Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase trên tế bào của nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum)

MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Error! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH xvii DANH MỤC BẢNG xviii DANH MỤC VIẾT TẮT xix TÓM TẮT KHÓA LUẬN xxi LỜI MỞ ĐẦU xxii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tế bào da người 1.1.1 Lớp thượng bì (Epidemis) 1.1.2 Lớp nội bì (trung bì) (Dermis) 1.1.3 Lớp hạ bì (Hypodermis) 1.2 Tổng quan Tyrosinase 1.2.1 Tyrosinase 1.2.2 Melanogenesis 1.3 Nấm linh chi 1.3.1 Phân loại khoa học 1.3.2 Đặc điểm sinh học 10 1.3.3 Một số loại nấm linh chi Việt Nam 12 1.3.4 Thành phần hóa học 15 1.3.5 Nghiên cứu dược học 21 1.4 Định hướng nghiên cứu 23 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 2.2.1 Thuyết minh quy trình 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 xv 2.3.1 Điều chế cao trích 26 2.3.2 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ức chế tyrosinase 28 2.3.3 Khảo sát thành phần hóa học 36 2.4 Nghiên cứu khả ức chế melannin tyrosinase nội bào 37 2.4.1 Thử độc tính tế bào 37 2.4.2 Đánh giá tyrosinase nội bào melanin nội bào 39 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42 3.1 Điều chế cao trích 42 3.1.1 Hiệu suất thu hồi cao trích (Phụ lục 1) 42 3.1.2 Độ ẩm cao trích (Phụ lục 2) 42 3.1 Sàng lọc khả kháng oxy hóa ức chế tyrosinase 43 3.2.1 Xác định tổng hàm lượng polyphenol (Phụ lục 3) 43 3.2.2 Xác định hoạt tính ức chế gốc tự DPPH (Phụ lục 4) 44 3.2.3 Năng lực khử Fe3+ (Phụ lục 5) 45 3.2.4 Khả ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục 6) 47 3.2.5 Mối tương quan tổng hàm lượng polyphenol với khả ức chế gốc tự (DPPH), khả nảng khử Fe3+ khả ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục 7) 48 3.2.6 Bàn luận lựa chọn mẫu tối ưu 49 3.3 Phân tích thành phần hóa học (Phụ lục 8) 49 3.4 Nghiên cứu khả ức chế melanin tyrosinase nội bào 51 3.4.1 Thử độc tính tế bào (Phụ lục 9) 51 3.4.2 Đánh giá khả ức chế tyrosinase nội bào (Phụ lục 10) 53 3.4.3 Đánh giá khả ức chế melanin nội bào (Phụ lục 11) 54 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 72 xvi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo da người Hình 1.2 Các dạng oxy hóa Tyrosinase Hình 1.3 Trung tâm hoạt động Tyrosinase Hình 1.4 Cấu trúc hóa học eumelanin (A) pheomelanin (B) Hình 1.5 Quá trình sản xuất melanin Hình 1.6 Nấm Linh chi sừng hươu 13 Hình 1.7 Nấm Linh chi đỏ Hàn quốc 13 Hình 1.8 Nấm linh chi Nhật 13 Hình 1.9 Linh chi Việt Nam 14 Hình 1.10 Hồng chi Đà lạt 14 Hình 1.11 Cấu tạo phân tử 29 triterpenoid nấm Linh chi 19 Hình 1.12 Cấu trúc lucidimine phân lập từ G lucidum 21 Hình 1.13 Sơ đồ nghiên cứu 25 Hình 2.1 Sơ đồ điều chế cao trích 27 Hình 2.2 Sơ đồ định lượng tổng hàm lượng polyphenol 29 Hình 2.3 Sơ đồ đo mẫu cao trích 31 Hình 2.4 Sơ đồ xác định khả khử với Fe3+ 33 Hình 2.5 Phản ứng tạo DOPAchrome 34 Hình 2.6 Sơ đồ xác định khả ức chế enzyme tyrosinase 35 Hình 2.7 Sự chuyển đổi MTT thành tinh thể formazan 37 Hình 2.8 Quy trình thử độc tính tế bào 38 Hình 2.9 Sơ đồ đánh giá tyrosinase nội bào melanin nội bào 40 Hình 3.1 Tác dụng độc tính cao ethanol nấm linh chi đỏ E -HQ lên tế bào u hắc tố B16F10 Tế bào B16F10 xử lý với nồng độ cao trích E – HQ (10, 20, 40, 50, 60, 80, 100, 120 µg/ml) 48 tiếng Giá trị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) ba thí nghiệm độc lập liên quan đến tỷ lệ phần trăm mẫu đối chứng 52 Hình 3.2 Hàm lượng melanin nội bào IBMX kích thích theo phần trăm control 54 Hình 3.3 Sự ảnh hưởng mẫu cao E-HQ nồng độ 10, 20 40µg/ml đến tyrosinase nội bào IBMX kích thích với chất đối chứng dương arbutin Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê *p