NGHIÊN cứu sự ẢNH HƯỞNG của MALACHITE GREEN lên sự BIẾN đổi một số CHỈ TIÊU SINH HOÁ và tồn lưu TRONG cá TRA (pangasius hypophthalmus) GIAI đoạn GIỐNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG HẢI TOÀN NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) Trung tâm Học liệu ĐH CầnGIAI ThơĐOẠN @ TàiGIỐNG liệu học tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng Malachite Green lên biến đổi số tiêu sinh hóa tồn lưu cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” thực từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu Malachite Green số biến đổi sinh hóa cá tra Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l 12 1mg/l 60 phút Kết cho thấy hoạt tính men não, gan cá Tra bị biến đổi khả phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ thời gian gây nhiễm MG Sau 60 ngày thí nghiệm MG cịn tồn lưu cá tra (2,01±1,88ppb 1,50±2,59ppb) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ABSTRACT “Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented from March to July 2006 The aim of the study was to determine the changes of some biomarkers and the residues of MG on catfish The experiment included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and mg MG/l in hours, each applied in replicates The results showed that the biomarkers activity in brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the treatment After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish (2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb) Keywords: Malachite Green, biomarker, residue Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CÁC TỪ VIẾT TẮT CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược Malachite Green 2.1.1 Sơ lược Malachite Green 2.1.2 Công thức cấu tạo số tính chất lý hóa Malachite Green 2.1.3 Độc tính Malachite Green 2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green 2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green giới Trung tâm Học liệuhình ĐH CầnMalachite Thơ @Green Tàiở liệu học tập nghiên cứu 2.2.2 Tính sử dụng Việt Nam 2.3 Ảnh hưởng Malachite Green 2.4 Một số nghiên cứu tiêu sinh hóa LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm 3.1.2 Thời gian thực 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 3.2.2 Cá thí nghiệm 3.2.3 Bố trí thí nghiện 10 3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá thu mẫu 10 3.2.5 Chuẩn bị mẫu 11 3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu 11 3.3 Xử lí số liệu 16 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) pH thời gian gây nhiễm Malachite Green 17 4.2 Sự tồn lưu MG LMG cá Tra giống 19 4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green 20 4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green 21 4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green 22 4.3 Sự biến đổi tiêu sinh hoá não, gan cá tra q trình thí nghiệm 23 4.3.1 Hoạt tính Acethylcholine (AchE) não, gan cá tra q trình thí nghiệm 23 4.3.2 Hàm lượng Lipid peroxidation (LPO) não, gan cá tra trình thí nghiệm 25 4.3.3 Hoạt tính men Gutatehion-S-transferas (GST) não, gan cá tra q trình thí nghiệm 26 Trung tâm Học liệutính ĐH Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 4.3.4 Hoạt củaCần men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) não, gan cá tra q trình thí nghiệm 27 4.3.5 Hoạt tính men Catalase (CAT) não, gan cá tra q trình thí nghiệm 28 CHƯƠNG 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 34 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Kết thí nghiệm xác định LC50 Malachite Green cá da trơn Bảng 2: Q trình phân tích AchE 12 Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA 13 Bảng 4: Quá trình phân tích GST 14 Bảng 5: Q trình phân tích G6PDH 14 Bảng 6: Q trình phân tích CAT 15 Bảng 7: Quá trình phân tích Prơtêin 16 Bảng 8: Nhiệt độ trình gây nhiễm MG 17 Bảng 9: pH trình gây nhiễm MG 18 Bảng 10: Oxy hoà tan trình gây nhi ễm MG 18 Trung tâmBảng Học ĐH Thơtheo @thời Tàigian liệu học tập nghiên19 cứu 11:liệu Sự tồn lưu Cần MG + LMG thí nghiệm Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 21 Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm 22 Bảng 14: Biến đổi hoạt tính AchE não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu 23 Bảng 15: Biến đổi hàm lượng LPO não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu 25 Bảng 16: Biến đổi hoạt tính GST não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu 26 Bảng 17: Biến đổi hoạt tính G6PD não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu 27 Bảng 18: Biến đổi hoạt tính CAT não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu 28 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Sự tồn lưu MG LMG theo thời gian thí nghiệm 20 Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 22 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long LMG Leucomalachite green MG Malachite Green AchE Acethylcholine LPO lipid peroxidase GST Glutathione S-transferase G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase CAT Catalase UBND Ủy ban nhân dân EU Thị trường chung Châu Âu BTS Bộ Thủy Sản HAE 4- hydroxyalkenals Trung tâmMDA Học liệu ĐHmalondialdehyde Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu DCP 2,4-dichlorphenol MC-RR micocystin-RR TCA Trichloroacetic acid DMSO Dimethyl sulfoxide TBA Thiobarbituric acid minimum DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene GSH Glutathione 50mM G-6-P D-glucose phosphat NADP nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate LOOP lipid hydrerxdes viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 diện tích mặt nước ngọt, nơi có tiềm lớn cho việc ni lồi cá nước như: Cá tra, basa, vồ đém, hú, tra bần…trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) đối tượng ni truyền thống Đối tượng người ni ưa chuộng có ưu điểm như: dễ ni, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với mơi trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, ni mức độ thâm canh cao Trong năm gần đây, việc quảng bá, thúc đẩy xuất mặt hàng cá tra ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng thị trường mặt hàng cá Tra Việt Nam nâng cao nhiều Theo số liệu thống kê tỉnh An Giang, Cần Thơ năm 2005, tình hình ni cá tra khu vực có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài cá khu vực An Giang Cần Thơ năm 2004 160.000 (Cục thống kê An Giang Cục thống kê Cần Thơ, 2005) Từ kỹ thuật ni phát triển nhanh, suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ thả nuôi tăng (120-130 con/m3 nuôi bè 25-35con /m2 ni ao đất (Nguyễn Chính, 2005) Trung Tuy nhiên muốn gia tăng suất, sản lượng mà người nuôi thả mật độ dày tâm liệu ĐHdẫn Cần @ Tài nghiên cứu đặc, Học cho thức ăn thừa đến Thơ môi trường bị ô liệu nhiễm,học dịch tập bệnh thường xảy dẫn đến việc sử dụng loại thuốc, hố chất phịng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi vấn đề cần thiết hợp lý sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004) Đặc biệt thường xuyên sử dụng số hóa chất cấm sử dụng Malachite Green Chất Malachite Green dùng phổ biến giới trị bệnh nấm bên kí sinh trùng ương ni cá lồi sị hến (nhuyễn thể) Đó loại thuốc trị nấm công hiệu thường xuyên dùng để tẩy trùng bể ương cá giống Chất Leucomalachite green (LMG) chất tạo thành trình chuyển hóa Malachite Green thường tồn dư cá thời gian dài, Malachite Green khơng cịn tồn lưu (CFIA, 2005) Chính tồn lưu ảnh hưởng đáng kể đến ngành xuất thủy sản sang nước Châu Âu, Mỹ, Canada, Nhật,…Cụ thể cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi cá trê xuất doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả phát nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005) Ngoài việc sử dụng hố chất cịn ảnh hưởng đến số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống cá Do đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng Malachite Green lên biến đổi số tiêu sinh hóa tồn lưu cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” thực hiên cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đào thải Malachite Green cá tra số biến đổi sinh hóa Từ đề xuất giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng an tồn Nội dung nghiên cứu: • Ảnh hưởng sử dụng Malachite Green lên biến đổi Acetylcholine, lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Catalase cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống • Phân tích tồn lưu Malachite Green cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com có trọng lượng trung bình 18,47 ±2,49g Kết cho thấy điều kiện bình thường nhiệt độ, DO khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính ChE Trong mơi trường có Basudin DO khơng làm ảnh hưởng đến mức độ ức chế ChE mà có nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến ức chế này, nhiệt độ cao mức độ ức chế tăng (ngoại trừ gan) Kết cho thấy cá lóc có nhiều nguy bị ảnh hưởng nghiêm trọng việc sử dụng Basudin điều kiện mơi trường đồng ruộng Nhìn chung yếu tố nhiệt độ, DO, pH nằm khoảng thích hợp cho sinh trưởng phát triển cá tra, nghiệm thức khơng có chênh lệch nhiều Do nhiệt độ, DO, pH khơng phải điều kiện ảnh huởng đến hoạt động sinh lý, sinh hoá cá tra 4.2 Sự tồn lưu MG LMG cá Tra giống 4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green Tổng lượng tồn lưu MG LMG trình bày bảng 11 hình Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Ngày Ngày Ngày 30 Ngày 60 (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) Trung tâm Học liệu ĐH1003±54,7 Cần Thơ @107±43,0 Tài liệu học tập nghiên cứu 0,1 ppm 6,28±3,04 2,01±1,88 ppm 2569±402 110±22,98 10,6±4,70 1,50±2,59 Kết phân tích cho thấy tổng lượng tồn lưu MG LMG cá vào thời điểm kết thúc gây nhiễm MG (Ngày 0) tương ứng 1003±54,7 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 2569±402 µg/kg (nồng độ 1ppm) Kết cho thấy tồn lưu MG LMG sau sử dụng cao Sự tồn lưu MG LMG giảm dần theo thời gian đến ngày thứ 60 sau kết thúc gây nhiễm tổng hàm lượng MG LMG lại cá 2,01±1,88 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (nồng độ 1ppm) hàm lượng LMG khơng phát mẫu cá 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com M a la c h it e g r e e n + L e u c o M a la c h it e g r e e n 3500 ppb 3000 2500 ,1 p p m 2000 ppm 1500 1000 500 Ngày Ngày Ngày 30 Ngày 60 N gày M a la c h it e g r e e n + L e u c o M a la c h it e g r e e n ppb Trung tâm 16 14 Học 12 10 liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ,1 p p m 1 ppm 1 Ngày 30 Ngày 60 N gày Hình 1: Sự tồn lưu MG LMG theo thời gian thí nghiệm Qua liệu cho thấy có đào thải MG LMG khỏi thể cá theo thời gian Tuy nhiên kết phân tích mẫu nước sau ngày thí nghiệm khơng phát MG LMG mẫu nước phân tích với giới hạn phân tích phương pháp ng/ml (1ppb) Các quốc gia khối Liên minh Châu Âu Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa MG LMG sản phẩm thủy sản ng/g (ppb) Hoa kỳ Canada cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa không chấp nhận 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com diện dư lượng dù thật thấp MG LMG (www.khoahoc.net,22/12/2005) Kết thí nghiệm sau 60 ngày cho thấy cịn diện MG ( 2,01±1,88ppb 1,50±2,59ppb) Ba m ẫu sáu mẫu phân tích xác định có hàm lượng MG cao mức giới hạn ng/g Điều cho thấy sau thời gian 60 ngày gây nhiễm hàm lượng MG cịn tồn lưu cá Kết nghiệm thức gây nhiễm với nồng độ 0,1ppm thời gian 12h 2,01±1,88ppb cao so với mức giới hạn quy định Liên minh Châu Âu Châu Úc nghiệm thức gây nhiễm với nồng độ 1ppm thời gian 1h sau 60 ngày hàm lượng MG tồn lưu trung bình 1,50±2,59ppb, thấp so với mức giới hạn Liên minh Châu Âu Châu Úc Cả hai mức tồn lưu không chấp nhận theo quy định FDA Hoa Kì Theo Nguyễn Chính (2005) số hộ nuôi cá tra khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang cho biết không sử dụng MG q trình ni qua phân tích diện đến 10/64 mẫu cá thương phẩm, nồng độ tồn lưu - 4,9 ppb Đối với cá ni diện 9/30 mẫu kiểm tra, nồng độ tồn lưu 2,4 4,18 ppb Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu cá chình ni sau trị bệnh khơng 100 ngày, với cá hồi chấm không 10 tháng (Raoul ctv, 2002) 4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức 0,1 ppm ppm Ngày Ngày Ngày 30 Ngày 60 (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 821±54 22,22±2,72 3,64±0,43 2,01±1,88 2106±157 29,01±1,18 7,41±4,04 1,50±2,59 Kết phân tích (Bảng 12) cho thấy sau gây nhiễm MG với nồng độ 0,1ppm thời gian 12 nồng độ ppm thời gian 60 phút cho thấy tồn lưu MG tương ứng 821±54 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 2106±157 µg/kg (nồng độ 1ppm) Kết cho thấy tồn lưu MG sau sử dụng cao Tuy nhiên sau ngày gây nhiễm tồn lưu MG giảm xuống cịn 22,22±2,72 µg/kg(nồng độ 0,1ppm) 29,01±1,18 µg/kg (nồng độ 1ppm) Sự tồn lưu MG giảm dần theo thời gian đến ngày thứ 60 sau gây nhiễm hàm lượng MG cịn lại cá 2,01±1,88 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (nồng độ 1ppm) Sự giảm dần tồn lưu MG cá tra theo thời gian thấy rõ hình 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ppb M a la c h it e g r e e n & L e u c o M a la c h it e g r e e n 2500 2000 M G ,1 ppm MG ppm LM G ,1 p p m LM G 1ppm 1500 1000 500 Ngày Ngày Ngày 30 Ngày 60 Ngày Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Ngày Ngày Ngày 30 Ngày 60 0,1 ppm 182±3,45 84,7±41,1 2,88±2,23 0,00±0,00 ppm 156±31,9 80,7±21,8 2,92±1,07 0,00±0,00 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Qua bảng 13 cho thấy sau gây nhiễm MG với nồng độ 0,1 ppm thời gian 12 nồng độ ppm thời gian 60 phút cho thấy có chuyển hố MG thành LMG tồn lưu thể cá Hàm lượng LMG chuyển hoá từ MG sau gây nhiễm tương ứng 182±3,45 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 156±31,9 µg/kg (nồng độ 1ppm) Kết cho thấy chuyển hố nhanh chóng từ MG sang LMG sau sử dụng cao Tuy nhiên sau 30 ngày gây nhiễm tồn lưu LMG giảm xuống nhanh chóng 2,88±2,23 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 2,92±1,07 µg/kg (nồng độ 1ppm) Sự tồn lưu LMG giảm dần theo thời gian đến ngày thứ 60 sau gây nhiễm hàm lượng LMG khơng cịn phát mẫu cá với giới hạn phân tích hệ thống phân tích µg/kg (1ppb) Hình cho thấy rõ giảm dần tồn lưu LMG cá tra theo thời gian Kết chưa khẳng định hoàn toàn LMG sau 60 ngày gây nhiễm đào thải hồn tồn ngun nhân phương pháp phân tích dựa hệ thống sắc kí HPLC với đầu dị huỳnh quang nên giới hạn phát (LOD) đến 1ppb phân tích hệ thống sắc kí lỏng khối phổ giới hạn phát LOD thấp (0,01 ppb) 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3 Sự biến đổi tiêu sinh hoá não, gan cá tra trình thí nghiệm 4.3.1 Hoạt tính Acetylcholinestrease (AChE) não, gan cá tra q trình thí nghiệm Bảng 14: Biến đổi hoạt tính AChE (nmole/phút/mg protein) não, gan theo thời gian qua đợt thu mẫu Cơ quan Nghiệm thức Não Đối chứng Gan Lần Lần Lần Lần 2103 ± 774 2317 ± 35 2392 ± 111 2349 ± 86 0,1ppm 1ppm 2353 ± 137 ns 2031 ± 495ns Đối chứng 0,1ppm 1722 ± 304 1548 ± 292ns 1847 ± 246ns 1404 ± 208* (41%) 1680 ± 134 1609 ± 148ns 1897 ±137ns 1340 ±103* (43%) 1212 ± 44 1097 ± 128ns 1ppm 1909 ± 367ns 2050 ± 251ns 2054 ± 72* (11%) 1909 ± 367 1054 ± 37* (45%) 1488 ± 31ns 1487 ± 464ns 1177 ± 37ns Kết trình bày trung bình ± SD Dấu (*) sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P