NẤM mốc và độc tố AFLATOXIN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA VÀ THỰC PHẨM NẤM MỐC ĐỘC TỐ AFLATOXIN GVHD: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG HVCH: HUỲNH NGUYỄN QUẾ ANH -20091 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Mở đầu 1.1 Đặc điểm sinh học nấm mốc 1.2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo nấm mốc 1.2.1 Hình dạng kích thước 1.2.2 Cấu tạo 1.3 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc 1.4 Sinh sản nấm mốc 1.4.1 Sinh sản vơ tính 1.4.2 Sinh sản hữu tính 1.5 Vị trí vai trị nấm mốc Độc tố 2.1 Loại độc tố điển hình chủng nấm mốc 2.2 Cơ chế tác dụng độc tố thể người súc vật 2.2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu nhóm bệnh 2.2.2 Trên người Cơ chế sinh tổng hợp độc tố 11 3.1 Norsolorinic acid-averatin 12 3.2 Versicolorin A – sterigmatocystin 13 3.3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin: 13 Phương pháp xác định độc tố 14 4.1 Phương pháp truyền thống 14 4.1.1 Dùng Kit để xác định Aflatoxin thực phẩm 14 4.1.2 Dùng VERATOX 14 4.1.3 Dùng Reveal 17 4.1.4 Dùng thử nghiệm sinh hóa phát độc tố Aflatoxin 19 4.2 Phương pháp đại 22 4.2.1 Phương pháp đo mật độ huỳnh quang 22 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 28 5.2.2.5 Phương pháp tiến hành 31 Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin 34 Tài liệu tham khảo 35 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Mở đầu Độc tố nấm mốc gây ngộ độc cấp tính, gây hại thể từ từ làm người ta khơng để ý Nhưng phát triệu chứng quan phận hư hại nghiêm trọng khó lịng chữa trị Tùy theo lọai nấm mốc độc tố chúng mà tác động loại có khác Nếu tổng hợp chung lại độc tố nấm mốc tác động hầu hết quan phận thể như: Tác động vào gan thận gây viêm, kéo dài gây ung thư (Aflatoxin, Ochratoxm… ); Tác động vào hệ tuần hoàn gây xuất huyết mãn tính, ngưng kết hồng cầu, giảm lượng kháng thể (Aflatoxin ); Tác động hệ thần khinh gây mê tính ngon miệng(Deoxynivalenol, DON); Tác động lên hệ hô hấp gây viêm nám phổi(Aspergillus fumigatus); Tác động vào hệ tiêu hóa gây viêm lở lóet miệng, da dầy … Khác với bệnh nhiễm trùng kháng sinh không điều trị nhiễm độc tố nấm mốc Cách tốt ngăn ngừa không cho độc tố nhiễm vào thức ăn 1.1 Đặc điểm sinh học nấm mốc Nấm mốc (fungus, mushroom) vi sinh vật chân hạch, thể tản (thalophyte), tế bào khơng có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu chitin, có hay khơng có celuloz số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm học (Mycology) khai sinh bỡi nhà thực vật học người Ý tên Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống lạ” (Nova Plantarum Genera) theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) người có cơng nghiên cứu sâu nấm mốc lại Elias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống 50.000 lồi mơ tả, nhiên, ước tính có 100.000 đến 250.000 lồi nấm diện trái đất Nhiều lồi nấm mốc có khả ký sinh nhiều ký chủ động vật, thực vật, đặc biệt người, trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa qua chế biến, bảo quản Một số tác nhân gây bệnh, làm hư thiết bị thủy tinh bảo quản khơng tốt có nhiều lồi có ích tổng hợp acid hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đưa vào sản xuất cơng nghiệp có số nấm dùng làm đối tượng nghiên cứu di truyền học LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 1.2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo nấm mốc 1.2.1 Hình dạng kích thước Một số nấm thể đơn bào có hình trứng (yeast = nấm men), đa số có hình sợi (filamentous fungi=nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay khơng có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy lồi Đường kính sợi nấm thường từ 3-5µm, có đến 10µm, chí đến 1mm Chiều dài sợi nấm tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng (Hình 1.1) Các sợi nấm phân nhánh nhánh lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì bơng Trên mơi trường đặc số chất tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm đoạn sợi nấm phát triển thành hệ sợi nấm có hình dạng định gọi khuẩn lạc nấm (Hình 1.2) Hình 1.1: Sợi nấm cấu tạo Hình 1.2: Một số dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson ctv., 1995) 1.2.2 Cấu tạo Tế bào nấm có cấu trúc tương tự tế bào vi sinh vật chân hạch khác mơ tả trình bày Hình 1.3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Hình 1.3: Cấu tạo tế bào đỉnh sợi nấm Fusarium (theo Howard R J & Heist J R., 1979) (Chú thích: MT: vi ống, M: ty thể, SC: Golgi, V: bọng(túi) đỉnh, P: màng sinh chất lớp) Vách tế bào nấm cấu tạo vi sợi chitin có khơng có celluloz Chitin thành phần vách tế bào hầu hết loài nấm trừ nhóm Oomycetina Những vi sợi chitin hình thành nhờ vào enzim chitin syntaz Tế bào chất tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) hạt dự trữ (glycogen lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể tế bào nấm tương tự cấu trúc ty thể tế bào thực vật Ngồi ra, tế bào nấm cịn có ribơ thể (ribosomes) thể khác chưa rỏ chức Tế bào nấm khơng có diệp lục tố, vài lồi nấm có rải rác tế bào loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda ctv (1978) ly trích gọi neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ nấm Cercosporina kikuchi Tế bào nấm khơng thiết có nhân mà thường có nhiều nhân Nhân tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi m, bên màng nhân chứa ARN vàphospholipid protein dầy 0,02 ADN 1.3 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc Hầu hết lồi nấm mốc khơng cần ánh sáng q trình sinh trưởng Tuy nhiên, có số lồi lại cần ánh sáng trình tạo bào tử (Buller, 1950) Nhiệt độ tối thiểu cần cho phát triển từ 2oC đến 5oC, tối hảo từ 22oC đến 27oC nhiệt độ tối đa mà chúng chịu đựng 35oC đến 40oC, cá biệt có số lồi sống sót OoC 60oC Nói chung, nấm mốc phát triển tốt môi trường acit (pH=6) pH tối hảo - 6,5, số loài phát triển tốt pH < số phát triển pH > (Ingold, 1967) Oxi cần cho phát triển nấm mốc chúng nhóm hiếu khí bắt buộc phát triển ngưng khơng có oxi dỉ nhiên nước yếu tố cần thiết cho phát triển Theo Alexopoulos Minns (1979) cho biết nấm mốc phát triển liên tục 400 năm hay điều kiện mơi trường thích hợp cho phát triển chúng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Nấm mốc diệp lục tố nên chúng cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngồi (nhóm dị dưỡng), số sống sót phát triển nhờ khả ký sinh (sống ký sinh thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) xác bã hữu cơ, có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật định Theo Alexopoulos Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo Ca Các nguyên tố diện nguồn thức ăn vô đơn giản glucoz, muối ammonium nấm hấp thu dễ dàng, từ nguồn thức ăn hữu phức tạp nấm sản sinh tiết bên loại enzim thích hợp để cắt đại phân tử thành phân tử nhỏ để dể hấp thu vào tế bào 1.4 Sinh sản nấm mốc Nói chung, nấm mốc sinh sản hình thức: vơ tính hữu tính Trong sinh sản vơ tính, nấm hình thành bào tử mà khơng qua việc giảm phân, trái lại sinh sản hữu tính nấm hình thành loại giao tử đực 1.4.1 Sinh sản vơ tính The Alexopoulos Mims (1979), nấm mốc sinh sản vơ tính thể qua dạng: sinh sản dinh dưỡng đoạn sợi nấm phát triển dài phân nhánh sinh sản loại bào tử Một số lồi nấm có bào tử đặc trưng sau: a Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): bào tử động (zoospores) (Hình 1.4 a, b, c) có nấm Saprolegnia Hình 1.4: Bào tử động (theo Samson ctv., 1995) b Bào tử đính (conidium): bào tử đính khơng có túi bao bọc giống nấm Aspergillus, Penicillium, Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí cách xếp bào tử đính thay đổi từ giống sang giống khác dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm Cuống bào tử đính dạng bình khơng phân nhánh Aspergillus (Hình 1.5) hay dạng thẻ phân nhánh Penicillium (Hình 1.6) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Hình 1.5: Các kiểu cuống bào tử đính Aspergillus a lớp, b lớp, c phiến, d tia, e tể (theo Samson ctv., 1995) Hình 1.6: Bào tử đính cuống bào tử đính Penicillium chrysogenum (theo Samson ctv 1995) 1.4.2 Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy có kết hợp hai giao tử đực (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua giai đoạn: Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với hòa hợp tế bào trần (protoplast) giao tử Tiếp hợp nhân (karyogamy) với hòa hợp nhân tế bào giao tử để tạo nhân nhị bội (diploid) Giảm phân (meiosis) giai đoạn hình thành bào tử đơn bội (haploid) qua giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội) Theo Machlis (1966) tất giai đoạn kể giai đoạn tạo quan sinh dục điều khiển số kích thích tố sinh dục (sexual hormones) Cơ quan sinh dục nấm mốc có tên túi giao tử (gametangia) có loại: quan sinh dục đực gọi túi đực (antheridium) chứa giao tử đực (antherozoids), cịn quan sinh dục gọi túi nỗn (oogonium) chứa giao tử hay nỗn, có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN kết hợp giao tử đực noãn tạo thành bào tử, bào tử di động gọi bào tử động (zoospores) Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực tiếp hợp sinh bào tử có tên tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử đặc trưng nhóm nấm Myxomycetes Bào tử sinh dục hình thành có dạng túi gọi nang (ascus) túi chứa bào tử gọi bào tử nang (ascospores) Nang bào tử nang đặc trưng nhóm Ascomycetes Trong nhóm Basidiomycetes, bào tử phát triển phần tận cấu trúc thể gọi đãm (basidium) bào tử gọi bào tử đãm (basidiospores) Nhóm Nấm bất tồn (Deuteromycetes=Deuteromycotina)) gồm nấm chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính chúng Hình 1.7: Các kiểu bào tử đảm a Astrea, b Bovista, c Agaricales, d Clavulina, e Dacrymyces, f Sistotrema, g Repetobasidium, h Xenasma, i-n bào tử đảm có vách, n Puccinia (theo Kreisel, 1995) 1.5 Vị trí vai trị nấm mốc Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến sống người cách trực tiếp cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước sau thu hoạch, chế biến, bảo quản Nấm mốc gây hư hại vật dụng, quần áo hay gây bệnh cho người, động vật khác trồng Tuy nhiên, qui trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men cần đến có mặt vi sinh vật có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN nấm mốc Nấm mốc giúp tổng hợp loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acit hữu (acit oxalic, citric, gluconic ), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), số enzim hoạt chất khác dùng công nghiệp thực phẩm y, dược sử dụng rộng rãi giới Ngồi ra, nấm cịn giử vai trò quan trọng việc phân giải chất hữu trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh người, Microsporum gây bệnh chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh chim; Saprolegnia Achlya gây bệnh nấm ký sinh cá Những loài nấm gây bệnh trồng Phytophthora, Fusarium, Cercospora đặc biệt nấm Aspergilus flavus Aspergillus fumigatus phát triển ngũ cốc điều kiện thuận lợi sinh độc tố aflatoxin Bên cạnh tác động gây hại, số loài nấm mốc hữu ích sản xuất đời sống nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin ), nấm Aspergillus niger tổng hợp acit hữu acit citric, acit gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin số lồi nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina ký sinh trùng gây hại qua dùng làm thiên địch diệt trùng Ngồi ra, lồi nấm sống cộng sinh với thực vật Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ hút nhiều lượng phân vô khó tan cung cấp cho nhu cầu phát triển trồng Độc tố 2.1 Loại độc tố điển hình chủng nấm mốc Aspergillus flavus A parasiticus hai loài nấm mốc quan trọng lịai nấm mốc có khả tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tố mycotoxin tạo từ nhiều chuẩn hai loài gọi chung aflatoxin có khả gây ung thư Các nấm mốc phát triển nhiệt độ từ – 40oC tối ưu 24 – 28oC, có khả tăng tưởng tốt lọai ngũ cốc, nông sản( lúa, gạo, bắp ) không phơi sấy tốt, đặc biệt nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm nhiệt độ khơng khí cao Từ ngun liệu này, nấm mốc độc tố nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người Ở chủng có khả dinh độc tố, sau tăng tưởng – ngày độc tố đượ tạo tiến vào chất Bốn loại aflatoxin tạo Aspergillus flavus A parasiticus aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) va G1, G2 phát huỳnh quang màu lục (green) Khi ăn cỏ thức ăn chứa B1 B2, bị sữa chuyển hóa chúng thành độc tố aflatoxin M1, M2 diện sữa bò Do aflatoxin chất gây ung thư mạnh nên kiểm tra nghiêm ngặt Hầu có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Aflatoxin M1 : 0.2µg/ trứng 4.1.4.3 Thử nghiệm ấu trùng giáp xác Loài Artemia salina: Thử nghiệm tiến hành vịng 24 Khơng cần thiết bị đắt tiền nuôi dưỡng sinh vật Trứng tôm sống qua nhiều năm bảo quản khô Các trứng 27 oC nước mặn ( tỉ trọng 1.02) nở vòng 25 Ta chọn lọc ấu trùng sức sống cách cho chúng bơi từ điểm tối tới điểm sáng Các Aflatoxin nghi ngờ có mẫu chiết cloroform, sau loại bỏ chất đun cách thủy Dùng pipet lấy khoảng 30 - 50 ấu trùng 0.5 ml nước cho vào mặt kính đồng hồ có nước chiết cần thử Sau 24 37.5o C tính phần trăm số ấu