KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THIẾT KỄ CẤU TRÚC CHỈNH SỦA GEN OsSWEET LIÊN QUAN BẼN BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA TBRB25 Trần Lan Đài1, Phùng Thị Thu Hương1 2, Cao Lệ Quyên2, Nguyễn Văn Cửu2, Nguyễn Thị Thu Hà2, Phạm Xuân Hội2, Nguyễn Duy Phương2, * TÓM TẮT Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae^v oryzae (Xoo) gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất lúa gạo nhiều quốc gia châu Á châu Phi Trong trình xâm nhiễm vào chủ, Xoo tiết protein đặc biệt 'AL (Transcription activator like effector); protein liên kết vói yếu tố cis đặc trưng vùng promo :er hoạt hóa biểu số gen hệ gen chủ để phục vụ cho trinh sinh trưởng láy nhiễm vi khuẩn Trong nghiên cứu này, nghiên cứu TALome isolate (chủng phân lập) Xoo đại diện Việt Nam Isolate vxo_ll mang gen /a/mã hóa protein AvrXa7 PthXo2B; Ihi VXO_60 VXO_96 mang gen mã hóa TAL AvrXa7 PthXo2A Bốn trình tự crRNA (CRISPR RNA) đặc hiệu cho vị trí DNA liên kết vói TAL AvrXa7 PthXo2A promoter 0sSWEET13 OsSWEET14(ủa giống lúaTBR225 thiết kế bàng công cụ tin sinh Các crRNA đưọc ghép nối vào vị trí 2?ộZI Bsãl vector trung gian pENTR4; toàn cấu trúc biểu sgRNA đưọc chuyển vào vector pCas9 để tạo cấu trúc T-DNA biểu phức hệ CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) hoàn chỉnh gây đột biến đồng thời hai promoter 0sSWEET13 0sSWEET14 lúa TBR225 Đây sê tiền đề cho việc tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc phổ rộng công nghệ CRIPSR/Cas9 Từ khóa: Bạc lá, CRISPR/Cas9, SWEET, TAL, Xanthomonas oryzae pv oryzae ĐẶT VÂNĐÉ TAL effector đưcc tạo từ vi khuẩn gây bệnh thực vật thuộc chi Xanthomonas có Xoo vũ khí phân tử tiêm vào tế bào nhân thực làm thay đổi trình phiên mã chủ Sau vào chủ, TAL effector định vị nhân tế bào liên kết với trinh tự promoter gen nhiễm "S" (subceptibillity) hoạt hóa biểu chúng, tạo điều kiện cho nhân lên vi khuẩn [3], Nhiều ng;hiên cứu chứng minh đột biến xuất vị trí EBE (effector-binding element) vùng promoter gen giúp lúa chống lại xàm nhiễm chủng Xoo tương ứng [6, 9,10, 20], Đa số TAL elector chủng Xoo cơng vào ba thành viên thuộc họ gen mã hóa protein vận chuyển đường SWEET (Sucrose-efllux transporter) [1, 16] Các gen OsSWEETll OsSỈ TET13 gen s quần thể Xoo châu Á mang protein TAL PthXol PthXo2 [20], Tương tự, chủng Xoo châu Á mang protein '('rường Đại học Quy NLơn Viện Di truyền Nông ngiiệp Emai: phuongnd.bio@grtiail.com TAL AvrXa7 PthXo3 chủng châu Phi mang protein TAL TalC Tal5 công vào EBE tương ứng nằm promoter 0sSWEET14 [10, 1] Như vậy, phân tích TALome chủng vi khuẩn Xoo giúp xác định EBE tương ứng nằm promoter gen S; từ thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen nhằm tăng cường tính kháng bệnh bạc cho trồng Hệ thống CRISPR/Cas9 công cụ chỉnh sửa hệ gen hữu hiệu Cơ chế hoạt động CRISPR/Cas9 trình sgRNA (single guide RNA) điều tiết