TÌM HIỂU CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

I. TỔNG QUAN 3 1.1. Khái niệm cây chuyển gen. 3 1.2. Đặt vấn đề. 4 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước. 4 1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới. 5 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN CÂY TRỒNG. 6 2.1 Lựa chọn đối tượng cây trồng chuyển gen 6 2.2. Phương pháp chuyển gen vào thực vật 7 2.2.1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen 8 2.2.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens 9 III. Các cây trồng quan trọng đã được phát triển 18 IV. Đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen. 25 4.1. Cơ sở khoa học. 25 4.2. Đánh giá cây chuyển gen ở mức độ phòng thí nghiệm. 25 4.3. An toàn sinh học. 26 v. Tài liệu tham khảo.......................................................................................................28

z TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa CNSH & KTMT ĐỀ TÀI TÌM HIỂU CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN GVHD: TS PHẠM MINH TUẤN SVTH: NHÓM 10 Phạm Minh Tiến 2008100192 Trần Thanh Toàn 2008100157 Dương Đình Hai 2008100308 Phu Quỳnh Phương 2008100070 Nguyễn An Phúc 2008100140 Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 11 năm 2012 1 MỤC LỤC 28 2 I TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chuyển gen Muốn tạo sinh vật biến đổi gen (genetically modified organismGMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào tế bào chúng Ở vi khuẩn, tế bào xử lý dung dịch muối calcium chloride Ở tế bào nấm men, tiếp nhận DNA tăng lên tế bào tiếp xúc với lithium chloride lithium acetate Tuy nhiên, phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có phương pháp khác tinh vi Chuyển gen thực vật phát triển với phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nó trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu sinh học thực vật Ngoài việc mở triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào trồng, kỹ thuật cho phép nghiên cứu cấu trúc điều khiển hoạt động gen Quá trình đưa DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) sinh vật gọi trình biến nạp (transformation) Những biến nạp gọi biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Ứng dụng công nghệ gen cơng tác giống trồng đại có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như: - Bằng việc biến nạp gen thu mang đặc tính xác định - Rào cản lồi khơng cịn có tác dụng, khơng gen từ thực vật mà từ vi khuẩn, nấm, động vật người chuyển thành công vào thực vật Về nguyên tắc thay đổi vùng điều khiển gen, promoter ( gen khởi động trình phiên mã) terminator (gen kết thúc trình phiên mã) Tuy nhiên, số trường hợp đòi hỏi thay đổi phù hợp codon - Những đặc điểm không mong muốn thực vật Chẳng hạn, tổng hợp chất độc chất gây dị ứng loại trừ cơng nghệ gen - Thực vật biến đổi gen lò phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu protein chất cần thiết dùng dược phẩm thực phẩm - Mở khả nghiên cứu chức gen trình phát triển thực vật trình sinh học khác Vì vậy,thực vật biến đổi gen có ý nghĩa nghiên cứu - Trong lai tạo giống đại, công nghệ gen giúp làm giảm mâu thuẫn kinh tế môi trường sinh thái Bằng việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật Mục đích nơng nghiệp đại khơng tăng suất mà hướng đến lĩnh vực quan trọng sau: + Duy trì mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity) + Tăng khả kháng (sức khỏe trồng chống chịu điều kiện bất lợi) + Nâng cao chất lượng sản phẩm + Cải thiện khả tích lũy dinh dưỡng + Tăng cường tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học + Tạo sản phẩm không gây hại môi trường 3 4 1.2 Đặt vấn đề Kể từ bắt đầu có sống, gen đã vượt ngồi giới hạn lịi sinh vật họ hàng khơng có họ hàng tự nhiên Các ứng dụng cơng nghệ sinh học có từ năm 1800, người bắt đầu sử dụng nấm men để làm dậy men bánh mì lên men rượu Vào năm 1860, ngừi bắt đầu lai tạo trồng thông qua thụ phấn chéo Họ chuyển chọn lọc gen để tăng cường tính chất có lợi trồng thơng qua phương pháp lai chéo mà không cần biết tới tính trạng gen mã hố Hầu hết thực phẩm, bao gồm lúa, ngô, chuối, khoai tây, đu đủ,…đều sản phẩm phương pháp lai chéo truyền thống Công việc kiểm định qua thời gian tiếp tục tạo giống trồng với giống trồng với tính trạng mong muốn Tuy nhiên, phương pháp lai chéo truyền thống có nhuững hạn chế Nó tiến hành loài thực vật giống có quan hệ họ hàng với Do nguồn gen có sẵn lồi có giới hạn Hơn nữa, lai chéo gen, tất 100.000 gen – số lượng gen thực vật trộn lẫn, tạo thành hỗn hợp ngẫu nhiên Do cuối người lai tạo giống truyền thóng muốn vài gen hay tính trạng trao đổi Công nghệ sinh học đại biến đổi di truyền giúp q trình xác nhanh nhiều Đây kết nhà khoa học nhờ hiểu biết tận dụng đặc tính tự nhiên 1.3 Tình hình nghiên cứu nước Cơng nghệ sinh học ngày có đóng góp quan trọng để nâng cao hiệu sản suất, lĩnh vực nông nghiệp nhiều giống gen quý phân lập chuyển vào trồng tạo lý tưởng Sinh vật chuyển gen ( GMO ) cho suất cao, đem lại lợi ích cho người sản xuất điều khẳng định qua khoa học thực tiễn Một số phịng thí nghiệm đầu tư công nghệ cao đưa nhà khoa học tập huấn nước Do vậy, làm chủ kỹ thuật công nghệ gen phân lập xác định trình tự gen, thiết kế biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật, vv… Trong năm qua, giới CN sinh học mà nịng cốt CN gen có bước tiến vượt bậc Cây trồng biến đổi gen (GMC) đạt diện tích 102 triệu vào năm 2006 Đó tốc độ chấp nhận kỷ lục sx công nghệ ứng dụng sx nông nghiệp mà lịch sử biết đến Dự kiến đến 2015, số nước trồng biến đổi gen tăng từ 22 Qgia lên 40 QG, chiếm diện tích trồng trọt 200 tr Ha Tuy nhiên , VN, trông biến đổi gen chưa thức chấp nhận đưa vào sx, mặcdù CNSH lĩnh vực ưu tiên, đứng sau CN thông tin Về nghiên cứu, giai đoạn 1990-2000, nước ta chưa có đề tài, dự án tạoGMC nước Các nghiên cứu chủ yếu dự án hợp tác QTế mà VN bên tham gia, dự án tạo giống lúa có hàm lượng vitamin A cao, dự án tọa giống 5 đu đủ kháng vi rút gây bệnh đốm vịng…Giai đoạn 2001-2005, Bộ KH&CN chủ trì Chương trình CNSH, Bộ NN & PTNN chủ trì Chương trình giống trồng, vật nuôi Tuy nhiên, kết dự án dừng lại khn khổ phịng thí nghiệm mà chưa tạo GMC có giá trị ứng dụng cho sx nông nghiệp Giai đoạn 2006-2010, chương trình CNSH nơng nhiệp xét duyệt đưa vào thực đề tài tạo giống GMC ngô đậu tương Dự kiến đến 2010 đề tài có kết đến giai đoạn 2013-2015 VN có trồng biến đổi gen nhà KH Việt Nam tạo kết áp dụng thành cơng Vì vậy, giai đoạn từ đến 2010 mục tiêu chương trình CNSH nơng nghiệp tạo sở pháp lý cho việc ứng dụng thành tựu tạo giống GMC cuả nước VN Dự thảo quy định quản lý an toàn sinh học GMC bước vào giai đoạn cuối, dự kiến ban hành năm 2007 Đây quy định quan trọng tạo bước ngoặt ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp VN, góp phần thúc đẩy nghiên cứu & ứng dụng công nghệ gen sx Mặt khác công cụ hữu hiệu cho nhà quản lý việc định hướng ứng dụng công nghệ theo hướng có lợi cho sx, mơi trường, đa dạng sinh học sức khỏe người 1.4 Tình hình nghiên cứu giới a Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ Nhiều loại trồng biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ rộng Các trồng chuyển gen nàychứa gen giúp chúng phân huỷ thành phần hoạt động thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vơ hại Nơng dân dễ dàng loại bỏ cỏ dại suốtvụ mùa thoải mái chọn lựa thời điểm phun thuốc Cây trồng kháng thuốc diệtcỏ khơng cần cần việc làm đất Những người phản đối cho việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ dẫn đến tăng sử dụng thuốc diệtcỏ, kích thích kháng thuốc diệt cỏ cỏ dại, hủy hoại đa dạng sinh học nông nghiệp Gần đây, hai hệ thống trồng kháng thuốc diệt cỏ phát triển đậu nành, ngô, củ cải dầu bônglà: RoundupReady Liberty Link b Cây trồng kháng bệnh Các trồng bị bệnh gây rabởi lồi nấm, vi khuẩn, vi rút, giun tròn tác nhan khác Nhiều phương pháp công nghệ cao đề xuất nhằm bảo vệ thực vật khỏi tác hạinày đến nay, hầu hết mối quan tâm tập trung vào thực vật chuyển gen kháng virus, việc sử dụng công nghệ sinh học để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn quan tâm c Thực vật với thành phần thay đổi Ngày nhiều giống trồngchuyển gen khảo nghiệm với đặc tính tăng giá trị chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công 6 nghiệp người tiêu dùng Các thực vật chuyển gen vớithành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho cơng nghiệp người tiêu dùng Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột biến đổi hạt dầu dùng để thay sản phẩm dầu mỏ mối quan tâm công nghiệp Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ hệ trồng biến đổi gen tiếp theo, hệ củagạo với mức độ tăng cường cao sắt, vitamin A hay dầu thực vật làmgiảm nguy bệnh tim… d Cây trồng chống chịu áp lực Các nhà sinh học thực vật sử dụng cơng nghệ sinh học để hồn thiện cách thức khiến thực vật thích nghi với thách thức môi trường hạn hán, mặn hay nhiệt độ khắc nghiệt - Chịu hạn: Một cách tạo thực vậtchịu hạn lấy gen từ thực vật có khả chịu hạn chuyển vào trồng Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn gốc từ vùng khơ hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hoá protein thành tế bào Thực nghiệm thực vật nhận gen có khả chịu áp lực hạn hán độ mặn cao - Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận thực vật có khả chịu mặn cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine Hơn nữa, thực vật có khả chịu mặn trung bình có nồng độ trung bình thực vật với khả chịu mặn thấp có hay khơng chứa chấtglycinebetaine Khoai tây chuyển gen với khả sản sinh nhiều glycinebetaine tăng khả chịu mặn e Loại bỏ chất nhiễm Thực vật vi sinh vật cải biến để tăng khả hấp thu kim loại nặng phân huỷ sản phẩm dầu Các biện pháp công nghệ sinh họcđược áp dụng để loại bỏ chất ô nhiễm Thực vật biến đổi gen biến đổi để tích luỹ nồng độ cao kim loại độc Một ví dụ biện pháp việcsử dụng dương liễu với khả hút catmi từ đất ô nhiễm Kim loại độc rễ hút nhanh chóng sau dự trữ gỗ để loại đi.Nhiều thực vật có khả hấp thu lượng nhỏ kim loại nặng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN CÂY TRỒNG 2.1 Lựa chọn đối tượng trồng chuyển gen Trên giới người ta tập trung chọn đối tượng có tính khả thi cao để tiến hành tạo trồng chuyển gen theo tiêu chí sau: • có khả thích ứng thành cơng cao ni cấy in vitro • có gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn tạo tính kháng bệnh virus, kháng chất diệt cỏ, kháng côn trùng, tăng chất lượng dinh dưỡng… • có giá trị thương mại cao • có khả bảo vệ quyền sở hữu trí tuệ đưa thị trường 7 2.2 Phương pháp chuyển gen vào thực vật Genom thực vật có phần khác nhau, phần nằm nhân, phần nhỏ nằm lục lạp nằm ti thể Hầu hết nghiên cứu chuyển gen thử nghiện việc đưa gen lạ vào nhân Có hai nhóm phương pháp chuyển gen thực vật là: • Phương pháp trực tiếp: kỹ thuật bắn gen, kỹ thuật vi tiêm, kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật PEG • Phương pháp gián tiếp: chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen nhờ virus phage Một số nguyên tắc chuyển công nghệ chuyển gene thực vật Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến q trình chuyển gen sau: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn (totipotency) - Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân 8 sinh (meristem) 2.2.1 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, thiết kế cho biến nạp DNA ngoại lai vào t ế bào thực vật phát triển vào đầu thập niên 1980 nhà th ực v ật h ọc Ðại học Corrnell với nhà nghiên cứu Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA Súng bắn gen bán thị trường vào năm 1990 Tên xác đầy đủ súng bắn gen hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) kỹ thu ật th ường đ ược g ọi cách đơn giản biolistics (sự kết hợp gi ữa hai thuật ngữ biology (sinh h ọc) ballistics (sự bắn tung)) Nguyên lý chung phương pháp sử dụng áp lực xung c khí helium đ ể gia tốc hạt Cấu tạo súng bắn gen: Súng bắn gen bao gồm hai buồng thép khơng gỉ, kích th ước 6″x7″x10″ n ối với hai bơm chân không Đạn hạt tungsen có đường kính nhỏ, khoảng μm ch ứa DNA ngoại lai (các kim loại khác vàng bạc đ ược s d ụng nh ưng không thường xuyên giá đắt) Sự bùng nổ khí helium 1000psi làm cho đĩa bắn v ề phía tr ước v ới t ốc đ ộ 1300 food/s, tương đương với tốc độ viên đạn rời khỏi nòng súng 9  Ưu điểm kỹ thuật dùng súng bắn gen: Chuyển cho khối mơ có tổ có - gen - - chức Ưu điểm cho phép chọn loại mô triển vọng tái sinh tốt để chuyển gen Hệ thống chuyển gen toàn năng: Về nguyên tắc bắn bắt kỳ loại mơ, quan Chuyển gen cho giống trồng có giá trị Khơng áp dụng tốt cho mơ hình mà giống phổ biến như: đậu tương, lúa, ngô, khoai tây, chuối… cho phép tiến hành chuyển gen 2.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens Mục đích cơng nghệ gen thực vật tạo biến đổi gen có đặc tính Ở DNA lạ đưa vào tế bào thực vật tồn bền vững hệ gen Các vi khuẩn đất A tumefaciens số lồi họ hàng có khả chuyển phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật qua kích thích tạo khối u Những khối u không gian sống vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn tạo khối u Những opine phổ biến nopalin octopin Về hóa học opine sản phẩm ngưng tụ amino acid với cetoacid amino acid với đường Octopin tạo nên từ amino acid arginine pyruvate, nopalin tạo nên từ arginine αcetoglutaraldehyd Cơng thức cấu tạo opine trình 10 10 Agrobacterium sử dụng giới hạn cho biến nạp mầm Khi bổ sung syringon người ta biến nạp nấm A tumefaciens Thực vật mầm quan trọng ngơ biến nạp A tumefaciens + Khối u xuất gen A tumefaciens Sự phát triển khối u sau nhiễm A tumefaciens dựa tác dụng hai phytohormone Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone mã hóa chủ yếu từ gen T-DNA Sự tổng hợp auxin thực hai gen tms1 tms2 Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamid Sản phẩm gen tms2 indol-3-acetamid-hydrogenase, xúc tác để tạo auxin: indolylacetic acid Ngồi raT-DNA cịn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase Enzyme gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin isopentenyladenin isopentenyladenosin Hydroxyl hóa tiền cytokinin enzyme thực vật để tạo nên cytokinin Auxin tạo nên với cytokinin làm cho khối u lớn lên, phân chia tế bào khơng phân hóa kích thích Hình 2.2.e Câu ́ taọ cuả indol-3-acetate (m ọt auxin) zeatin (mọt cytokinin) A tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ chất nhận, mã hóa gen vùng vir Sự nhận biết chất nhận dẫn đến hoạt hóa tất gen vir Vùng vir bao gồm nhiều gen Một sản phẩm gen vir khác endonuclease nhận biết bờ phải trái T-DNA cắt T- DNA vị trí Sau đó, protein gắn vào sợi đơn T-DNA phức hệ chuyển vào thực vật tác dụng sản phẩm gen vir 14 14 Hình 2.2.f Sơ đờ biêu ̉ diên ̃ trình di chuyên ̉ T-DNA cuả Tiplasmid 1: T- DNA với bờ phải bờ trái chèn vào Tiplasmid 2: Sợi đơn cắt nhờ protein mã hóa gen virD2 3: Sợi đơn T-DNA giải phóng kết hợp với protein virD2 virE2 mã hóa, chỗ đứt sợi đơn thứ hai tổng hợp bổ sung 4: Lấp đầy chỗ trống Ti-plasmid (đường gạch nối đậm) Sợi T-DNA tự vận chuyển vào tế bào thực vật dạng phức hệ DNA-protein Quá trình phức tạp nên khơng thích hợp cho việc ứng dụng cơng nghệ gen có ba ngun nhân sau: - Việc tạo mô gen tổng hợp cytokinin auxin tái sinh từ tế bào thành hoàn chỉnh khỏe mạnh - Sự tổng hợp opine khơng mong muốn tiêu tốn lượng không cần thiết 15 15 - DNA lạ đưa vào Ti-plasmid T-DNA Những plasmid lớn 200 kb q lớn, khó thao tác phịng thí nghiệm Người ta thành cơng việc làm biến đổi Ti-plasmid T-DNA để phytohormone không tạo nên Trong bước gen tổng hợp opine cắt đưa vào gen chọn lọc, ví dụ gen kháng kanamycin Ngày nay, người ta sử dụng hệ thống gọi vector hai nguồn (binary vector), chức Ti-plasmid thực hai plasmid Plasmid lớn mang vùng vir plasmid nhỏ mang bờ trái phải T-DNA Đây vùng T-DNA cần thiết cho việc vận chuyển gen vào thực vật, plasmid nhỏ đủ cho vận chuyển xác chí với bờ Giữa bờ phải trái gen chọn lọc gen lạ chèn vào Sơ đồ cấu tạo vector hai nguồn giới thiệu hình 2.2.g Ưu điểm vector chỗ, thao tác thực với plasmid nhỏ Tất công việc tạo dịng, việc đưa DNA lạ, thực tế bào E.coli, plasmid lớn hoàn thiện chuyển vào A tumefaciens Quá trình biến nạp thực mơ thực vật phù hợp, ví dụ mơ Chúng ủ với vi khuẩn, sau vi khuẩn phải loại bỏ mơ tái sinh thành hồn chỉnh Cây Arabidopsis thaliana trở thành mơ hình quan trọng nghiên cứu di truyền thực vật Phương pháp mô tả phương pháp thấm qua, không tế bào mơ mà sử dụng Cây chưa nở hoa ngâm phần vào dung dịch A tumefaciens Sau đó, sàng lọc hệ biến nạp để xác định biến đổi gen Dĩ nhiên phương pháp thích hợp với nhỏ có chu kỳ sống ngắn có khả sản sinh lượng hạt lớn, hiệu phương pháp khơng cao 16 16 Hình 2.2.g Sơ đồ biêu ̉ diên ̃ hệ thông ́ vector hai nguôn ̀ để biên ́ nap ̣ b ăng A tumefaciens Các gen tạo khối u tổng hợp npalin loại ra, T-DNA mang gen đánh dấu để chọn lọc thực vật (SMG) Các gen khác chèn vào A t ori: Khởi đầu chép để nhân lên A tumefaciens, E c ori: Khởi đầu chép R để nhân lên E coli kan : gen kháng kanamycin để chọn lọc E.coli A tumefaciens P1, P2: Promoter, T1, T2: Terminator, vir: Vùng vir Ý nghĩa gen vir chuyển A tumefaciens -T-DNA giải thích sau: Gen virA mã hóa cho protein màng, chất nhận hợp chất phenol tế bào bị thương Sự nhận biết chất dẫn đến hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lượt lại kích thích chép biểu tất gen vir Sự hoạt hóa protein thuộc gen virG vận chuyển nhóm phosphate (photphoryl hóa) Hai protein mã hóa từ gen virD2 virE2 quan trọng 17 17 việc chuyển T-DNA Protein virD2 endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu bờ phải trái T-DNA, Protein virE2 gắn vào sợi đơn ngăn cản gắn lại với Ti-plasmid (Hình 2.2.g) Sau đó, chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn lại Ti-plasmid xuất lại T-DNA hoàn chỉnh Ngoài ra, protein virD2 gắn vào đầu 5’ T-DNA sợi đơn cắt liên kết đồng hóa trị Bằng cách xuất phức hệ DNA-protein chuyển vào tế bào thực vật Quá trình xảy chưa biết hết chi tiết, 11 protein mã hóa từ gen virB tạo nên phức lỗ, qua lỗ phức hệ DNA-protein vận chuyển vào thực vật Khi đến tế bào thực vật phức hệ phải đưa vào nhân tế bào Protein virD2 virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ qua màng nhân gắn vào DNA thực vật cách ngẫu nhiên chỗ gãy sợi DNA tế bào thực vật Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp quan sát đặc hiệu, trình tự ngắn 5-10 bp Quá trình kết hợp thực nhờ enzyme thực vật, có tham gia protein virD2 III Các trồng quan trọng phát triển Cây ngô Hiện nay, ngô biến đổi gen để mang tính trạng kháng côn trùng chống chịu thuốc diệt cỏ Dùng phôi ngô nuôi dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh hữu thụ mang gen bar biến nạp Sử dụng phương pháp bắn gen va chọn lọc thuốc diệt cỏ bialaphos cho kết mô callus phát sinh phôi biến nạp gen Các biến nạp gen hữu thụ tái sinh, ổn định di truyền biểu gen bar với hoạt tính chức enzyme phosphinothricin cetyltransferase quan sát hệ sau Gần đây, kết biến nạp gen gián tiếp ngô nhờ Agrobacterium thông báo Các thể biến nạp gen dịng ngơ lai gần (inbredline) A188 tái sinh sau đồng nuôi (cocultivation) binary vector với phôi non Tân sô biến nạp thơng báo dịng A188 khoaảng 5-30% Các 18 18 thể lai hệ thứ dòng A188 dòng lai gần khác biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số biến nạp gen độc lập/phôi) Cây lúa Chuyển gen lúa tập trung vào tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ sản xuất vitamin A Phương pháp bắn gen cho phép thực biến nạp gen hiệu lúa kiểu gen độc lập, 40 giống biến nạp gen thành công Mẫu vật sử dụng phôi non va callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành Hygromycin B marker chọn lọc thường dùng cho lúa Tần số biến nạp cao tới 50% (tính theo số biến nạp gen có nguồn gốc độc lập/số mẫu bắn gen) Gần đây, kỹ thuật biến nạp gen lúa thông qua Agrobacterium có cải tiến quan trọng có hiệu tương đương với kỹ thuật bắn gen Cây lúa sản sinh hợp chất caroteoid chuyển thành vitamin A phận có màu xanh cây, nhiên hạt gạo mà người dùng lại khơng có hợp chất Chính thiếu hụt vitamin A thường xảy nơi sử dụng gạo làm lương thực Gạo vàng TM loại ngũ cốc chuyển gen có khả nâng cao hàm lượng vitamin A bữa ăn hàng ngày Loại gạo có khả sản sinh lưu giữ chất β- carotene Nó đặt tên gạo vàng TM nội nhũ (chất bột bên hạt gạo) có màu vàng nhạt, chất β-carotene tạo Cây đậu tương Đậu tương loại trồng lâu đời trồng Trung Quốc từ năm 3.000 trước công nguyên Đây loại chứa dầu đem lại lợi ích kinh tế to lớn giới Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid khơng thay nhiều thịt, đậu tương loại trồng lương thực quan trọng nhấttrên giới Đậu tương biến đổi gen để mang tính trạng khả chống chịu 19 19 thuốc diệt cỏ có hàm lượng oleic acid cao Những cố gắng đậu tương biến nạp gen tập trung việc tái sinh từ protoplast nuôi dịch huyền phù phát sinh phơi Mặc dù có thành cơng ban đầu, tiến triển cơng việc cịn chậm việc thu hồi chuyển gen gặp nhiều khó khăn Cơng nghệ chuyển gen đậu tương có triển vọng nhờ phát triển tối ưu hóa kỹ thuật bắn gen (vi đạn) Thực tế, đậu tương dùng mơ hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loại