Ứng dụng hệ thống bioreactor nhân nhanh sinh khối rễ cây sâm cau

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Ứng dụng hệ thống Bioreactor nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2020 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Ứng dụng hệ thống Bioreactor nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) CHỦ NHIỆM CƠ QUAN CHỦ TRÌ Nguyễn Văn Tồn THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2020 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi THÔNG TIN CHUNG vii TÓM TẮT KẾT QUẢ ix PHẦN MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Sâm Cau 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Thành phần hoạt chất thân rễ Sâm Cau 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.2 Nuôi cấy in vitro sinh khối rễ bất định, rễ thứ cấp: 1.2.1 Khái niệm rễ bất định 1.2.2 Khái niệm rễ thứ cấp 1.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp rễ bất định 1.3 Tình hình nghiên cứu nước .12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro 12 1.3.2 Những nghiên cứu hệ thống ngập chìm tạm thời hệ thống nuôi cấy Bioreactor ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật 14 1.4 Đánh giá cơng trình nghiên cứu liên quan 19 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 2.1 Nội dung nghiên cứu 21 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu nghiên cứu .21 2.3.1 Nguồn giống 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu .22 2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát hệ thống Bioreactor phù hợp với việc nuôi cấy nhân sinh khối rễ 22 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng thể tích mơi trường nồng độ đường đến khả tích lũy dược chất sinh khối Sâm cau 25 2.4 Phương pháp phân tích số liệu 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Ảnh hưởng hệ thống Bioreactor phù hợp với việc nuôi cấy nhân sinh khối rễ 30 3.1.1 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy lên khả nhân sinh khối Rễ Sâm cau 30 3.2 Ảnh hưởng thể tích mơi trường nồng độ đường đến khả tích lũy dược chất sinh khối Sâm cau 37 3.2.1 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau 37 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ đường lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm Cau 42 3.3 Sản phẩm nhiệm vụ 47 3.3.1 Sinh khối rễ tươi 47 3.3.2 Quy trình nhân sinh khối 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ORCINOL GLUCOSID 54 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ 62 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần orcinol glucoside (OG) curculigoside (CG) thân rễ Sâm cau (Curculiginis) Việt Nam Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát hệ thống Bioreactor phù hợp với việc nuôi cấy nhân sinh khối rễ 23 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thể tích ni cấy lên khả nhân thân rễ Sâm cau 26 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ đường lên khả nhân thân rễ Sâm cau 29 Bảng 3.1 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy điều kiện chiếu sáng lên khả nhân sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 30 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ đường lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm Cau sau 12 tuần nuôi cấy 42 Bảng 3.4 Kết phân tích định lượng hàm lượng orcinol glucosid 46 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sâm cau (A) trưởng thành có hoa quả, (B) Cây có hoa cột giây để kiểm tra chu kỳ hoa, (C) Thân rễ thuộc nhóm rễ thịt, (D) Quả, (E) Hạt (F) Cây giống Hình 1.2 Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời Platima 17 Hình 1.3 Hệ thống Bioreactor bình cầu sục khí đáy 18 Hình 2.1 Cụm rễ bất định 22 Hình 2.2 Cụm rễ bất định hệ thống nuôi cấy 24 Hình 2.3 Thao tác hệ thống Bioreactor 24 Hình 2.4 Cụm rễ bất định ni cấy hệ thống Bioreactor 27 Hình 3.1 Biểu đồ tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng tươi sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 31 Hình 3.2 Biểu đồ bề mặt tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng tươi sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 31 Hình 3.3 Biểu đồ tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng khô sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần ni cấy 32 Hình 3.4 Biểu đồ bề mặt tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng khô sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 32 Hình 3.5 Biểu đồ tương quan hệ thống ni cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến tỷ lệ tươi/khô sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần ni cấy 33 Hình 3.6 Biểu đồ bề mặt tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến tỷ lệ tươi/khô sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 33 Hình 3.7 Biểu đồ bề mặt tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hệ số nhân sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần ni cấy 34 Hình 3.8 Biểu đồ bề mặt tương quan hệ thống nuôi cấy điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hệ số nhân sinh khối Rễ Sâm cau sau 12 tuần ni cấy 34 Hình 3.9 Rễ Sâm cau phát triển hệ thống ngập chìm tạm thời sau 12 tuần 35 iv Hình 3.10 Rễ Sâm cau phát triển hệ thống Bioreactor sau 12 tuần 36 Hình 3.11 Biểu đồ thể ảnh hưởng thể tích mơi trường nuôi cấy đến trọng lượng tươi sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần 38 Hình 3.12 Biểu đồ thể ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy đến trọng lượng khơ sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần 39 Hình 3.13 Biểu đồ thể ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy đến tỷ lệ tươi/khô sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần 39 Hình 3.14 Biểu đồ thể ảnh hưởng thể tích mơi trường nuôi cấy đến hệ số nhân sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần 40 Hình 3.15 Ảnh hưởng thể tích mơi trường lên khả nhân rễ 41 Hình 3.16 Ảnh hưởng nồng độ đường đến rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 43 Hình 3.17 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ đường đến trọng lượng tươi rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 44 Hình 3.18 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ đường đến trọng lượng khô rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 44 Hình 3.19 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ đường đến tỷ lệ tươi/khô sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 45 Hình 3.20 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ đường đến hệ số nhân sinh khối rễ Sâm cau sau 12 tuần nuôi cấy 45 Hình 3.21 Sinh khối rễ tươi Sâm cau 47 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BA N – – Benzyladenine RBĐ Rễ bất định RTC Rễ thứ cấp HSN Hệ số nhân TLT Trọng lượng tươi TLK Trọng lượng khô IBA – Indolebutyric acid MS Murashige and Skoog NAA α – Naphthaleneacetic acid vi THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Ứng dụng hệ thống Bioreactor nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Chủ nhiệm: Họ tên: Nguyễn Văn Toàn Năm sinh: 02/03/1983 Giới tính: Nam Học vị: Cử nhân; Chuyên ngành: Sinh học; Năm đạt học vị: 2006 Chức vụ: Trưởng phịng Hỗ trợ Cơng nghệ Tế bào Thực vật Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.HCM Điện thoại quan: 028 62646103 ; Fax: 028 62646104 Điện thoại di động: 0792 816 981 E-mail: nguyenvantoan0203@yahoo.com.vn Cơ quan chủ trì Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Điện thoại: 08.62646103 Fax: 08.62646104 E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM Văn phòng giao dịch: 255, Trần Hưng Đạo, quận 1, Tp HCM Thời gian thực hiện: 12 tháng (Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020) Kinh phí thực hiện: 159.921.800 đồng Nội dung thực hiện: Nội dung 1: Khảo sát hệ thống Bioreactor phù hợp với việc nuôi cấy nhân sinh khối rễ Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng Hệ thống nuôi cấy lên khả nhân sinh khối Rễ Sâm cau Thời gian thực hiện: 03/2020 đến 05/2020 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng thể tích mơi trường nồng độ đường đến khả tích lũy dược chất sinh khối Sâm cau vii Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau Thời gian thực hiện: 06/2020 đến 08/2020 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ đường lên khả nhân nhanh sinh khối rễ Sâm cau Thời gian thực hiện: 08/2020 đến 11/2020 Sản phẩm nhiệm vụ: - Báo cáo trình bày khoa học, số liệu phân tích phần mềm xử lý thống kê hội đồng thơng qua - Quy trình nhân sinh khối rễ Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.), sinh khối thu có hàm lượng dược tính tương đương gần với sinh khối thu hái tự nhiên) - 01 kg rễ tươi Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) viii Dependent Variable: K Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square F Value Pr > F 33.58094167 6.71618833 0.64915000 Corrected Total 11 0.10819167 34.23009167 R-Square Coeff Var Root MSE 0.981036 3.714918 0.328925 Source DF 62.08 F L 0.21031667 0.10515833 0.97 0.4309 N 33.37062500 11.12354167 102.81 F 0.22608333 Corrected Total Squares Anova SS 0.00965000 K Mean 8.305000 Mean Square F Value Pr > F 0.00482500 63 1.26 0.3498 N 0.21643333 0.07214444 18.81 0.0019 t Tests (LSD) for K NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.003836 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.1237 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N N A 8.51667 CT1 B 8.32333 CT3 B C B 8.20667 CT2 C C 8.17333 CT4 Hệ số nhân thí nghiệm The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values L 123 N CT1 CT2 CT3 CT4 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 Dependent Variable: K Sum of Source