trùng chết Bằng cách người ta xác định điều kiện hàm lượng 0.5g/ml aflatoxin B1 giết chết 60% số ấu trùng Nồng độ gấp đôi giết chết 90% ấu trùng 4.1.4.4 Thử nghiệm cá vàng Cá Brachydanio rerio có trứng suốt, cho phép ta dễ dàng theo dõi tiến triển Đặt ấu trùng vào nhiệt độ môi trường xung quanh 3-4 ngày: Chúng có nỗn hồng phơi lớn, chúng khơng cần phải ni dưỡng chăm sóc đặc biệt Đối với chúng aceton nồng độ thấp không độc người ta xác định hàm lượng Aflatoxin B1 0.1µg/ml (pha chế với 0.8% aceton) sau 30 phút gây ấu trùng hoạt động bất thường, sau đưa đến tình trạng hấp hối, sau 20 lịng đỏ bị thẫm màu xoắn lại, sau 24 – 35 lịng đỏ vỡ chết 4.1.4.5 Thử nghiệm nòng nọc Nhái Rana temporaria ăn phải Aflatoxin bị xung huyết gan, nòng nọc chúng chết nồng độ Aflatoxin 2µg/ml Dưới nồng độ khơng thể biến nhái trở thành nhái trưởng thành Nòng nọc Bufo melanostriclus, Racophorus leucomyslax maculatus Uperodon sp bị chết người ta nhận thấy gan thận chúng bị hư 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 4.2 Phương pháp đại 4.2.1 Phương pháp đo mật độ huỳnh quang 4.2.1.1 Nguyên lý phương pháp Aflatoxin chiết tách từ mẫu thử clorofoc Dịch chiết lọc phần dịch lọc làm qua cột silicagen Làm bay dung dịch rửa giải hoà cặn với clorofoc hỗn hợp benzen – axetonitril Sau chấm phần xác định mẫu thử lên mỏng,chạy sắc ký so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn đèn tử ngoại có bước sóng 365nm Lượng aflatoxin xác định mắt hay máy đo mật độ huỳnh quang Đối tượng áp dụng phương pháp : Xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu 4.2.1.2 Dụng cụ, hoá chất, thuốc thử 4.2.1.2.1 Dụng cụ - Máy xay nghiền mẫu - Máy lắc máy khuấy từ - Cân phân tích - Máy cất quay chân không - Bếp cách thuỷ - Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm - Quang phổ kế UV-VIS - Máy đo mật độ huỳnh quang - Các trang bị sắc ký lớp mỏng - Cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính 22mm, dài 300mm, có khố nút mài thuỷ tinh teflon bình đựng dung mơi phía trên, dung lượng 250ml - Bình nón nút mài 250ml, 500ml - ống đong 50ml, 100ml - Phễu lọc, đường kính – 10 cm - Micropipet Hamilton:20 m l, 50 m l - Bản mỏng kích thước 20 x 20 cm tráng sẵn lớp mỏng Silicagel 60-G 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 4.2.1.2.2 Hoá chất, thuốc thử Tất hoá chất phải loại tinh khiết phân tích (TKPT) khơng có dẫn riêng khác - Axê tôn - Clorofoc - n – Hexan - Ete êtylic khan - Metanol - Axetonitril - Toluen - Natri sunfat khan - Celite 545, đất điatomit - Axit sunfuric 50% (v/v) - Axit trifluoraxectic - Khí nitơ - Bông hút nước (được loại béo clorofoc) thuỷ tinh - Các hệ dung môi khai triển sắc ký - Clorofoc/ axeton: 9/1 (v/v) ( theo tỷ lệ thể tích) - Ete êtylic/ metanol/ nước: 94/4, 5/1,5/1 (v/v/v/v) - Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nước: 88/12/1, 5/1 (v/v/v/v) - Toluen/ êtyl axetat/ axit focmic: 6/3/1 (v/v/v) - Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 ¸ 0,2 mm Hoạt hố cách sấy khơ 105 o C giờ, sau trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 bình kín - Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: phòng mát, tránh ánh sáng): - Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): - Dùng ống chuẩn mg, loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 cho vào bình định mức 100ml định mức đến vạch hỗn hợp toluen – axetonitril 98: (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn 10 m g/ml) 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN - Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): Cho vào bình định mức 10ml 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A trên), định mức đến 10ml hỗn hợp toluen – axetonitril 98: (v/v), nồng độ dung dịch 0,5 m g/ml B1, G1, 0,1 m g/ ml B2, G2 Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A m g/ml) quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết theo cơng thức: C  mg / ml   1000  m  A e Trong đó: m – Khối lượng phân tử aflatoxin A – Mật độ quang bước sóng hấp thụ e - Độ hấp thụ phân tử aflatoxin Aflatoxin m Dung môi benzen – l max (nm) e benzen – axetonitril l max (nm) axetonitril (v/v) (v/v) B1 312 98: 350 19800 B2 314 98: 350 20900 G1 328 98: 350 17100 G2 330 98: 350 18200 Bảo quản: nhiệt độ thấp C, dung dịch A để tháng dung dịch B để hai tuần trước dùng hoạt hoá 1100C 4.2.1.3 Phương