Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao chiết từ vỏ lựu (Punica granatum)

Bài viết Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao chiết từ vỏ lựu (Punica granatum) được thực hiện để tìm hiểu khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-amylase, α-glucosidase và kháng oxy hóa của vỏ lựu ở phòng thí nghiệm.

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA, ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA CAO CHIẾT TỪ VỎ LỰU (PUNICA GRANATUM) Nguyễn Thị Ái Lan1, Nguyễn Phạm Tuấn2 Trường Đại học Trà Vinh Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu thực để tìm hiểu khả ức chế hoạt động enzyme α-amylase, α-glucosidase kháng oxy hóa vỏ lựu phịng thí nghiệm Mẫu vỏ lựu ly trích phương pháp Soxhlet với dung môi (nước, Ethanol 70 % Methanol 70 %) Khả ức chế enzyme α-amylase, enzyme α-glucosidase kháng oxy hóa xác định việc đo quang phổ bước sóng 660 nm, 405 nm 517 nm Kết quả, độ ẩm đạt 69,04 % hiệu suất chiết vỏ lựu đạt 10,27 - 13,27 % Cao chiết vỏ lựu có diện hợp chất Alkaloid, Terpenoids, Flavonoid, Steroid, Tanin Phenol Hàm lượng Phenolic, Flavonoid Tannin tổng cao chiết vỏ lựu đạt 101,24 - 311,34 mg GE/g cao chiết; 67,99 - 90,54 mg Quercetin/g cao chiết 76,67 - 124,92 mg Tannic acid/g cao chiết Cao chiết vỏ lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp với giá trị IC50 65,27 µg/mL (nước); 57,26 µg/mL (Ethanol) 49,17 µg/mL (Methanol) Cao chiết vỏ lựu có khả ức chế enzyme α-amylase với giá trị IC50 63,46 µg/mL (nước); 53,24 µg/mL (Ethanol) 47,37 µg/mL (Methanol) Cao chiết vỏ lựu có khả ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 73,30 µg/mL (nước); 68,36 µg/mL (Ethanol) 60,37 µg/mL (Methanol) Từ khóa: α-amylase; α-glucosidase; Kháng oxy hóa; DPPH; Cây lựu Abstract Antioxidant activity, α-amylase and α-glucosidase inhibiting activities of the extract of Punica granatum peel This study was to evaluate the inhibitory effects of extracts of Pomegranate peel on enzyme α-amylase and α-glucosidase, antioxidant at in vitro The plant extraction was carried out by Soxhlet method with solvents (aqueous, Ethanol 70 % and Methanol 70 %) Inhibition activities of α-amylase, α-glucosidase and antioxidant were measured by spectrophotometer at 660 nm, 405 nm and 517 nm wavelength The results showed that the moisture content was 69.04 % and extraction efficiency of pomegranate peel ranged from 10.27 to 13.27 % Pomegranate peel extract has the presence of bioactive compounds such as Alkaloids, Flavonoids, Saponins, Terpenoids, Steroids, Tannin and Phenol The Phenolic and Flavonoid content of Pomegranate peel per g of dry weight were 101.24 - 311.34 mg Gallic acid/g; 67.99 - 90.54 mg Quercetin/g and, 76.67 - 124.92 mg Tannic acid/g, respectively Pomegranate peel extract has antioxidant ability by DPPH method with IC50 value of 65.27 µg/mL (aqueous); 57.26 µg/mL (Ethanol) and 49.17 µg/mL (Methanol), respectively Pomegranate peel extract has the ability to inhibit α-amylase with an IC50 values of 63.46 µg/mL (aqueous); 53.24 µg/mL (Ethanol) and 47.37 µg/ mL (Methanol), respectively Pomegranate peel extract has the ability to inhibit α-glucosidase with an IC50 values of 73.30 µg/mL (aqueous); 68.36 µg/mL (Ethanol) and 60.37 µg/mL (Methanol), respectively Keywords: α -amylase; α-glucosidase; Antioxidant; DPPH; Pomegranate peel 80 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững Đặt vấn đề Cây lựu (Punica granatum) coi thuốc ăn quả, biết đến loại trái quan trọng cơng nhận tồn cầu hương vị dễ chịu lợi ích tuyệt vời cho sức khỏe có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Trái lựu sử dụng hoa ăn tươi, làm nước uống sản phẩm khác tùy theo nhu cầu người Lợi ích sức khỏe lựu không giới hạn phần thịt quả, mà phần khơng ăn (chủ yếu