endonuclease Cas9 cắt đặc hiệu DNA sọi đôi, từ hoạt hóa hệ thống sửa chữa đứt gãy mạch đơi (Double-Strand Break-DSB) vốn có tế bào [4], tạo đột biến vị trí mong muốn hệ gen Do đó, cơng nghệ phù họp vói nghiên cứu cải tiến tính kháng bệnh bạc cho giống lúa nhạy cảm với bệnh bạc thơng qua việc chỉnh sửa trình tự EBE gen s Nghiên cứu tiến hành phân tích TALome số chủng Xoo đại diện Việt Nam để xác định xác trình tự EBE gen s hệ gen giống lúa TBR225 thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9 nhận biết EBE Kết nghiên cứu tiền đề NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NỊNG THƠN - KỲ - THÁNG 6/2022 11 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ cho nghiên cứu chế gây bệnh mức phân tử Xoo lúa TBR225, từ hướng tới mục tiêu tạo giống lúa TBR225 cải tiến kháng bệnh bạc phổ rộng Các chủng vi khuẩn Xoo Bộ môn Bệnh học phân tử (Viện Di truyền Nông nghiệp) thu thập tỉnh/thành, giai đoạn khác nhau, lưu giữ cung cấp [17] VẬT UỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cuu 2.1 Vật liệu nghiên cứu STT Bảng Danh sách chủng Xoo đại diện sử dụng nghiên cứu Mức độ hoạt hóa gen Tên Năm thu thập Địa điểm thu thập OsSWEET13 OsSWEET14 4-4vxo_ll Hà Nội 2013 +4+ VXOJ50 Nghệ An 2017 ++ 4-4VXO_96 2016 Hải Phòng Vector pENTR4-vl, pENTR4-v2 pCas9 nhóm nghiên cứu tiến sĩ Sebastien Cunnac (Trung tâm Nghiên cứu vi phát triển - Montpellier, Pháp) cung cấp, thiết kế dựa khung vector pCAMBIA1300 (Marker Gene Technologies, Hoa Kỳ) pENTR4 (Invitrogen, Hoa Kỳ) Các oligonucleotide dùng cho PCR thiết kế đặt mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Giải trình tựgen tal vi khuẩn Xoo Một khuẩn lạc cấy ria môi trường PSA 28°c 48 DNA tổng số tách chiết từ vi khuẩn Xoo kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega) Mẫu DNA vi khuẩn Xoo gửi giải trình tự phân tích Trung tâm Nghiên cứu phát triển (Montpellier, Pháp) Trinh tự đích protein TAL dự đốn cơng cụ Tal-vez v.3.1 2.2.2 Thiết kế trình tựgRNA Trình tự crRNA đặc hiệu cho promoter 0sSWEET13 OsSWEETU lúa TBR225 (gọi tắt SW13-TBR SW14-TBR) thiết kế phần mềm CRISPR-P v2.0 (http://crispr.hzau edu.cn) cấu trúc bậc II crRNA phàn tích phần mềm Mfold 2.3 (http://unafold ma.albany.edu) Các trình tự DNA tương đồng với gRNA hệ gen lúa xác định phần mềm CCTop (https://cctop.cos.uni-heidelberg) Trinh tự hệ gen lúa tham chiếu từ sở liệu ngân hàng gen Ensemble Plants (http://plants ensemble.org) Các trình tự gRNA đặc hiệu lựa chọn dựa vị trí cắt DNA Cas9 promoter đích, hàm lượng GC, có mặt Guanine đầu 5’, khả hình thành trì cấu trúc bậc II ổn định, số lượng trí trí đoạn DNA tương đồng xuất hệ gen lúa [12] 12 2.2.3 Thiết kế T-DNA mang cấu trúc biểu sgRNA chỉnh sửa đa gen gRNAl-SW13 & gRNA2-SW13 gRNAl-SW14 & gRNA2-SW14 chèn vào vị trí enzyme A/gZI Bsa\ nằm sau vùng promoter U6 pENTR4-vl pENTR4-v2 nhờT4 DNA ligase để tạo vector tái tổ họp pEN/gRNA-SW13 pEN/gRNASW14 Tiếp theo, hai vector tái tổ họp xử lý đồng thời Noă/Xhoỉ; hai cấu trúc biểu sgRNA chỉnh sửa EBE PthXo2A (JU6:gRNA-SW13j) ghép vào vector pEN/gRNA-SW14 mạch thẳng để tạo thành vector tái tổ họp pEN/gRNASW13::SW14 (Hình 1) Hình Sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNASW13::SW14 Ghi chú: (crRNA) CRISPR RNA; (tracrRNA) trans-activating crRNA; (attRl, attR2, attLl attL2): trình tự nhận biết LR clonase; (U6): promoter U6; (TER): vùng kết thúc phiên mã; (Ubiquitin): promoter Ubiquitin; (NOS): vùng kết thúc phiên mã NOS; (ccdB): gen độc gây chết tê bào vi khuẩn (control of cell death B gene); (cmR): gen kháng kháng sinh Chloramphenicol (Chloramphenicol resistance protein); (Cas9): trình tự mã hóa protein Cas9; (RB): bờphải (right border); (LB): bờ trái (left border) NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 6/2022 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Đoạn trình tự chứa cấu trúc biểu sgRNA chỉnh sửa EBE AvrXa7 PthXo2A (JU6:gRNASW13:SW14J) ghép nối pUbi/Cas9 hệ thống Gateway (Invitrogen, Hoa Kỳ) (Hình l) Vector tái tổ họp pCas9/gRNA-SWl3::SWl4 kiểm tra PCR với cặp mồi Ubi-F/Cas9-t-R (5CCCTGCCITCATACGCTATT-3 ’ 5’- GCCTCGGCTG TCTCGCCA-3’; nhân đoạn DNA 0,36 bp); gRNAlSWl3Fw/gRNA2-SW: ,3-Rv (5’-TGTTGAGTTGTGGT GCTTTTATAT-3’ 5’- GTGTGAGAGGAACGAAG GGAGTTG-3’; nhân bằn đoạn DNA 0,44 bp), gRNAl- SWl4-Fw/gRNA2-SWl4 -Rv (5’-TGTTGCTT AGCAC CTGGTTGGAGG-3’ 5’- AAACGGTTGGAGGGGT TTATATAC-3’; nhân đoạn DNA 0,44 bp) giải trình tự DNA KẾT QUÀ NGHIÊN cuu 3.1 Nghiên cứu TALome vi khuẩn Xoo đại diện Việt Nam ®®a> vxo_11 GSS) VXO_60 VXO_96 - SW14-TBR Kết giải mã trình tự axit amin suy biến xác định isolate vxo_ll mang hai gen ía/mã hóa hai protein TAL liên kết vói hai EBE biết AvrXa7 (Hình 2) PthXo2B (Hình 3) [14], Trong đó, VXO_60 VXO_96 có hai gen tal mã hóa protein TAL liên kết vói EBE AvrXa7và PthXo2A Kết cho thấy isolate vxo xâm nhiễm vào chủ có thể hoạt hóa biểu gen chứa trình tự EBE AvrXa7, PthXo2A PthXo2B vùng promoter 4Ị0 400 PXO86 (AvrXa7) ■ Để xác định trình tự EBE liên kết với protein TAL isolate Xoo Việt Nam (gọi tắt VXO), isolate vxo_ll, VXO_60 VXO_96 (đại diện cho vùng trồng lúa Hà Nội, Nghệ An, Hải Phịng) lựa chọn giải trình tự nucleotide vùng gen talva xác định trình tự axit amin suy biến protein TAL Dựa vào trình tự axit amin protein TAL, trình tự EBE liên kết vói TAL chủng Xoo giải mã §0SBBBS0S8S8BBSB008SBBSB0SB §88B8B8B8SS8SBB0@aSaSSaB088a 8H88H88888888BB88888S8S8S880 888868888888888800898888880 $• Hình Dự đốn vị trí EBE promoter SWỈ4-TBjR]iên kết với TAL vxo Ghi chú: Trình tự axit amin suy biến protein TAL chủng Xoo Việt Nam (VXO_11, VXO_60, VXO_96) so sái vói chủngXoo tham chiếu Philippin (PXO86) mang T4Z AvrXa7 370 * PXO71 (PthXo2 M OJQMB 86888888888888888888838 oxxe 88888888888888888888888 88888888888888888888888 VXOJ VXOJ Swl3-TBR « r- 330 * V e T c c|T