pháp tiến hành: (Điều kiện tiến hành: phòng mát, tránh ánh nắng ) 4.2.1.3.1 Chuẩn bị mẫu: Nghiền mẫu cho qua rây có lỗ cỡ 1mm Chú thích: Với mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn 5%, cần loại chất béo cách chiết với dung môi ête dầu hoả (độ sôi 40 – 600C) sau hồn thành cơng đoạn nghiền mẫu 4.2.1.3.2 Tiến hành xét nghiệm Chiết suất: Cân 50g mẫu nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt Lắc 30 phút máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ tay) lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 10ml dịch lọc đầu, sau lấy 50ml dịch lọc (tương đương 10g mẫu thử) Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Bucher có chứa lớp celite 545 dày 5mm giấy lọc lọc hút chân không Làm mẫu cột sắc ký: Chuẩn bị cột sắc ký: Cho vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (5.1.2.2.2.15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ Khi tốc độ lắng silicagel chậm lại, rút hết clorofoc để lại lớp 5cm phía lớp silicagel Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan Cột silicagel thu phải mịn, khơng có bọt khí ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan Trộn 50ml dịch lọc với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký chuẩn bị Loại bỏ dung dịch chảy Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy Chú ý không để cột bị khơ, lưu lượng dịng chảy khoảng – 12ml /phút Dung dịch rưả giải aflatoxin 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97) Lấy toàn dịch chảy từ bắt đầu cho dung dịch rửa giải hết Lưu lượng dòng chảy Làm bay dung dịch rửa máy cất quay chân không nhiệt độ thấp 500 C khoảng – ml Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu clorofoc làm bay đến khô nồi cách thuỷ nhiệt độ thấp 500C, tốt luồng khí nitơ nhẹ cặn lại ống nghiệm mẫu phân tích Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng chiều: Chuẩn bị: Hoà cặn thu 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) lấy dịch để chấm lên sắc ký Với mỏng tráng sẵn trước chấm sắc ký phải cạo lớp silicagel hai cạnh bên sắc ký với chiều rộng 0,5cm Sau cách cạnh đáy cm, dùng mao quản hay micropipet chấm vết dung dịch chuẩn aflatoxin dung dịch mẫu thử sau: - Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B (5.1.2.2.2.16.2) - Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B (5.1.2.2.2.16.2) - Lấy 10, 20 m l dịch chiết 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN - Với thể tích trên, dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn chấm chồng lên Khai triển sắc ký chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1) Sau tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy sắc ký để bay dung mơi nhiệt độ phịng, tránh ánh sáng Sau soi đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh Nếu mẫu thử có aflatoxin xuất vết giá trị Rf với vết aflatoxin chuẩn Rf vết aflatoxin hệ dung mơi clorofóc - axêtơn (9:1) có trị số trung bình sau: Aflatoxin B : 0,72 Aflatoxin B : 0,67 Aflatoxin G : 0,59 Aflatoxin G : 0,54 4.2.1.3.3 Thử nghiệm khẳng định có mặt aflatoxin: -Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên sắc ký, huỳnh quang vết aflatoxin chuyển sang màu vàng tia tử ngoại có bước sóng 365nm -Rót dung dịch iốt – 10% ête lên thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn khu vực giữa, ête bay hết lại lớp iốt mỏng Đặt úp thuỷ tinh lên sắc ký triển khai, cách khoảng cm thời gian 20 – 30 giây Lấy sắc ký quan sát đèn tử ngoại, huỳnh quang chất chuẩn dung dịch thử khơng đi, chứng tỏ có mặt aflatoxin -Chia mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần (cách 10cm giữa), chấm vết dịch chiết mẫu thửvà dung dịch aflatoxin chuẩn sau: Phần 1: Bên trái, chấm vết sau - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) Phần 2: Bên phải,chấm vết sau - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) 26 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết Nhỏ lên vết chấm phần bên trái, vết giọt axít trifluoraxetic Che phần (bên trái) thuỷ tinh khác, phun lên phần (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v) Dùng máy sấy nhẹ làm khô vết chấm cho vào bình khai triển Dung mơi khai triển: Nước/metanol/ete etylic – 1/3/96 (v/v) Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy sắc ký để khô nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi đèn tử ngoại bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm 4.2.1.3.4 Đánh giá kết - Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin dung dịch aflatoxin chuẩn vết dịch chiết (nếu có) có trị số Rf ngắn bình thường, giữ nguyên màu huỳnh quang xanh - Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin dung dịch aflatoxin chuẩn vết dịch chiết (nếu có)sẽ có trị số Rf bình thường, màu huỳnh quang xanh chuyển sang màu vàng 4.2.1.3.5 Định lượng - Bằng mắt: Xác định hàm lượng aflatoxin dịch chiết cách so sánh mật độ huỳnh quang vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang vết dung dịch chuẩn Vết huỳnh quang vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh huỳnh quang vết 10 m l dịch chiết phải trùng Nếu mật độ huỳnh quang vết 10 m l dịch chiết đậm mật độ huỳnh quang vết 20 m l dung dịch chuẩn phải pha lỗng dịch chiết tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại - Tính kết Hàm lượng aflatoxin (C) tính microgam kilogam mẫu tính theo cơng thức: C S  Y V WX Trong đó: S – Nồng độ aflatoxin dung dịch chuẩn mg/ml (Dung dịch B ) V – Thể tích cuối dịch chiết kể lần pha lỗng có, ml 27 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN W – Khối lượng mẫu thử, (tương ứng với thể tích dịch chiết tiến hành làm qua cột) g X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y dung dịch chuẩn chấm mỏng, ml Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X dịch chiết chấm mỏng, ml - Bằng máy đo mật độ huỳnh quang Bước sóng kích thích 365nm bước sóng phát xạ 443 nm Định lượng aflatoxin chấm dịch chiết cách so sánh mật độ huỳnh quang vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang vết dung dịch chuẩn Tính kết Hàm lượng aflatoxin (C), tính microgam kilogam mẫu thử tính sau: C Am  S  V  Y As  W  X Trong đó: Am - mật độ huỳnh quang vết mẫu As - mật độ huỳnh quang vết chuẩn X – Thể tích dịch chiết chấm lên mỏng ( m l ) Y – Thể tích dịch chuẩn chấm lên mỏng ( m l ) S – Hàm lượng aflatoxin dung dịch chuẩn,( ng) V– Thể tích cuối dịch chiết kể lần pha lỗng có, ( m l) W – Khối lượng mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết tiến hành làm qua cột,( g) 4.2.1.4 Độ nhạy phương pháp : m g / kg (5 ppm) - Hệ số thu hồi phương pháp : 90 ± 5% - Sai số trung bình phương pháp : ± 10% 4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 4.2.2.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (sau gọi tắt HPLC) Giới hạn phát phương pháp 1,5 mg/kg 28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 4.2.2.2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 Hiệp hội nhà hoá học phân tích (AOAC) cơng bố năm 1997 4.2.2.3 Ngun tắc Aflatoxin có mẫu thủy sản bao gồm nhóm B1, B2, G1 G2 chiết tách clorofom Dịch chiết đựơc làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) silicagel Hàm lượng aflatoxin có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn 4.2.2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn dung dịch thử 4.2.2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 5.2.2.4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang 5.2.2.4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ đến 10 [NAD1]mm 5.2.2.4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 mm 5.2.2.4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút 5.2.2.4.1.5 Cân phân tích có độ xác 0,0001 g 5.2.2.4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 000 vòng/phút 5.2.2.4.1.7 Bể siêu âm 5.2.2.4.1.8 Hệ thống cô quay chân khơng 5.2.2.4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID 500 x 20 mm 500 x mm 5.2.2.4.1.10 Ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml 5.2.2.4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml 250 ml 5.2.2.4.1.12 Bình định mức dung tích ml 10 ml 4.2.2.4.2 Hóa chất 5.2.2.4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC 5.2.2.4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC 29 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 5.2.2.4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC 5.2.2.4.2.4 Axetonitril loại dùng cho HPLC 5.2.2.4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích 5.2.2.4.2.6 Ete etylic tinh khiết 5.2.2.4.2.7 Sulfat natri khan 5.2.2.4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh 5.2.2.4.2.9 Silicagel hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy nhiệt độ 110oC Sau để nguội nhiệt độ phịng bình hút ẩm ngâm clorofom 15 phút trước nhồi cột 4.2.2.4.