vỏ) có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học phần ăn Vỏ trái lựu chiếm gần 30 - 40 % khối lượng lựu sản phẩm phụ sau chiết xuất nước ép Theo Khan cs [1], vỏ lựu chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Phenolic, Flavonoid, Tannin,… ứng dụng để điều trị bệnh, như: thuốc chống viêm; đái tháo đường; chống dị ứng kháng tiểu cầu Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa Carbohydrate hormone Insulin tuyến tụy bị thiếu hay suy giảm tác động thể ĐTĐ biểu lượng Glucose máu cao bình thường Đối với người bệnh tiểu đường type 2, việc tăng Glucose máu thường gây biến chứng nguy hiểm Kiểm soát đường huyết đặc biệt đường huyết sau bữa ăn xem nhiệm vụ quan trọng điều trị ĐTĐ Điều đạt thơng qua việc ức chế enzyme tiêu hóa Carbohydrate enzyme α-amylase α-glucosidase Việc sử dụng chất ức chế có nguồn gốc thiên nhiên có hiệu cao, chi phí thấp điều trị bệnh đái tháo đường ln vấn đề nhận nhiều quan tâm Các nghiên cứu trước cho thấy, cao chiết thực vật có tiềm ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase, như: ổi; khổ qua; sa kê [2] Từ đó, nghiên cứu thực nhằm đánh giá khả kháng oxy hóa ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase vỏ lựu nhằm góp phần tận dụng phụ phế phẩm, giảm thải ô nhiễm môi trường hướng tới việc sử dụng vỏ lựu vừng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường biến chứng bệnh đái tháo đường Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên vật liệu: vỏ lựu (Punica granatum) thu thập từ chợ Cần Đăng, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Hóa chất thiết bị: máy đo quang phổ (Human, Hàn Quốc), máy đông khô chân không (Christ, Mỹ), máy cô quay chân không (Eyala, Nhật Bản), máy ly tâm (Orto alresa, Tây Ban Nha), gallicd acid, quercetin, DPPH (Merck, Mỹ), enzyme α-amylase α-glucosidase, acarbose (Sigma, Mỹ),… hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tạo cao chiết vỏ lựu Trái lựu thu từ chợ Cần Đăng, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Trái lựu tiến hành loại bỏ phần thịt quả, thu lại phần vỏ lựu tiến hành sấy khô điều kiện nhiệt độ 50 0C 72 nghiền thành bột mịn Bột vỏ lựu (300 g) chiết xuất hệ thống Soxhlet với dung môi (nước, Ethanol 70 % Methanol 70 %), với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:10 (w/v), điều kiện nhiệt độ 50 0C, 12 Sau đó, hỗn hợp tiến hành ly tâm 5.000 vòng/phút 20 phút, loại bỏ phần cặn, thu phần dịch Phần dịch lọc qua giấy lọc Whatman có đường kính 0,45 µm, thu dịch lọc bỏ phần cặn Phần dịch lọc sau tiến hành quay chân khơng để đuổi dung môi (Ethanol Methanol) tiến hành đông khô máy đông khô để thu cao chiết vỏ lựu, bảo quản nhiệt độ -20 0C thực nghiên cứu Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 81 2.2.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết vỏ lựu Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học theo phương pháp Yadav cộng [3] (Bảng 1) 2.2.3 Phân tích hàm lượng Phenolic Flavonoid tổng cao chiết vỏ lựu Hàm lượng Flavonoid tổng theo Pieme cs [4]: Hút 0,1 mL Quercetin, thêm 0,3 mL nước cất, 0,03 mL NaNO2 5% Ủ phút 25 0C, thêm 0,03 mL AlCl3 10 % Ủ thêm phút, thêm 0,2 mL NaOH mM nước cất để tổng thể tích mL, đo λ = 510 nm Hàm lượng Flavonoid tổng xác định theo cơng thức: C = c x V/m Trong đó: C: hàm lượng Flavonoid tổng (mg Quercetin/g chiết xuất); c: giá trị x từ đường chuẩn Quercetin (mg/mL); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có V (g) Hàm lượng Phenolic tổng theo Yadav Agarwala [5]: Gallic acid nồng độ 0-100 µg/mL Cho mL dung dịch Gallic acid vào 2,5 mL thuốc thử Folin - Ciocalteu 10 %, phản ứng phút; thêm tiếp mL dung dịch Na2CO3 %, sau 45 phút phản ứng nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ λ = 765 nm Hàm lượng Phenolic tổng tính theo cơng thức: P = a × V/m Trong đó: P: hàm lượng