trồng khó áp dụng cơng nghệ di truyền Kết đậu tương thu hồi thành công chuyển gen nhờ Agrobacterium Phương thức dựa vào phát sinh chồi từ mầm giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các mẩu mầm xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin có hoạt tính gusA, kháng kanamycin chống chịu glyphosate Co thể biến nạp gen hiệu vào protoplast đậu tương phương thức thơng dụng khó tái sinh Để biến nạp gen vào giống đậu tương khác người ta phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản-phương thức tái sinh độc lập (dựa sở tăng sinh cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh trụ phôi) với tăng gia tốc vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai Hàng trăm đậu tương có nguồn gốc độc lập thu kết biến nạp cho nhiều phenotype khác Nói chung, dịng đậu tương chuyển gen có nhiều gen biến nạp (số khoảng từ 1-50 thường thay đổi từ 2-10) Phân tích Southern blot hệ sau gen phức cho thấy tất tách rời, thể biến nạp sơ cấp diện kết biến nạp độc lập tái tổ hợp thơng khơng xuất thường xuyên Cây Cây loại cung cấp sợi chủ yếu, chiếm tới nửa số lượng vải sợi giới Ngoài ra, lượng nhỏ hạt bong dùng nguồn thực phẩm, thức ăn gia súc dầu ăn cho người vật nuôi Dầu hạt tinh chế trước dùng để loại bỏ chất gossypol độc hại cho người tiêu hóa động vật Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens kỹ thuật sử dụng để biến nạp gen vào giống Coker 312 20 20 (Umbeck 1987) Cây biến nạp gen giống thu hồi sau bắn gen vào dịch huyền phù nuôi phát sinh phôi (Finer va McMullen 1990) Hầu hết giống bơng có giá trị kinh tế khác tái sinh từ giai đoạn callus Một số giống tái sinh trình thiên biến dị dịng vơ tính (somaclonal variation) Phương thức phân phối gen ngồi lai trục tiếp vào mơ phân sinh trụ phôi dựa công nghệ “ACCELL” phát triển người ta đa thu hồi thành công biến nạp gen Cây cải dầu Cây cải dầu biến đổi gen với mục đích cải thiện chất lượng dinh dưỡng, đặc biệt hàm lượng chất béo hòa tan loại Cây cải dầu đựơc trồng chủ yếu vùng phía tây Canada Ontario tây bắc Thái Bình Dương, trung tâm phía bắc vùng đơng nam nước Mỹ Ngoài ra, cải dầu trồng nước khác châu Âu Australia Cây cải dầu biến đổi gen mang tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, có hàm lượng laurate oleic acid cao Khoai tây Khoai tây xem lương thực quan trọng thứ tư giới, với sản lượng hàng năm lên đến 300 triệu trồng 18 triệu hecta Hiện nay, phần ba sản lượng khoai tây giới nước phát triển Sau Liên Xơ tan rã Trung Quốc trở thành nước sản xuất 21 21 khoai tây lớn giới Ấn Độ đứng thứ tư Mặc dù sản lượng khoai tây châu Âu giảm xuống từ đầu năm 1960, bù vào sản lượng khoai tây châu Á nam Mỹ lại tăng lên sản lượng khoaitây giới ngày tăng Khoai tây biến đổi gen mang tính trạng khả kháng côn trùng kháng virus Cà chua Cà chua coi loại vườn phổ biến Cà chua thường dễ trồng số giống cho vụ mùa bội thu Chất lượng cà chua chín vượt xa tất loại khác có mặt thị trường chí mùa vụ Cây cà chua mềm thích hợp với thời tiết ấm áp nên thường trồng vào vụ hè Cà chua biến đổi gen mang tính trạng khả chịu thuốc diệt cỏ, kháng vật ký sinh làm chậm q trình chín Cây bí đỏ Bí đỏ mùa hè loại mềm hợp với khí hậu ấm áp, trồng nhiều nơi giới Bí đỏ mùa hè khác bí đỏ mùa thu mùa đơng chỗ chọn thu hoạch trước vỏ cứng chín Khơng mọc lan bí đỏ bí ngơ mùa thu mùa đơng, bí đỏ mùa hè mọc thành bụi rậm Một số khỏe có sức đề kháng tốt cho sản lượng cao Bí đỏ biến đổi gen kháng virus đặc biệt virus khảm dưa hấu (WMV) virus khảm vàng zucchini (ZYMV) 22 22 Đu đủ Đu đủ loại trồng quan trọng khu vực Đông Nam Á, dùng làm thức ăn phổ biến hộ nông dân sản xuất nhỏ gia đình họ Hiện nay, giống đu đủ chuyển gen kháng virus phát triển nước thuộc khu vực Đông Nam Á 10 Chuối Trong số loại trồng nhiệt đới, chuối ưa thích hương vị hấp dẫn Ngồi ra, chuối cịn loại trái đa dụng, người ta chế biến thành nhiều sản phẩm khác Hiện có khoảng 1.000 loại chuối khác nhau, loại trái giàu dinh dưỡng khơng có chất béo có chứa hàm lượng kali chất xơ cao, nguồn cung cấp vitamin C chống oxy hóa Chuối nghiên cứu biến đổi gen để mang tính trạng kháng virus, giun trịn nấm có khả làm chín chậm Chuối loại dự kiến dùng làm vaccine thực phẩm (edible vaccine) để