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử 5.2.2.4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) G2 (nồng độ 20 mg/l) 5.2.2.4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 5.2.2.4.3.1) metanol từ ống chuẩn Tùy theo nồng độ aflatoxin có ống chuẩn, dùng bình định mức lượng metanol thích hợp 5.2.2.4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l) G2 (2,0 mg/l): hút xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (5.2.2.4.3.1) vào bình định mức 10 ml (5.2.2.4.1.12) định mức tới vạch metanol (5.2.2.4.2.2) 5.2.2.4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút xác 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (5.2.2.4.3.3) vào bình định mức 10 ml (5.2.2.4.1.12) định mức tới vạch metanol Các dung dịch chuẩn thu có nồng độ aflatoxin sau: a Chuẩn : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0 mg/l), G2 (0,0 mg/l) b Chuẩn : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0 mg/l), G2 (0,2 mg/l) c Chuẩn : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0 mg/l), G2 (0,4 mg/l) d Chuẩn : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0 mg/l), G2 (0,8 mg/l) đ Chuẩn : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0 mg/l), G2 (1,6 mg/l) e Chuẩn : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l), G2 (2,0 mge) 5.2.2.4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp dung môi axetonitril, metanol nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ thể tích : : 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 4.2.2.4.4 Cách tiến hành 5.2.2.5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.2.2.5.1.1 Dùng cân phân tích (5.2.2.4.1.5) cân xác 50,0 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (5.2.2.4.1.10) 5.2.2.5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (5.2.2.4.2.3) vào ống trộn khoảng phút máy nghiền đồng thể (5.2.2.4.1.4) Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm (5.2.2.4.1.6) khoảng phút tốc độ 5000 vòng/phút Tiến hành lọc dịch chiết rửa phần bã clorofom cho tất dịch thu vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (5.2.2.4.1.11) 5.2.2.5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có aflatoxin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định (Ðiều 5.2.2.5.1) 5.2.2.5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn (5.2.2.4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (5.2.2.4.1.4) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định (Ðiều 5.2.2.5.1) Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử mẫu trắng 5.2.2.5.4 Làm dịch chiết 5.2.2.5.4.1 Chuẩn bị cột Ðặt lớp thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.1.9) Ðóng khóa cho clorofom tới khoảng 2/3 cột thêm 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel hoạt hóa (4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7) Chú thích: để tránh khơ cột ln giữ mực clorofom cao lớp sulfat natri khan khoảng 1,5 cm 5.2.2.5.4.2 Làm dịch chiết 5.2.2.5.4.2.1 Cô dịch chiết thu (5.2.2.5.1.2) hệ thống cô quay chân khơng (5.2.2.4.1.8) cịn khoảng 5,0 ml nhiệt độ 400C Dùng pipet chuyển dung dịch từ 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN bình cầu (5.2.2.5.1.2) vào cột làm chuẩn bị (5.2.2.5.4.1) tráng rửa bình cầu clorofom Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy dung dịch khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin hấp phụ lên hạt silicagel 5.2.2.5.4.2.2 Thêm vào cột 50,0 ml n-hexan (5.2.2.4.2.5), 50,0 ml ete etylic (5.2.2.4.2.6) Ðiều chỉnh tốc độ dung mơi chảy qua cột 1,0 ml/phút Sau loại bỏ dịch chảy khỏi cột 5.2.2.5.4.2.3 Giải hấp aflatoxin khỏi cột làm 50,0 ml hỗn hợp clorofom metanol theo tỉ lệ thể tích 97: với tốc dộ 1,0 ml/phút Hứng dung dịch chảy khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (5.2.2.4.1.11) Cô dịch thu hệ thống cô quay chân không (5.2.2.4.1.8) nhiệt độ 40o C khơ hồn tồn Hồ tan cặn 5,0 ml (V) dung dịch pha động (5.2.2.4.3.5) bình định mức ml (5.2.2.4.1.12) Tiến hành phân tích hàm lượng aflatoxin HPLC theo qui định tại( Ðiều 5.2.2.5.5) 5.2.2.5.4.2.4 Tiến hành làm mẫu trắng (5.2.2.5.2) mẫu để xác định độ thu hồi (5.2.2.5.3) giống với mẫu thử (5.2.2.5.1) theo qui định (Ðiều 5.2.2.5.4.2.1, Ðiều 5.2.2.5.4.2.2 Ðiều 5.2.2.5.4.2.3.) 