CNSH TP final docx

Trần Văn Chí 5• Nuôi cấy mô, tế bào thực vật Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả những phương pháp nuôi cấy các nguyên liệu tế bào, mô, phôi trên môi trường dinh

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC PHẨM

CHƯƠNG 1

VAI TRÒ, Ý NGHĨA CỦA CÔNG NGHỆ SINH

HỌC ĐỐI VỚI NGÀNH CÔNG NGHIỆP

THỰC PHẨM

- Công nghệ di truyền thực vật: Là công nghệ sử

dụng các kỹ thuật hiện đại thực hiện trên tế bào và axit nuclêic để nghiên cứu cấu trúc và điều chỉnh

về biến đổi gen mong muốn vào tế bào nhằm tạo

ra các cơ thể thực vật mang những đặc tính mới

Trần Văn Chí 5

• Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất

cả những phương pháp nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô,

phôi) trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong đ/k vô trùng

Nuôi cấy mô, tế bào gồm nuôi cấy cây non, cây trưởng thành, nuôi cấy các bộ phận cơ quan như rễ, thân, lá, hoa, bao phấn, noãn chưa thụ tinh,… nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn bội và nuôi cấy tế bào trần.

1.1 Cải thiện và nhân nhanh giống cây trồng

a Nhân giống vô tính in vitro

Là kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng cách sử

dụng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật, có kích thước nhỏ và sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

- Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh

- Chọn dòng tế bào kháng các độc tố

- Chọn dòng tế bào sản xuất dư thừa các loại sản

phẩm chủ yếu là amino acid

- Chọn dòng tế bào mang các đặc điểm chỉ thị để

Trần Văn Chí 9

• Sản xuất cây đơn bội in vitro

Mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di

truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối

• Với các thể đơn bội của thực vật bậc cao người ta có thể sử

dụng vào các mục đích:

- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

- Tạo đột biến ở mức độ đơn bội

- Tạo dạng đồng hợp tử tuyệt đối (dòng thuần)

Trần Văn Chí 11

-

- Phương pháp nhân giống vô tính in vitro

+ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chóp rễ

Trần Văn Chí 13

+ Nuôi cấy bầu noãn chưa thụ tinh hoặc bao phấn

+ Nuôi cấy phôi nhằm mục đích cứu phôi khi lai xa

Trần Văn Chí 15

- Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh thành cây mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) sau đó mô sẹo được tái sinh thành cây hoàn chỉnh

+ Nuôi cấy tế bào.

Trần Văn Chí 17

• Một số phương pháp để tạo thể đơn bội

Trần Văn Chí 19

- Dung hợp protoplast hay lai vô tính tế bào thực vật

Kỹ thuật dung hợp protoplast

cho phép khắc phục được

hiện tượng bất thụ thường

xảy ra khi lai khác loài (lai

xa) để mở rộng nguồn gen,

tạo ra các giống cây trồng

mới mang các đặc tính di

truyền ưu việt

Dung hợp protoplast A: các protoplast B: hai protoplast dung hợp trong một cặp C: các

protoplast có thể dung hợp trong thể 3 hoặc nhiều hơn

+ Dung hợp protoplast bằng hóa chất

Phương pháp này dùng NaNO3 hoặc

polyethylene glycol (PEG) để kích thích sự

dung hợp của hai protoplast

Trần Văn Chí 21

+ Dung hợp protoplast bằng điện (electrofusion)

 Ưu điểm: không gây độc cho tế bào đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp

bằng hóa chất

Trần Văn Chí 23

• Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

Có hai nhóm phương pháp chính:

- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn

- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

2 Kỹ thuật chuyển gen

2.1 Chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium là nhóm vi khuẩn đất, gram (-),

gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương

A.tumefaciens gây bệnh u thân cây A.shizogenes gây bệnh tóc rễ cây

Trần Văn Chí 25

Phương pháp chuyển gen thông qua

Gen quan tâm

Trần Văn Chí 27

Bổ sung các trình tự DNA để điều

khiển biểu hiện của gen

 Promoter khởi đầu quá trình dịch mã; tác động đến việc biểu hiện ra các sản phẩm của gen vào khi

nào, ở đâu và như thế nào.