phòng chống nhiều loại bệnh dịch khủng khiếp nước phát triển 11 Dừa 23 23 Sản phẩm có giá trị dầu dừa chiết xuất từ cùi dừa Hai nước sản xuất nhiều dầu dừa Indonesia Philippin với sản lượng cùi dừa khô thu năm 1999 2,91 triệu 1,37 triệu Ngồi ra, cịn có nhiều nước trồng dừa châu Á, châu Phi, nam Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, nam Mỹ vùng Caribê Chất làm cho dầu dừa trở nên hấp dẫn hàm lượng lauric acid cao Nhu cầu lượng acid lauric cao sử dụng để làm mứt, dầu ăn, mỹ phẩm, chất tẩy, bơ thực vật, dầu gội đầu xà Do vậy, giới nhu cầu dầu dừa luôn cao Ngành công nghiệp chế biến dừa bị de dọa phát triển số loại trồng biến đổi gen cho nhiều dầu, hạt cải dầu Việc nghiên cứu thúc đẩy phát triển sản xuất dầu dừa có ý nghĩa vơ quan trọng ngành cơng nghiệp chế biến dừa Tóm lại, việc áp dụng công nghệ chuyển gen thực vật vào trồng mang lại nhiều lợi ích cho nơng nghiệp, cần phát triển cơng nghệ chuyển gen IV Đánh giá an toàn sinh học chuyển gen 4.1 Cơ sở khoa học Theo dự đoán dân số nước ta tăng lên gấp đôi năm 2050 Tại châu Á, người ta hi vọng đến năm 2013 nhu cầu thực phẩm đáp ứng tốt Điều đặt thách thách lớn quốc gia Công nghệ biến đổi di truyền la chiến lược đại nhiều triển vọng xác để cao chất lượng suất lương thực theo nhu cầu xã hội cách giảm thất thoát mùa màng tăng suất giữ nguyên diện tích đất trồng trọt Tuy nhiên, sinh vật biến đổi gen đưa vào nông nghiệp với quy mơ lớn phủ nhiều nước giới có chung mối quan tâm, ảnh hưởng trước mắt hệ lâu dài việc sử dụng GMO thực phẩm cho người vật nuôi công nghiệp chế biến thực phẩm, y té bảo vệ sống Các kết luận giới khoa học mâu thuẫn đặc biệt chưa đủ thời gian để kết luận ảnh hưởng lâu dài GMO sức khoẻ người môi trường 4.2 Đánh giá chuyển gen mức đọ phịng thí nghiệm Trước hết phải khẳng định nguyên liệu tạo chuyển gen thực thông qua cá kỹ thuật sinh học phân tử mức độ phịng thí nghiệm Xác định có mặt gen tế bào chuyển gen tiến hành kĩ thuật 24 24 PCR, với cặp mồi đặc hiệu gen chuyển DNA cần kiểm tra Xá định gen chuyển gắn vào genom tái sinh hay thực phép lai phân tử mà mẫu dò đoạn gen chuyển đánh dấu huỳnh quang DNA nhân cao phân tử tách từ mô chuyển gen Xác định gen chuyển có phiên mã hay khơnng , tức có máy sinh tổng hợp protein chấp nhận hay không thực kĩ thuật lai mẫu dò đoạn DNA cua rgen đánh dấu huỳnh quang ARN toàn phần chuyển gen Và bước cuối xác định gen chuyển có biểu tạo sản phẩm cuối protein kĩ thuật lai Westerm protein chuyển gen khabgs thể đặc hiệu với protein có tinh Mặt khác, hoạt tính gen chuyển thử phép thị thị tính kháng sinh, thử tính diệt sâu, pử qui mơ phịng thí nghiệm Điểm phải xác định phương thức đặc điểm di truyền gen chuyển tính trạng gen chuyển mã hoá đồng thời kiểm tra tổ chức mức độ đồng hợp tử hệ chúng cách lai chéo hay tự phối phép thử tính kháng sinh - Tiến hàh sàng lọc chuyển gen môi trường chứa kháng sinh chọn lọc - Sàng lọc chuyển gen phản ứng PCR gen chuyển - Lai Southern mẫu DNA dò với DNA genom chuyển gen xác định số lượng chuyển genom nhận - Lai Northern mẫu dò với RNA chuyển gen - Lai Western protein chuyển gen với kháng thể đặc hiệu - Trồng cây, thu hạt nhân giống băng hạt, thử kháng sinh để đánh giá mức độ đồng hợp tử gen chuyển 4.3 An toàn sinh học Cây trồng biến đổi gen lây lan gen xuyên cho nhà máy khác - mặt lý thuyết - vi khuẩn Tùy thuộc vào gen chuyển, điều đặt mối đe dọa môi trường cách thay đổi thành phần hệ sinh thái địa phương Vì vậy, hầu hết quốc gia nghiên cứu môi trường yêu cầu trước phê duyệt nhà máy GM cho mục đích thương mại, kế hoạch giám sát phải trình bày để xác định hiệu tiềm khơng dự đốn trước phê duyệt Ít nghiên cứu tiến hành sức khỏe người động vật Tuy nhiên, hầu hết quốc gia tất trồng GM thử nghiệm việc nuôi thử nghiệm để chứng minh an tồn nó, trước phê chuẩn để sử dụng tiếp thị Dự án biến đổi gen-An tồn thu thập trình bày an tồn sinh học nghiên cứu GMOs với thơng tin sâu chủ đề Tác động tiềm hệ sinh thái gần mối quan tâm lớn liên quan đến trồng chuyển gen Gen có khả tác động sinh thái quan trọng nhà máy làm tăng tần số tồn quần thể tự nhiên Những mối quan tâm tương tự người xung quanh giống trồng thông thường nuôi Một số 25 25 yếu tố nguy cần xem xét: -Cây trồng biến đổi gen truyền gen loài hoang dã địa phương, màu mỡ? -Liệu việc giới thiệu gen chuyển trao lợi lựa chọn cho nhà máy xe hybrid tự nhiên? Nhiều loài thực vật hóa giao phối hybridise với họ hàng hoang dã trồng gần, gen điều trồng, sau thơng qua để lai Điều áp dụng trồng chuyển gen nhân giống thông thường, hai trường hợp có gen thuận lợi có hậu tiêu cực cho hệ sinh thái phát hành Điều bình thường khơng phải mối quan tâm đáng kể, bất chấp lo ngại động vật hoang dã địa phương superweeds đột biến overgrowing: nhà máy lai xa từ phổ biến, nhiều trường hợp xe hybrid không màu mỡ để thể bội , không nhân kéo dài lâu sau gốc nước nhà máy lấy từ môi trường Tuy nhiên, điều không phủ nhận khả tác động tiêu cực Trong số trường hợp, phấn hoa từ nhà máy nước di chuyển nhiều dặm gió trước thụ tinh nhà máy khác Điều làm cho khó khăn để đánh giá thiệt hại tiềm việc lai tạp, nhiều giống lai có liên quan xa từ trang web thử nghiệm Trong số giải pháp nghiên cứu cho mối quan tâm hệ thống thiết kế để ngăn chặn chuyển gen, chẳng hạn Terminator Công nghệ , biến đổi di truyền lục lạp chỉ, để có hạt giống chuyển gen mang gen chuyển Đối với trước đây, có số tranh cãi cơng nghệ khơng cơng buộc lệ thuộc vào sản xuất giống hợp lệ trường hợp nông dân nghèo, sau khơng có mối quan tâm vậy, có hạn chế kỹ thuật mà cần phải khắc phục Giải pháp phát triển EU tài trợ chương trình nghiên cứu nhưCo-bổ sung Transcontainer Có ba đường lai dẫn đến thoát gen chuyển: -Lai giống với trồng khơng biến đổi gen lồi đa dạng -Lai tạo với thực vật hoang dã loài -Lai tạo với thực vật hoang dã loài liên quan chặt chẽ, thường chi Tuy nhiên, có số yếu tố mà phải có mặt cho lai tạo -Các loại trồng biến đổi gen phải đóng đủ để loài hoang dã cho phấn hoa để đạt hoang dại -Các loài thực vật hoang dã biến đổi gen phải hoa lúc -Các loài thực vật hoang dã biến đổi gen phải di truyền tương 26 26 thích Để tồn tại, đứa lai: -Phải có khả thi, màu mỡ Phải mang gen chuyển Nghiên cứu cho thấy lối có trồng biến đổi gen thông qua lai tạo với thực vật hoang dã lồi có liên quan 1-Nó biết đến số trồng tìm thấy để lai với cá hoang dã 2-Điều hiểu phần di truyền học dân số, lây lan gen chuyển quần thể hoang dã trực tiếp liên quan đến phòng tập thể dục ảnh hưởng gen ngồi với tốc độ dịng chảy gen để dân số Gen thuận lợi lan truyền nhanh chóng, gen trung tính lây lan trôi dạt di truyền , gen bất lợi lây lan có dịng chảy liên tục 3-Các tác động sinh thái gen đến, thường chấp nhận gen có nâng cao thể lực liên quan đến vô sinh yếu tố cung cấp cho nhà máy lai lợi đủ để trở thành cỏ dại xâm lấn Các yếu tố bất lợi vô sinh phận hệ sinh thái không cịn sống, chẳng hạn khí hậu, muối hàm lượng khống chất, nhiệt độ.Phịng tập thể dục cải thiện gen liên quan đến yếu tố sinh học làm nhiễu loạn cân (đôi mong manh) hệ sinh thái Ví dụ, thực vật hoang dã nhận gen kháng sâu bệnh từ trồng biến đổi gen trở nên đề kháng với sâu bệnh tự nhiên nó, nói rằng, bọ cánh cứng Điều cho phép nhà máy để tăng tần số, loài động vật thời điểm lên cao chuỗi thức ăn, có phần phụ thuộc vào bọ cánh cứng nguồn thực phẩm, giảm phong phú Tuy nhiên, hậu xác gen chuyển với lợi chọn lọc môi trường tự nhiên gần dự đốn đáng tin cậy Nó quan trọng để hành động địi hỏi phủ nước phát triển xây dựng thập kỷ qua V Tài liệu tham khảo www.ncbi.nlm.nih.gov www.tailieu.vn/ chuyển gen vào thực vật www.sinhhocvietnam.com www.ebook.edu.vn www.thuviensinhhoc.com/cây trồng biến đổi gen Sách Nhập môn Công nghệ Sinh học/ Thầy Phạm Thành Hổ Kỹ thuật chuyển gen thực vật ứng dụng, Thúy Hồng www.ebi.ac.uk/embl 9.www.đbj.nig.ac.jp 27 27 28 28 ... lọc chuyển gen phản ứng PCR gen chuyển - Lai Southern mẫu DNA dò với DNA genom chuyển gen xác định số lượng chuyển genom nhận - Lai Northern mẫu dò với RNA chuyển gen - Lai Western protein chuyển. .. TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN CÂY TRỒNG 2.1 Lựa chọn đối tượng trồng chuyển gen Trên giới người ta tập trung chọn đối tượng có tính khả thi cao để tiến hành tạo trồng chuyển gen theo tiêu chí... hiệu gen chuyển DNA cần kiểm tra Xá định gen chuyển gắn vào genom tái sinh hay thực phép lai phân tử mà mẫu dò đoạn gen chuyển đánh dấu huỳnh quang DNA nhân cao phân tử tách từ mô chuyển gen Xác