nồng độ 2,5 mg/ml, mg/ml, 7,5 mg/ml 10 mg/ml trộn chung với dịch virus WSSV cảm nhiễm tơm thí nghiệm ghi nhận có khả ức chế hoạt động virus thể tôm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 Ghi chú: B (2,5 mg/ml) B (5 mg/ml) B (7,5 mg/ml) B (10 mg/ml) Hình 4.6: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus hợp chất B trước thí nghiệm Hình 4.7: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus hợp chất B sau cảm nhiễm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Hợp chất D2 hợp chất B nồng độ 2,5 mg/ml, mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml DMSO có tác dụng hiệu lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) - Dịch thử nghiệm hợp chất D2 cảm nhiễm tôm cho tỷ lệ tôm sống là: 82 % với D2 (2,5 mg/ml), 78 % với D2 (5 mg/ml), 70 % với D2 (7,5 mg/ml), 78 % với D2 (10 mg/ml) - Dịch thử nghiệm hợp chất B cảm nhiễm tôm cho tỷ lệ tôm sống là: 91 % với B (2,5 mg/ml), 100 % với B (5 mg/ml), 75 % với B (7,5 mg/ml), 80 % với B (10 mg/ml) 5.2 Kiến nghị - Bố trí thử nghiệm phịng trị bệnh WSSV tơm sú với hợp chất D2 B - Xác định liều gây chết 50 % (LD50) hợp chất D2 B - Xác định thời gian tồn lưu hợp chất D2 B sau phòng trị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Bay, 1997 Hoạt tính sinh học hợp chất thiên nhiên, Bài giảng y học cổ truyền, trang 58 – 69 Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hảo, 2005 Một số vấn đề kỹ thụât nuôi tôm sú công nghiệp Nhà xuất Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Đỗ Thị Hịa, 1996 Nghiên cứu số bệnh chủ yếu tôm sú (Penaeus monodon) nuôi khu vực nam trung Luận án tiến sĩ Trường Đại học Thủy sản Nha Trang Bùi Thị Liên Hà, 2002 Ứng dụng thử nghiệm quy trình Non – stop single type semi – nested PCR chẩn đốn bệnh đốm trắng (WSD) tơm sú ni (Penaeus monodon) Đề tài tốt nghiệp Cử nhân Sinh học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Lý Thị Thanh Loan, 2003 Nghiên cứu xây dựng quy trình kiểm tra nhanh chất lượng tơm sú giống tỉnh Cà Mau Đề tài khoa học Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, Bộ Thủy sản Bùi Quang Tề, 2003 Bệnh tôm nuôi biện pháp phịng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Việt Thắng, 1996 Xác định nguyên nhân gây bệnh cho tơm Đồng Bằng Sơng Cửu Long biện pháp tổng hợp để phòng trừ bệnh Báo cáo đề tài khoa học, Bộ Thủy sản: trang 160 – 162 Nguyễn Thái Thuỷ, 2003 Giáo trình kỹ thuật cơng nghệ sinh học, PCR Realtime PCR Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hoàng Phượng Uyên, 2005 Nghiên cứu ứng dụng vài hợp chất thiên nhiên từ thảo dược phòng trị bệnh vi khuẩn virus tôm sú (Penaeus monodon) Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh 10 Chalor Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005 Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tơm sú Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 11 Võ Hồng Phượng, 2004 Thử nghiệm hiệu phòng bệnh đốm trắng tôm sú (Penaeus monodon) virus WSSV gây vài hợp chất chiết xuất từ thảo mộc Khoá luận tốt nghiệp kỹ sư Thuỷ sản, Đại Học Thuỷ Sản, Nha Trang 12 Phạm Văn Trang, Nguyễn Trung Thành Nguyễn Diệu Phương (2005) Kỹ thuật ni số lồi tơm phổ biến Việt Nam Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội 13 Cục bảo vệ nguồn lợi thuỷ sản, 2000 Thực hành chuẩn đốn bệnh tơm cá Nhà xuất Hà Nội 14 Trích báo cáo hội thảo bệnh tơm sú Hải Phòng ngày 28 – 29/2/2004 Tổng quan bệnh virus đốm trắng tơm he (Penaeus) Tạp chí thơng tin khoa học công nghệ kinh tế thuỷ sản 4/2004: trang 18 – 22 15 V.A – Infofish International No 6/2004 Công nghệ PCR - Một công cụ quan trọng ngăn chặn bệnh tơm.Tạp chí thơng tin khoa học công nghệ kinh tế thuỷ sản 02/2005: trang 14 – 16 16 Bộ Thủy sản, 1998 Các cơng trình nghiên cứu khoa học công nghệ thủy sản 1991 – 1995 Vụ Khoa học cơng nghệ - Tạp chí thủy sản, Hà Nội Trang 154 – 165 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn:... lọc số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) - Thử nghiệm tác dụng hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) điều kiện thí nghiệm. .. lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng Hiệu trực tiếp hợp chất B, M, D2 virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) thử nghiệm cách cho 250 µl dịch chiết WSSV 250 µl với hợp