Phenolic tổng (mg Gallic acid/g cao chiết); a: giá trị x từ đường chuẩn (mg/mL); V: thể tích dung dịch cao chiết (mL); m: khối lượng cao chiết thể tích V (g) Hàm lượng Tannin cao chiết theo Kavitha Indira [6] Sử dụng Tannic acid làm chất chuẩn đối chiếu (0 - 100 µg/mL) Phản ứng cho 0,1 mL dung dịch Tannic acid bổ sung thêm 7,5 mL nước cất 0,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu, thêm mL dung dịch Na2CO3 35 % bổ sung thêm nước cất đủ 10 mL, để phản ứng nhiệt độ phòng 30 phút Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng λ = 700 nm Hàm lượng Tannin tính theo cơng thức: P = a x V/m Trong đó: P: hàm lượng Tannin (mg Tannic acid/g cao chiết); a: giá trị x từ đường chuẩn (mg/mL); V: thể tích dung dịch cao chiết (mL); m: khối lượng cao chiết thể tích V (g) Bảng Định tính hợp chất cao chiết vỏ lựu Hợp chất Alkaloid (Mayer) Flavonoid Thực nghiệm mL dịch trích + vài giọt TT Mayer mL dịch trích mL + Pb(OAc)4 10 % Hiện tượng Kết tủa màu nâu Xuất màu vàng Saponin (Foam) mL dịch trích + mL H2O→ đun nóng Xuất bọt Xuất vịng đỏ nâu lớp Steroid (Salkowski) mL dịch trích + mL CHCl3 + mL H2SO4đđ Tannin phenol ( Braymer) Terpenoid 0,5 mL dịch trích + 10 mL H2O + - giọt FeCl3 0,1% Kết tủa xanh dương đen mL dịch trích + mL (CH3CO)2O + - giọt H2SO4đđ Xuất màu đỏ đậm 2.2.4 Khảo sát khả kháng oxy hóa cao chiết vỏ lựu Khả ức chế gốc tự DPPH theo Shekhar Anju [7]: mL cao chiết với mL dung dịch DPPH 0,1 M, nhiệt độ phòng 30 phút điều kiện tối đo độ hấp thụ λ = 517 nm Khả ức chế gốc tự DPPH theo công thức: AA % = (Ao-A1/Ao) x 100 82 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ mơi trường phát triển bền vững Trong đó: AA %: Phần trăm ức chế gốc tự DPPH; Ao: Độ hấp thụ quang phổ mẫu đối chứng; A1: Độ hấp thụ quang phổ mẫu cao chiết Vitamin C chất chuẩn 2.2.5 Khảo sát khả ức chế enzyme α-amylase cao chiết vỏ lựu Phản ứng ức chế thủy phân tinh bột α-amylase theo Đào Thị Xuân Trang cs [2]: 50 μL α-amylase 0,5 U/mL ủ với 100 μL cao chiết 100 μL dung dịch đệm Phosphate pH = 7, ủ nhiệt độ 37 0C 10 phút, thêm 250 μL tinh bột mg/mL ủ nhiệt độ 37 0C 10 phút Sau đó, hỗn hợp thêm 100 μL HCl N để dừng phản ứng 300 μL thuốc thử Iodine 0,1 N để nhận biết lượng tinh bột lại dựa phản ứng màu xanh đặc trưng phức hợp tinh bột-iodine, tiến hành đo quang λ = 660 nm để xác định lượng tinh bột lại sau phản ứng Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%): dựa vào lượng tinh bột ban đầu lượng tinh bột lại sau phản ứng thông qua giá trị đo độ hấp thu quang phổ Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%) = 100 - Hiệu suất phản ứng (%) Hiệu suất phản ứng (%) = (Ao - A1)/Ao x 100 Trong đó: Ao: Giá trị quang dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu) A1: Giá trị quang dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột lại) Acarbose chất chuẩn 2.2.6 Khảo sát khả ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết vỏ lựu Phản ứng ức chế thủy phân tinh bột α-glucosidase theo Đào Thị Xuân Trang cộng [2]: 100 μL α-glucosidase ủ với 50 μL cao chiết nhiệt độ 37 0C 10 phút, thêm 50 μL pNPG nồng độ mM ủ nhiệt độ 37 0C 20 phút Sau cùng, kết thúc phản ứng việc bổ sung 1000 μL Na2CO3 0,2 M đo λ = 405 nm Phần trăm α-glucosidase bị ức chế (%) tính dựa vào lượng p-nitrophenol tạo thành từ pNPG phản ứng qua giá trị đo độ hấp thu quang phổ Phần trăm enzyme α-glucosidase bị ức chế (%) = (B - A)/B x 100 Trong đó: A: Giá trị quang mẫu thật B: Giá trị quang mẫu đối chứng Acarbose chất chuẩn thực tương tự mẫu cao chiết 2.3 Phương pháp thống kê Số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Excel 2010 thống kê phần mềm Statgraphics plus 16.0 Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Kết nghiên cứu 3.1 Kết tạo cao chiết vỏ lựu Quy trình trích cao thực với vỏ lựu 5.000 g (tươi), độ ẩm vỏ trái lựu 69,04 % vỏ lựu chiết xuất với dung môi khác 300 g (khô) (Bảng 2) Kết nghiên cứu cho thấy, hiệu suất trích cao có khác biệt dung mơi chiết, hiệu suất chiết cao dung môi Methanol với hiệu suất 13,27 %; dung môi Ethanol đạt hiệu suất 12,71 % dung môi nước đạt hiệu suất 10,27 % Bảng Kết phân tích độ ẩm, hiệu suất cao chiết vỏ lựu Chỉ tiêu theo dõi Khối lượng mẫu tươi (g) Độ ẩm (%) Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cao khô (g) Hiệu suất chiết (%) Cao chiết nước 5.000 69,04 ± 0,27 300 30,80 ± 0,06 10,27 ± 0,11 Cao chiết Ethanol 5.000 69,04 ± 0,27 300 38,13 ± 0,13 12,71 ± 0,19 Cao chiết Methanol 5.000 69,04 ± 0,27 300 39,80 ± 0,24 13,27 ± 0,17 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 83 3.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết vỏ lựu Cao chiết vỏ lựu từ dung mơi khác điều có chứa hợp chất Alkaloid, Terpenoids, Flavonoid, Steroid, Tanin Phenol (Bảng 3) Kết tương tự nghiên cứu Jayaprakash Sangeetha [8] cho rằng, dịch trích vỏ lựu có chứa hợp chất Saponin, Flavonoid, Alkaloid, Terpenoid, Steroid, Tanin Phenol Bảng Kết phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết vỏ lựu Chỉ tiêu theo dõi Saponin Flavonoid Terpenoids Alkaloid Tanin Phenol Steroid Cao chiết nước (+) (+) (+) (+) (+) (+) Cao chiết Ethanol (+) (+) (+) (+) (+) (+) Cao chiết Methanol (+) (+) (+) (+) (+) (+) Ghi chú: “+”: dương tính; “-”: âm tính 3.3 Phân tích hàm lượng Phenolic Flavonoid tổng cao chiết vỏ lựu Hàm lượng Phenolic tổng tính dựa theo đường chuẩn Gallic acid: y = 0,0049x + 0,0127; R2 = 0,9985 Hàm lượng Phenolic thấp cao chiết vỏ lựu nước 101,24 mg Gallic acid/g cao chiết; cao chiết vỏ lựu Ethanol đạt 273,74 mg Gallic acid/g cao chiết Cao nhất, hàm lượng Phenolic vỏ lựu Methanol đạt 311,34 mg Gallic acid/g cao chiết (Bảng 4) Hàm lượng Flavonoid tổng dựa đường chuẩn Quercetin, y = 0,0054x + 0,0185; R2 = 0,9992 Cụ thể, hàm lượng Flavonoid tổng cao cao chiết vỏ lựu Methanol (90,54 mg Quercetin/g cao chiết); cao chiết vỏ lựu Ethanol (79,97 mg Quercetin/g cao chiết) thấp cao chiết vỏ lựu nước (90,54 mg Quercetin/g cao chiết) (Bảng 4) Bảng Kết phân tích hàm lượng Phenolic Flavonoid tổng cao chiết vỏ lựu Mẫu cao chiết Nước Ethanol Methanol 101,24c ± 0,23 237,74b ± 0,04 311,34a ± 0,17 67,99c ± 0,03 79,97b ± 0,13 90,54a ± 0,09 76,67c ± 0,21 118,89b ± 0,19 124,92a ± 0,27 Hoạt chất Hàm lượng Phenolic (mg gallic acid/g cao chiết) Hàm lượng Flavonoid (mg quercetin/g cao chiết) Hàm lượng Tannin (mg tannic acid/g cao chiết) Ghi chú: số chữ số giống theo hàng khơng có ý nghĩa khác biệt thống kê mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn 0,6 0,5 Độ hấp thu Độ hấp thu 0,5 0,4 0,3 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0 20 40 60 Gallic acid (µg/mL) 80 y = 0,0054x + 0,0185 R² = 0,9992 0,6 y = 0,0049x + 0,0127 R² = 0,9985 100 0 20 40 60 80 100 Quercetin (µg/mL) (a) (b) Hình 1: Đường chuẩn gallic acid (a) quercetin (b) 84 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững Hàm lượng Tannin tổng phân tích dựa đường chuẩn Tannic acid: y = 0,0128x + 0,0122 với hệ số R2 = 0,9899 Hàm lượng Tannin thấp cao chiết vỏ trái lựu nước đạt 76,67 mg Tannic acid/g cao chiết; cao chiết vỏ trái lựu Ethanol đạt 118,89 mg Tannic acid/g cao cao chiết cao lượng Tannin cao chiết vỏ trái lựu Methanol đạt 124,92 mg g Tannic acid/g cao cao chiết (Bảng 4) 3.4 Khả kháng oxy hóa cao chiết vỏ lựu Tiến hành vẽ đường biểu diễn thể phần trăm ức chế gốc tự phương pháp DPPH vitamin C dựa vào nồng độ từ nồng độ - 100 µg/mL Phương trình đường chuẩn vitamin C: y = 0,8383x + 3,2718; từ suy giá trị IC50 vitamin C 55,73 µg/mL Bảng Khả kháng oxy hóa cao chiết vỏ lựu vitamin C Nồng độ (µg/mL) 20 40 60 80 100 IC50 Vitamin C 0,00f 23,28e ± 0,12 37,19d ± 0,05 54,22c ± 0,21 71,15b ± 0,19 