 Các trình tự kết thúc đánh dấu sự kết thúc của

gen.

kết thúc Trình tự

mang mã

Promoter: Thường sử dụng CaMV 35S promoter có nguồn gốc từ virus khảm súp lơ Đây là promoter cơ định

(điều khiển biểu hiện gen mạnh mọi lúc và ở mọi mô).

Trần Văn Chí 31

Sàng lọc các mô chuyển gen

Sau quá trình chuyển gen, các mô thực vật được chuyển sang môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ, tùy thuộc vào chỉ thị đã sử dụng Chỉ có thực vật biểu hiện gen chỉ thị này mới sống sót

Trần Văn Chí 33

Tái sinh cây. Để có được một cây hoàn chỉnh,

các mô chuyển gen cần

được nuôi cấy trong những

điều kiện môi trường có

kiểm soát với các nguồn

dinh dưỡng và hormone

đặc biệt Quy trình này

được gọi là nuôi cấy mô

Khi cây đã được tái sinh và

tạo hạt thì bắt đầu tiến

hành đánh giá thế hệ con

cháu

Trần Văn Chí 35

2.2 Chuyển gen trực tiếp

2.2.1 Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Được đề xuất đầu tiên vào năm 1987

Nguyên lý: Sử dụng các viên đạn có kích thước nhỏ, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp ADN tiếp cận bộ máy di truyền của tế bào

Trần Văn Chí 39

Trần Văn Chí 41

Trần Văn Chí 43

2.3 Những thành tựu, triển vọng và xu hướng phát triển

Những mốc quan trọng trong sự phát triển kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

1980, Lần đầu tiên thực hiện chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium

1983, Tạo các chỉ thị chọn lọc như kháng sinh, chỉ thị màu sắc Thiết kế kại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài các gen mong muốn vào)

1984, Thực hiện chuyển gen gián tiếp và trực tiếp vào tế bào trần

1985, Tạo các giống cây trồng kháng thuốc virus, đưa cây trồng biến đổi gen ra thực địa

1987, Chuyển gen kháng sâu bằng súng bắn gen

1988, tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm

1990, chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy

vô tính

1992, chuyển gen cho lúa mì

1994, thương mại hóa cà chua chuyển gen

1999, chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin A cao

Từ năm 2000 đến nay diện tích cây trồng biến đổi gen

Trần Văn Chí 45

Trần Văn Chí 47

Cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Gần hai phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia

phát triển như Hoa Kỳ, Canada,

Australia, Tây Ban Nha và hơn

một phần ba diện tích đất canh

tác thuộc các quốc gia đang phát

triển như Trung Quốc, Ấn Độ,

Philippines (châu Á); Argentina,

Brazil, Mexico, Uruguay,

Paraguay (Mỹ Latin) và Nam Phi

Trần Văn Chí 49

Đậu tương

Ngô

Bông

Cải dầu

Diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen

toàn cầu, 1996 – 2005: tính theo cây

Trần Văn Chí 51

Những hướng chính trong tạo giống cây trồng biến đổi gen

- Chuyển gen kháng sâu: Chuyển gen cry kháng sâu

của Bacillus thuringiensis (Bt) Thành công trên đậu tương,

bông, ngô, ….

- Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ: Chuyển gen sản xuất 5 – enolopyruvyl – shikimate – 3 – phosphatase

(EPSP), một ezyme bị ức chế bởi thuốc diệt cỏ

glyophosate Nghĩa là nếu cây sản xuất được nhiều enzym EPSP chúng có thể chống chịu được thuốc diệt cỏ

glyophosate

Thành công trên đậu tương, ngô, bông, cải dầu, …

Cải dầu chuyển gen

kháng thuốc diệt cỏ

Trần Văn Chí 55

- Sản xuất vacxin thực phẩm (edible vaccine)

Nguyên lý: Chuyển gen kháng nguyên vào thực vật, sau đó thực vật sẽ tổng hợp kháng nguyên Khi kháng

nguyên đi vào cơ thể động vật qua đường tiêu hóa (dạng tươi sống nếu không sẽ bị mất hoạt tính) sẽ kích thíc sinh miễn dịch