DF Model Error Mean Square F Value Pr > F 19.79833333 Corrected Total Squares 3.95966667 0.36833333 11 0.06138889 20.16666667 R-Square Coeff Var Root MSE 0.981736 3.378652 0.247768 Source DF 64.50 F 0.07583333 6.54888889 1.24 0.3554 106.68 F 17 4101.777778 R-Square Coeff Var Root MSE 0.989138 1.882792 2.110819 Source DF 130.09 F 6.722222 1.51 0.2675 808.755556 181.52 F 64.89532222 10 9.27076032 0.67718889 Corrected Total 17 0.06771889 65.57251111 R-Square Coeff Var Root MSE 0.989673 1.871848 0.260229 Source DF 136.90 F L 0.21247778 0.10623889 1.57 0.2555 N 64.68284444 12.93656889 191.03 F 0.01636111 R-Square Coeff Var Root MSE 0.894737 0.162675 0.013123 Source DF 12.14 0.0004 Anova SS K Mean 8.067222 Mean Square F Value Pr > F L 0.00087778 0.00043889 2.55 0.1275 N 0.01376111 0.00275222 15.98 0.0002 t Tests (LSD) for K NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 0.000172 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.0239 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N N A 8.11667 CT1 B 8.09000 CT2 C 8.06333 CT3 8.05000 CT4 8.04333 CT6 8.04000 CT5 C C C C C C Hệ số nhân thí nghiệm The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values L 123 N CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 Dependent Variable: K 67 Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square F Value Pr > F 40.57222222 10 5.79603175 0.44555556 Corrected Total 17 0.04455556 41.01777778 R-Square Coeff Var Root MSE 0.989138 1.882792 0.211082 Source DF 130.09 F 0.06722222 1.51 0.2675 8.08755556 181.52 F 4454.833333 60.833333 11 890.966667 87.88 F 5.583333 0.55 0.6032 1481.222222 146.09 F 80.72094167 Corrected Total Squares 16.14418833 1.12455000 11 0.18742500 81.84549167 R-Square Coeff Var Root MSE 0.986260 2.603936 0.432926 Source DF 86.14 F L 0.34111667 0.17055833 0.91 0.4517 N 80.37982500 26.79327500 142.95 F 80.72094167 Corrected Total Squares 16.14418833 1.12455000 11 0.18742500 81.84549167 R-Square Coeff Var Root MSE 0.986260 2.603936 0.432926 Source DF 86.14 F L 0.34111667 0.17055833 0.91 0.4517 N 80.37982500 26.79327500 142.95 F 44.54833333 Corrected Total Squares 8.90966667 0.60833333 11 0.10138889 45.15666667 R-Square Coeff Var Root MSE 0.986528 2.523775 0.318416 Source DF 87.88 F L 0.11166667 0.05583333 0.55 0.6032 N 44.43666667 14.81222222 146.09 F 1979.833333 395.966667 36.833333 Corrected Total 11 6.138889 2016.666667 R-Square Coeff Var Root MSE 0.981736 3.378652 2.477678 Source 64.50 F L 15.166667 7.583333 1.24 0.3554 T 1408.333333 1408.333333 229.41 F L 15.166667 T 1408.333333 1408.333333 229.41 |t| 1 58.6666667 66.3333333 0.0219 75.3333333 0.0004 2 93.0000000 F 33.58094167 Corrected Total Squares 6.71618833 0.64915000 11 0.10819167 34.23009167 R-Square Coeff Var Root MSE 0.981036 3.714918 0.328925 Source DF 62.08 F L 0.21031667 0.10515833 0.97 0.4309 T 24.33900833 24.33900833 224.96 F L 0.21031667 0.10515833 0.97 0.4309 T 24.33900833 24.33900833 224.96 |t| 1 6.8900000 7.9700000 0.0169 9.1766667 0.0004 2 11.3800000 F DF Type I SS K Mean 8.305000 Mean Square F Value Pr > F L 0.00965000 0.00482500 1.26 0.3498 T 0.15870000 0.15870000 41.37 0.0007 N 0.03853333 0.03853333 10.04 0.0193 T*N 0.01920000 Source DF 0.01920000 Type III SS 5.01 0.0666 Mean Square F Value Pr > F L 0.00965000 0.00482500 1.26 0.3498 T 0.15870000 0.15870000 41.37 0.0007 N 0.03853333 0.03853333 10.04 0.0193 T*N 0.01920000 0.01920000 5.01 0.0666 t Tests (LSD) for K NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.003836 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.0875 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 8.42000 B 8.19000 t Tests (LSD) for K NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.003836 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.0875 Means with the same letter are not significantly different t Grouping N N A 8.36167 B 8.24833 Level of T Mean Level of N N K -Mean Std Dev 75 1 8.51666667 0.07637626 8.32333333 0.06806859 8.20666667 0.03785939 2 8.17333333 0.06658328 Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett H0:LSMean= Control T N K LSMEAN Pr > |t| 1 8.51666667 8.32333333 0.0211 8.20666667 0.0021 2 8.17333333 0.0013 Hệ số nhân thí nghiệm yếu tố The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values L 123 T 12 N 12 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 Dependent Variable: K Sum of Source DF Model Error Mean Square F Value Pr > F 19.79833333 Corrected Total Squares 3.95966667 0.36833333 11 0.06138889 20.16666667 R-Square Coeff Var Root MSE 0.981736 3.378652 0.247768 Source DF 64.50 F L 0.15166667 0.07583333 1.24 0.3554 T 14.08333333 14.08333333 229.41 F L 0.15166667 0.07583333 1.24 0.3554 T 14.08333333 14.08333333 229.41 |t| 1 5.86666667 6.63333333 0.0219 7.53333333 0.0004 2 9.30000000