5.2.2.5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.2.2.5.5.1 Ðiều kiện phân tích a Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt -10 [NAD2]mm b Nhiệt độ cột : 35oC c Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol nước cất (5.2.2.4.3.5) d Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút đ Bước sóng cài đặt cho đầu dị huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm e Thể tích tiêm: 20 ml 5.2.2.5.5.2 Tiêm dung dịch chuẩn (5.2.2.4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 5.2.2.5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình 5.2.2.5.6 u cầu độ tin cậy phép phân tích 5.2.2.5.6.1 Ðộ lặp lại lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 5.2.2.5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cách sử dụng 10 mẫu trắng cho vào lượng dung dịch aflatoxin chuẩn biết hàm lượng xác (5.2.2.5.3) Ðộ thu hồi tính phải nằm khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn 90 % 5.2.2.5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 5.2.2.6 Tính kết Hàm lượng aflatoxin có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.2) Với đường chuẩn dạng y = ax +b, hàm lượng aflatoxin có mẫu tính theo cơng thức sau: C (mg / kg )  Y b F a Trong đó: - C nồng độ aflatoxin có mẫu, tính theo mg/kg - Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b, xác định theo (Ðiều 5.2.2.5.5.2.) - F hệ số pha loãng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V (5.2.2.5.4.2) khối lượng mẫu m (5.2.2.5.1.1) sử dụng 4.2.2.5 Kết luận Độc tố nấm Aflatoxin làm cho người nhiễm bị ung thư gan, nguy hiểm Do đó, việc phịng ngừa quan trọng chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu dành riêng cho bệnh 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin Hiện thuốc chữa bệnh đặc hiệu khơng có, biện pháp phịng bệnh quan trọng Aflatoxin độc tố bền vững với nhiệt Vì biện pháp đun sơi thơng thường khơng có tác dụng độc tố Ðể đề phòng ngộ độc, biện pháp áp dụng vấn đề bảo quản tốt loại lương thực thực phẩm, chủ yếu thực phẩm thực vật - Với lương thực gạo, ngơ, mì: u cầu bảo quản giữ khơ, thống mát để khơng bị nhiễm mốc - Với thực phẩm thực vật khô lạc, vừng, cà phê thực phẩm dễ hút ẩm dễ mốc Muốn bảo quản tốt cần phơi khô, giữ nguyên vỏ, chứa dụng cụ sạch, kín để lâu, phải đem phơi khô lại Yêu cầu độ ẩm hạt 15% - Với nước chấm xì dầu, tương: Những thông báo kết nước ta cho thấy độ nhiễm Aflatoxin nước chấm đáng lo ngại Vì việc kiểm tra vệ sinh xí nghiệp sản xuất nước chấm cửa hàng mua bán cần thiết phải tiến hành thường xuyên Nội dung kiểm tra cần làm: Kiểm tra vệ sinh mơi trường (chủ yếu khơng khí) Kiểm tra vệ sinh nước chấm Ngoài tiêu vệ sinh qui định cho mẫu nước chấm mẫu khơng khí, cịn phải ý phát có mặt chủng nấm sinh độc tố như: Aspergillus flavus, parasiticus fumigatus 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Tài liệu tham khảo [1] Abdollahi, A., and R L Buchanan, Regulation of aflatoxin, 1981 [2] ADAMS, M.R., Et Al, Food microbiology, RSC, UK, 2002 [3] Bhatnagar, D., S P McCormick, L S Lee, and R A Hill 1987, Identification of Omethylsterigmatocystin as an aflatoxin B1/Gl precursor in Aspergillus parasiticus, Appi Environ Microbiol [4] GS.TS Nguyễn Thị Hiền, GS.TS Phan Thị Kim, Ts Trương Thị Hòa, Th.S Lê Thị Lan Chi, Vi sinh vật nhiễm tạp lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009 [5] Lê Ngọc Tú, Độc tố học an toàn thực phẩm, NXB Khoa học – Kỹ thuật Hà Nội, 2006 [6] Maggon, K K., S K Gupta, and T A Venkitasubramanian 1977, Biosynthesis of aflatoxins Bacteriol Rev 41:822-855 [7] M Herzberg (ed.), Toxic micro-organisms, UJNR Joint Panels on Toxic Micro-organisms and U.S Department of the Interior, Washington, D.C [8] Vandegraft, and G Shannon, Production of various aflatoxins, 1968 [9] http:// www.biochem.duke.edu 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nhiễm độc tố Aflatoxin 34 Tài liệu tham khảo 35 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Mở đầu Độc tố nấm mốc gây ngộ độc cấp... hai lồi nấm mốc quan trọng lịai nấm mốc có khả tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tố mycotoxin tạo từ nhiều chuẩn hai loài gọi chung aflatoxin có khả gây ung thư Các nấm mốc phát... luanvanchat@agmail.com NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin Hiện thuốc chữa bệnh đặc hiệu khơng có, biện pháp phịng bệnh quan trọng Aflatoxin độc tố bền vững với nhiệt