Ưu điểm: Rẻ, ổn định, dễ bảo quản, không cần tinh sạch,

Kết quả bước đầu: vacxin chống bệnh infectious bursan disease virus (IBDV) trên gà trong cây Arabidopsis Vacxin viêm gan B trên cây chuối,

Trần Văn Chí 57

+ Chuyển gen vào cây trồng

Một số cây trồng chuyển gen A: ngô kháng côn trùng B: lúa mạch kháng virus C:

cà chua cho quả chín muộn D: khoai tây chống chịu chất diệt cỏ

Trần Văn Chí 59

1.2 Chăn nuôi và thú y

1.2.1 Kỹ thuật cấy chuyển phôi

• Được ứng dụng rộng rãi để cấy chuyển hợp tử ở bò

• Nguyên lý:

• Mục đích: + Tuyển chọn những đặc điểm có lợi của

vật nuôi + Tạo sinh đôi, ba…hoàn toàn giống nhau

về mặt di truyền + Xác định giới tính của vật nuôi

1.2.2 Tạo chế phẩm phòng tránh bệnh cho động vật

 Vaccine ribosome

 Vaccine các mảnh của virus

 Vaccine kỹ thuật gen….

2 Công nghệ sinh học góp phần nâng cao

hiệu suất chế biến thực phẩm

 Khoảng 15% thực phẩm trên thế giới được sản xuất bằng các quy trình công nghệ sinh học

 2.1 Sự chuyển hóa sinh học

 2.2 Sản xuất acid hữu cơ thực phẩm

2.3 Sản xuất acid amin

Trần Văn Chí 63

3 Công nghệ sinh học tạo ra những sản phẩm có chất

lượng cao từ các nguyên liệu tận dụng

 Công nghệ sinh học góp phần nâng cao hiệu suất chế biến thực phẩm

 Công nghệ sinh học làm đa dạng

mẫu mã sản phẩm tạo ra sản phẩm

có chất lượng cao, giá thành hạ

 Công nghệ sinh học tạo ra những

Trần Văn Chí 65

CHƯƠNG 2

ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT

THỰC PHẨM

I CN sản xuất rượu bia, nước giải khát

Trần Văn Chí 69

1.1.1 Quá trình sản xuất rượu trắng (etylic)

 Rượu trắng được sản xuất theo 2 pp chính:

 Sau quá trình lên men, dịch thu được gồm các thành phần sau:

+ Sinh khối nấm men

+ Rượu etylic

+ Khí Cacbonic

+ Glycerin

+ Aldehyt

Trần Văn Chớ 71

 Sơ đồ quy trỡnh sản xuất

Nguyên liệu

Nấu nguyên liệu

ờng hoá dịch

Đường hoá dịch cháo

Lên men dịch đ ờng

Ch ng cất và tinh chế cồn

etylic Thành phẩm

 Nguyên liệu:

- Nguyên liệu có sẵn đường: rỉ đường

- Nguyên liệu có tinh bột: bắp, khoai mì, khoai lang, bột gạo

- Nguyên liệu có cellulose: gỗ vụn, mạt

Trần Văn Chí 73

- Đường hoá bằng bánh men thường hay bánh men thuốc bắc

 Dùng bánh men để đường hoá tinh bột dễ

bị nhiễm tạp khuẩn Quá trình lên men tạo nhiều sản phẩm trung gian, hiệu suất thu hồi thấp.

 Phương pháp maltase:

+ Thời gian hồ hóa ngắn

+ Chất lượng rượu không bị ảnh hưởng mà còn tạo hương vị đặc trưng dễ chịu

+ Ít bị tạp khuẩn

- Hiệu suất đường hóa không cao

- Áp dụng cho những nước trồng được đại mạch

Trần Văn Chí 75

 Phương pháp myco – malt : Sử dụng enzym của vi sinh vật (nấm mốc) – malt

+ Chủng nấm mốc: Asp oryzae, Asp flavus, Asp awamori

 Các chủng nấm mốc được sử dụng để đường hoá tinh bột được nuôi cấy theo hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm

CÔNG NGHỆ ĐƯỜNG HÓA

Trần Văn Chí 77

• Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa

- Nhiệt độ: 35-62 0 C ( khoảng nhiệt độ tối thích của enzym amylaza).

- pH: 4-5 (dưới 2 trên 10 amylaza sẽ ngừng hoạt động)

- Nồng độ enzym: tốc độ thủy phân tinh bột sẽ tăng và tỷ lệ

thuận với lượng enzym

- Nồng độ rượu: nồng độ rượu >6% thì có ảnh hưởng rõ rệt làm

giảm hoạt tính của enzym.

- Thời gian đường hóa : 20 – 40 phút

 Nguyên tắc chung:

+ Làm lạnh dịch cháo tới nhiệt độ đường hóa

+ Cho chế phẩm amylaza vào dịch cháo và giữ ở nhiệt độ trên trong thời gian xác định để amylaza chuyển hóa tinh bột thành đường

Trần Văn Chí 79

• Đường hóa gián đoạn

Thùng đường hóa gián đoạn

II.2.2 Đường hóa liên tục

1 Lên men bề mặt

1.1 Khái niệm: Là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề

mặt môi trường dịch thể hoặc bán rắn

1.2 Nuôi cấy trên môi trường dịch thể: dùng cho nuôi

cấy vi sinh vật hiếu khi

Môi trường được pha loãng với nồng độ: 1-10%, có bổ sung nguồn nitrogen (N) và khoáng chất.

Yêu cầu chung: bề mặt thoáng, rộng

Ưu điểm: + Đơn giản dễ làm

Nhược điểm: - Đòi hỏi diện tích sử dụng lớn

- Khó tự động hóa

- Dễ bị tạp nhiễm

- Tốn nhiều công lao động

- Hiệu quả kinh tế thấp.

Trần Văn Chí 83

*Yêu cầu:

+ Phải xử lý n/liệu khi đem nuôi cấy: thủy phân, khử trùng, … + Đối với vsv hiếu khí phải thổi khí vô trùng trong quá trình lm + Độ ẩm của môi trường; 60 -70%, độ ẩm không khí 90-100%

* Lĩnh vực áp dụng:

 + Sản xuất chất kháng sinh dùng trong chăn nuôi

 + Sản xuất enzym từ nấm mốc

 + Làm tường

 + Sản xuất vitamin….

Trần Văn Chí 85

2 Lên men chìm:

2.1 Khái niệm: Là pp nuôi cấy vsv trong mt dịch thể và chúng sẽ phát triển theo chiều đứng của cột mt.

+ PP này có thể áp dụng để nuôi cấy vsv h/khí, kỵ khí và bán h/k

Quy trình lên men: Chế tao môi trường

Khử trùng môi trường

Trần Văn Chí 87

2.1 Thực hiện khuấy đảo và sục khí:

Mục đích tăng khả năng tiếp xúc giữu tế bào và mt dinh dưỡng, đồng thời ngăn cản sự kết lắng của tb.

Đối với vsv hiếu khí

người ta còn lắp thêm

thiết bị sục khí vô trùng

để cung cấp cho vsv

phát triển

2.2 theo dõi sự tạo bọt và biện pháp phá bọt

Bọt gây nhiễm tạp mt lên men, ngoài ra bọt khí còn cản trở sự tiếp xúc giữa VSV và mt dinh dưỡng

Để phá bọt người ta thường dùng các chất tự nhiên như: dầu

Nguyên nhân tạo bọt

Trần Văn Chí 89

2.3 Điều chỉnh pH

Người ta có thể điều chỉnh pH môi trường trong

quá trình lên men bằng các dung dịch NaOH, HCl, NH4OH, ure, hay bổ sung dịch đệm photphate , nhưng vẫn phải đảm bảo điều kiện vô trùng

2.4 Theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ môi trường lên men

Nguyên nhân thay đổi nhiệt độ

Biện pháp khắc phục:

+ sử dụng nồi lên men hai lớp vỏ

*Ưu điểm của lên men chìm:

+ Tiết kiệm diện tích + Dễ cơ giới hóa, tự động hóa + Hạn chế được tạp nhiễm

*Nhược điểm:

- Chi phí cao cho trang thiết bị

Trần Văn Chí 93

1 Trục khuấy

2 không khí đi ra

3 Nắp phía trên với kính nhìn

4 Tấm thép giúp gia, giảm nhiệt

5 Lớp nước để làm nguội,làm nóng

6 Nơi đo pH và nồng độ O2

7 Nơi đo và điều chỉnh nhiệt độ

8 Van lấy mẫu

9 Cánh khuấy

10 Van xả dung dịch sau lên men

11 Van điều chỉnh hơi nước để khử trùng

Trần Văn Chí 95

3 Thu hồi rượu

Bã rượu

Hơi

Giấm Nước

1 1

Nước thải Hơi

7 Cồn đầu

Sơ đồ chưng luyện bán liên tục

1.Thùng cất thô; 2.Thùng ngưng tụ cồn thô; 3.Thùng tạm chứa cồn thô; 4.Tháp tinh chế; 5.Bình ngưng tụ; 6.Bình ngưng tụ; 7.Bình làm lạnh; 8.Bình làm lạnh.

Cồn sản phẩm

Bã rượu

Đến tháp làm sạch

Nước thải

4 Sản xuất rượu vang

4.1 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang quả

+ Rượu ethanol: 10 -15%

+ Đường: 63 – 132 g/l (fructoza, glucoza)

+ Acid vô cơ, hữu cơ: acid malic, acid citric, acid oxalic….

(4 – 7 g/lít (quy ra acid malic) + Độ pH của rượu vang = 2,9 – 3,9

+ Khoáng: P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu, Mn,…1,53 g/lít

+ vitamin:B1, B2, PP, H….

+ glyxerin

+ polyphenol

Vitamin Nước nho

Rượu vang

Trắng lên men không xác quả Đỏ lên men có xác quả

Ủ chín Làm trong Đóng chai Kiểm tra

Sản phẩm

4.3 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu

 Nguyên liệu thích hợp nhất là nho:

(1 ha nho có thể cho 2-3 vạn lít nước quả)

• Xử lý trong sản xuất nhỏ: dã dập bằng cối sành, đá… dùng vải vắt, lọc

• Xử lý trong công nghiệp: Ép lọc bằng máy trong phòng chứa

Trần Văn Chí 105

Trần Văn Chí 107

 Hàm lượng đường

 Nhiệt độ: 20-30 độ C

 Oxy: cần GĐ đầu, ko cần GĐ sau

 Thể tích nồi lên men: trống 1/3 – 1/5

• Các giai đoạn lên men rượu vang

 Giai đoạn hnhg thành rượu: Tính từ khi cấy giống đến khi dịch lên men sủi bọt mạnh nhất (kéo dài 4-5 ngày)  tạo rượu non

 Giai đoạn phát triển: Rượu non tiếp tục được lên

Trần Văn Chí 109

 Giai đoạn vang chín:

+ Nút chai, bình đựng+ Hạ thổ (50-60 cm)

 Vị rượu cân đối: vị đắng của CO2 và glyxerin bị át

Trần Văn Chí 111

 Louis Pasteur (1822-1895) đã thành công trong việc chứng minh sự lên men bia không phải chỉ là phản ứng hóa học, mà còn có sự tham gia của các sinh vật cực nhỏ sống kỵ khí, đó chính là men bia Những

phản ứng lên men rượu từ đường cần phải có sự xúc tác của các enzyme

Trần Văn Chí 113

5.2 Phân loại bia

 Theo màu sắc: màu nhạt, màu đen và mầu sẫm

 Theo tiêu chuẩn thành phẩm đã sát khuẩn hay chưa:

 Bia tươi: Hương vị thơm ngon nhưng chỉ giữ được 7 ngày

 Bia chai: Kém hượng vị hơn nhưng giữ được thời

gian 60-120 ngày

5.3 Nguyên liệu sản xuất bia

 Lúa mạch

Người ta chọn lúa mạch vì hàm lượng bột đường

cao, vỏ trấu không bị tróc ra sau khi nảy mầm Trước khi đưa vào nhà máy sản xuất bia, lúa mạch

đã được nảy mầm và sấy khô Hạt lúa được sấy khô

ở nhiệt độ từ 80 đến 85 °C trong giai đoạn này