85,27a ± 0,13 55,73 Phần trăm khử gốc tự (%) Cao chiết nước Cao chiết Ethanol 0,00f 0,00f 18,34e ± 0,32 23,69e ± 0,32 29,51d ± 0,32 36,65d ± 0,32 45,46c ± 0,32 55,29c ± 0,32 61,00b ± 0,32 73,67b ± 0,32 76,68a ± 0,32 86,43a ± 0,32 65,27 57,26 Cao chiết Methanol 0,00f 27,81e ± 0,32 40,53d ± 0,32 62,49c ± 0,32 78,61b ± 0,32 92,92a ± 0,32 49,57 Ghi chú: số chữ số giống theo cột khơng có ý nghĩa khác biệt thống kê mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Tiến hành vẽ đường biểu diễn phần trăm ức chế gốc tự phương pháp DPPH cao chiết vỏ lựu dựa kết phân tích phần trăm ức chế nồng độ - 100 µg/mL Cao chiết vỏ lựu nước, phương trình đường chuẩn: y = 0,7533x + 0,8346 có R2 = 0,9976 giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu nước 121,16 µg/mL (Bảng 5) Cao chiết vỏ lựu Ethanol, phương trình đường chuẩn: y = 0,8582x + 3,0438 có R2 = 0,9938 giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Ethanol 109,60 µg/mL (Bảng 5) Cao chiết vỏ lựu Methanol, phương trình đường chuẩn: y = 0,9128x + 4,7533 có R2 = 0,9889; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Methanol 98,42 µg/mL (Bảng 5) 3.5 Hiệu ức chế enzyme α-amylase cao chiết vỏ lựu Tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn biễu diễn khả ức chế α-amylase Acarbose nồng độ từ -100 µg/mL, phương trình đường chuẩn acarbose: y = 0,7171x + 6,1262 R² = 0,9746; giá trị IC50 Acarbose 76,48 µg/mL (Bảng 6) Xây dựng phương trình đường chuẩn biễu diễn khả ức chế α-amylase cao chiết vỏ lựu từ loại dung môi dựa vào nồng độ từ - 100 µg/mL (Bảng 6) Cao chiết vỏ lựu nước, phương trình đường chuẩn: y = 0,7117x + 4,8329 R² = 0,9839; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu nước 63,46 µg/mL Cao chiết vỏ lựu Ethanol, phương trình đường chuẩn: y = 0,8579x + 9,3619 R² = 0,9944; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Ethanol 53,24 µg/mL Cao chiết vỏ lựu Methanol, phương trình đường chuẩn: y = 0,7884x + 8,0624 R² = 0,9863; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Methanol 47,37 µg/mL (Bảng 6) Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 85 Bảng Hiệu enzyme α-amylase cao chiết vỏ lựu Acarbose Nồng độ (µg/mL) 20 40 60 80 100 IC50 Acarbose 0,00f 26,62e ± 0,32 37,73d ± 0,32 49,36c ± 0,32 60,36b ± 0,32 77,83a ± 0,32 76,48 Phần trăm ức chế enzyme α-amylase (%) Cao chiết nước Cao chiết Ethanol Cao chiết Methanol 0,00f 0,00f 0,00f 23,65e ± 0,32 28,45e ± 0,32 33,45e ± 0,32 d d 36,48 ± 0,32 45,04 ± 0,32 48,57d ± 0,32 46,45c ± 0,32 58,46c ± 0,32 63,25c ± 0,32 b b 60,25 ± 0,32 70,45 ± 0,32 77,59b ± 0,32 75,69a ± 0,32 82,49a ± 0,32 90,69a ± 0,32 63,46 53,24 47,37 Ghi chú: số chữ số giống theo cột khơng có ý nghĩa khác biệt thống kê mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn 3.6 Hiệu ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết vỏ lựu Xây dựng phương trình đường chuẩn biễu diễn khả ức chế α-glucosidase Acarbose nồng độ từ 0-100 µg/mL, phương trình đường chuẩn Acarbose: y = 0,733x - 0,8981 R² = 0,9969; giá trị IC50 Acarbose 69,44 µg/mL (Bảng 7) Bảng Hiệu enzyme α-glucosidase cao chiết vỏ lựu Acarbose Nồng độ (µg/mL) 20 40 60 80 100 IC50 Acarbose 0,00f 13,59e ± 0,32 27,66d ± 0,32 42,41c ± 0,32 57,58b ± 0,32 73,28a ± 0,32 69,44 Phần trăm ức chế enzyme α- glucosidase (%) Cao chiết nước Cao chiết Ethanol Cao chiết Methanol f f 0,00 0,00 0,00f e e 12,49 ± 0,32 15,49 ± 0,32 20,11e ± 0,32 26,14d ± 0,32 28,69d ± 0,32 34,97d ± 0,32 c c 40,89 ± 0,32 43,57 ± 0,32 49,45c ± 0,32 54,67b ± 0,32 59,46b ± 0,32 66,58b ± 0,32 a a 68,99 ± 0,32 72,57 ± 0,32 79,75a ± 0,32 73,30 68,36 60,37 Ghi chú: số chữ số giống theo cột ý nghĩa khác biệt thống kê mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Xây dựng phương trình đường chuẩn biễu diễn khả ức chế α-glucosidase cao chiết vỏ lựu từ loại dung môi dựa vào nồng độ từ - 100 µg/mL (Bảng 7) Cao chiết vỏ lựu nước, phương trình đường chuẩn y = 0,6946x - 0,8681 R² = 0,9995; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu nước 73,30 µg/mL (Bảng 7) Cao chiết vỏ lựu Ethanol, phương trình đường chuẩn y = 0,7281x + 0,2271 R² = 0,9994; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Ethanol 68,36 µg/mL (Bảng 7) Cao chiết vỏ lựu Methanol, phương trình đường chuẩn: y = 0,7895x + 2,3357 R² = 0,9966; giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu Methanol 60,37 µg/mL (Bảng 7) Thảo luận chung Trong suốt trình sấy mẫu, nhiệt độ cao làm phá vỡ cấu trúc tế bào bên nguyên liệu, tạo điều kiện cho dung môi nguyên liệu tiếp xúc tốt hơn, tăng khả ly trích Bên cạnh đó, q trình sấy cịn có tác dụng làm giảm độ ẩm nguyên liệu, giúp tăng tỷ lệ dung môi sử dụng với nguyên liệu Độ ẩm hàm lượng nước tự có mẫu, độ ẩm cao tương ứng với hàm lượng nước có mẫu nhiều Hiệu suất chiết dung mơi có khác biệt phụ thuộc vào dung môi Các dung môi khác sử dụng để chiết xuất hợp chất khác nhau, tùy thuộc vào độ phân cực dung môi [9] 86 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững Phân tích định tính cho thấy, cao chiết vỏ lựu từ dung mơi khác điều có diện hợp chất Alkaloid, Terpenoids, Flavonoid, Steroid, Tannin Phenol Nhóm chất Flavonoid Polyphenol có hoạt tính sinh học cao, có ý nghĩa hoạt động kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư bảo vệ gan Bảng Giá trị IC50 (µg/mL) cao chiết vỏ lựu với khả kháng oxy hóa ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase điều kiện in vitro STT Cao chiết chất chuẩn Vitamin C Cao chiết nước Cao chiết Ethanol Cao chiết Methanol Acarbose Khả khử gốc tự DPPH 55,73 65,27 57,26 49,17 - Ức chế enzyme α-amylase 63,46 53,24 47,37 76,48 Ức chế enzyme α-glucosidase 73,30 68,36 60,37 69,44 Hàm lượng Flavonoid, Phenolic Tannin tổng dung mơi sử dụng trích ly có khác nhau, hàm lượng Flavonoid, Phenolic Tannin thể cao cao chiết vỏ lựu Methanol (311,34 mg Gallic acid/g cao chiết; 90,54 mg Quercetin/g cao chiết; 124,92 mg Tannic acid/g cao chiết); cao chiết vỏ lựu Ethanol đạt hàm lượng 237,74 mg Gallic acid/g cao chiết; 79,97 mg Quercetin/g cao chiết; 118,89 mg Tannic acid/g cao chiết thấp nhất, cao chiết vỏ lựu nước đạt 101,24 mg Gallic acid/g cao chiết; 67,99 mg Quercetin/g cao chiết; 76,67 mg Tannic acid/g cao chiết Kết nghiên cứu thấp Derakhshan cộng [10], hàm lượng Phenolic cao chiết 09 loại vỏ trái lựu Iran, có hàm lượng Phenolic khoảng 12,4 - 413 mg Gallic acid/g cao chiết trích ly với dung mơi Ethanol 80 % Trong đó, Mashkor [11], hàm lượng Phenolic cao chiết vỏ trái lựu khoảng 84,15 - 168,26 mg Gallic acid/g hàm lượng Flavonoid cao chiết vỏ trái lựu đạt khoảng 42,40 - 87,21 mg Quercetin/g Cao chiết tiến hành trích ly với dung mơi khác Methanol, Ethanol, Acetone Hơn nữa, Shahindokht Doostkam [12], hàm lượng Phenolic cao chiết vỏ trái lựu đạt hàm lượng Phenolic khoảng 59,73 189,1 mg Gallic acid/g hàm lượng Flavonoid khoảng 18,61 - 126,0 mg Quercetin/g cao chiết tiến hành trích ly vỏ trái lựu từ loại dung môi khác nguồn nguyên liệu đại phương khác Kết nghiên cứu thấp Abderrezak Hayat [13], tổng hàm lượng Tannin cao chiết vỏ trái lựu dao động khoảng 549,14 - 798,76 mg Tannic acid/g cao khô tiến hành trích ly vỏ trí lựu loại dung môi khác Ethanol 96 %, Methanol, Acetone, nước hỗn hợp nước: Methanol (50:50, v/v) Hơn nữa, Hadjadj cộng [14], hàm lượng Tannin đạt cao 47,78 mg CE/g cao chiết tiến hành trích ly vỏ trái lựu dung mơi Ethanol Sự khác hàm lượng Flavonoid, Phenolic Tannin cao chiết vỏ lựu i) phương pháp trích cao giống cho kết khác khác biệt yếu tố giai đoạn sinh trưởng thời gian lấy mẫu thí nghiệm; (ii) hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật bậc cao vị trí khác có hàm lượng, thành phần khác Điều giải thích cao chiết từ phận vỏ, thân cho kết phân tích hàm lượng hoạt chất sinh học khác nhau; (iii) thành phần hóa học cao chiết khác cho kết hàm lượng hoạt chất sinh học khác nhau; (iv) khác biệt giống trồng, mùa thời kỳ thu hoạch, điều kiện khí hậu nơng nghiệp phương pháp, thời gian khai thác dung môi chiết xuất [15]; (v) dung môi thường sử dụng để chiết xuất hợp chất chống oxy hóa (từ trái cây/rau tươi Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 87 nồng độ khác nhau), bao gồm: Aceton; Ethanol, Methanol, Propanol Ethyl acetate Khả hòa tan hợp chất chống oxy hóa dung mơi có ảnh hưởng đáng kể đến việc thu hồi hợp chất thời điểm chiết xuất Do đó, độ phân cực dung mơi có ảnh hưởng gián tiếp q trình chiết xuất làm tăng khả hòa tan hợp chất chống oxy hóa Hiệu kháng oxy hóa phương pháp DPPH cao chiết vỏ lựu cao so với chất chuẩn vitamin C Cụ thể, giá trị IC50 vitamin C đạt 55,73 µg/mL, giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu cao 1,17 lần (nước, IC50 = 65,27 µg/mL); cao 1,03 lần (Ethanol, IC50 = 57,26 µg/mL); thấp 0,89 lần (Methanol, IC50 = 49,57 µg/mL) Hiệu kháng oxy hóa phương pháp DPPH cao chiết vỏ lựu thấp số nghiên cứu trước Kết nghiên cứu cao nghiên cứu Hadjadj cộng [14], cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH với giá trị EC50 đạt 4,64 µg/mL tiến hành trích ly vỏ trái lựu Ethanol 70 % Hơn nữa, Abderrezak Chibane (2019) [13], cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH với giá trị IC50 đạt 76,75 µg/ mL; 85,37 µg/mL; 160,01 µg/mL 183,71 µg/mL tiến hành trích ly vỏ trái lựu dung môi khác Ethanol; hỗn hợp Methanol nước (50 : 50, v/v); Acetone nước Hiệu kháng oxy hóa phương pháp DPPH cao chiết vỏ lựu có khác biệt dung mơi chiết xuất hàm lượng Phenolic, Tannin Flavonoid loại cao chiết (Bảng 5) Các hợp chất Polyphenol gồm nhóm lớn chất có khả kháng oxy hóa Khả kháng oxy hóa khử cho phép hợp chất Polyphenol hoạt động chất khử cung cấp hydro làm ngừng hoạt động gốc tự Flavonoid nhóm hợp chất có thực vật, cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa thơng qua q trình thu nhặt khử gốc tự [16] Acarbose chất có khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase thường sử dụng nghiệm thức đối chứng dương thí nghiệm khảo sát ức chế hoạt động enzyme α-amylase α-glucosidase điều kiện in vitro Khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase cao chiết vỏ lựu thấp so với chất chuẩn Acarbose, với giá trị IC50 Acarbose đạt 76,48 µg/mL (α-amylase) 69,44 µg/mL (α-glucosidase) Trong đó, giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu với enzyme α-amylase thấp 1,36 lần (nước, IC50 = 63,46 µg/mL); thấp 1,23 lần (Ethanol, IC50 = 53,24 µg/mL) thấp 1,13 lần (Methanol, IC50 = 47,37 µg/mL) Giá trị IC50 cao chiết vỏ lựu với enzyme α-glucosidase cao 1,11 lần (nước, IC50 = 73,30 µg/mL); thấp 0,98 lần (Ethanol, IC50 = 68,36 µg/mL) thấp 0,87 lần (Methanol, IC50 = 60,37 µg/mL) Các hoạt chất từ thực vật có khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase sử dụng nhóm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường cách ngăn chặn thủy phân nhanh Carbohydrate thành đường đơn kiểm soát lượng Glucose huyết [17] Cao chiết vỏ lựu có khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase thể cao cao chiết vỏ lựu chiết dung mơi Methanol (IC50 = 47,37 µg/mL IC50 = 60,37 µg/mL); dung mơi chiết xuất Ethanol thấp dung môi nước Hiệu ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase cao chiết vỏ lựu có tương đồng với hàm lượng Polyphenol Flavonoid xác định trên, có nghĩa cao chiết giàu Polyphenol Flavonoid có khả ức chế enzyme cao Kết nghiên cứu thấp Sani Nair [18], cao chiết Methanol có khả ức chế enzyme α-amylase ức chế trình Glycosyl hóa Hemoglobin với giá trị IC50 đạt 72,15 µg/mL 83,21 µg/mL Trong đó, Chukwuma cộng [19], cao chiết Methanol có khả ức chế enzyme α-amylase với giá trị IC50 đạt 10,60 µg/mL Nhiều nghiên cứu khác cho thấy, cao chiết thực vật có hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase phụ thuộc vào Polyphenol Ngoài ra, Flavonoid nhóm 88 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững hợp chất Polyphenol báo cáo có khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase Các nhóm chất có hoạt tính ức chế enzyme số vị trí nhóm Hydroxyl chúng phân tử xác định yếu tố để ức chế enzyme Sự ức chế hoạt động tăng đáng kể với gia tăng số lượng nhóm hydroxyl vịng B Các nhóm Hydro cấu trúc phân tử Flavonoid hình thành liên kết Hydro với nhóm –OH chuỗi bên hoạt động acid amin chức enzyme giúp cản trở phản ứng enzyme α-amylase tinh bột ức chế trình thủy phân tinh bột [20] Kết luận Cao chiết vỏ lựu nguồn nguyên liệu tiềm năng, phong phú chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, sử dụng làm nguyên liệu cho trình sản xuất sản phẩm có khả hỗ trợ điều trị bệnh Cao chiết vỏ lựu có khả kháng oxy hóa, ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase điều kiện in vitro Nghiên cứu phân tách hoạt chất tiềm đánh giá hoạt tính sinh học vỏ lựu điều kiện in vitro in vivo Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Trường Đại học Trà Vinh hỗ trợ tạo điều kiện để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Khan, H., Jawad, M., Kamal, M A., Nabavi, S M., & Daglia, M (2018) Evidence and prospective of plant derived flavonoids as antiplatelet agents: Strong candidates to be drugs of future Food and Chemical Toxicology In Press DOI: 10.1016/j.fct.2018.02.014 [2] Đào Thị Xuân Trang, Phạm Thị Lan Anh Bùi Tấn Anh (2012) Khảo sát khả điều trị bệnh tiểu đường cao chiết ổi (Psidium guajava L.) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 22b: 163 - 171 [3] Yadav, M., S Chatterji, S.K Gupta, & Watal G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(5): 539 - 542 [4] Pieme, C.A S.G Kumar, M.S Dongmo, J.Y Ngogang, & A.K Saxena (2014) Antiproliferative activity and induction of apoptosis by Annona muricata (Annonaceae) extract on human cancer cells BMC complementary and alternative medicine, 14(1): - 10 [5] Yadav, R.N.S & M Agarwala (2011) Phytochemical Analysis of Some Medicinal Plants Journal of Phytology, 3: 10 - 14 [6] Kavitha, C.C.I and Indira, G (2016) Quantitative estimation of total phenolic, flavonoids, tannin and chlorophyll content of leaves of Strobilanthes Kunthiana (Neelakurinji) Journal of Medicinal Plants Studies (4): 282 - 286 [7] Shekhar, T.C & G Anju (2014) Antioxidant Activity by DPPH Radical Scavenging Method of Ageratum conyzoides Linn Leaves. American Journal of Ethnomedicine, Vol 1, No 4, pp 244 - 249 [8] Jayaprakash, A and Sangeetha, R (2015) Phytochemical Screening of Punica granatum Linn Peel Extracts Journal of Academia and Industrial Research, (5): 160 - 162 [9] Boeing, JS. O.B. Érica, F.M Paula, & V.V Jesuí (2014) Evaluation of solvent effect on the extraction of phenolic compounds and antioxidant capacities from the berries: application of principal component analysis Chemistry Central Journal, 8(1): 48 [10] Derakhshana, Z., Margherita F., Marzieh T., Farnoosh A., Ali H., Motahreh S Hosseinig, Gea O.C & Elham K.S (2018) Antioxidant activity and total phenolic content of ethanolic extract of pomegranate peels, juice and seeds Food and Chemical Toxicology, 114: 108 - 111 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 89 [11] Mashkor, I.M.AA (2014) Total phenol, Total Flavonoids and Antioxidant Activity of Pomegranate Peel International Journal of ChemTech Research CODEN, (11): 4656 - 4661 [12] Shahindokht, B.J.P & Doostkam, A (2019) Comparative evaluation of bioactive compounds of various cultivars of pomegranate (Punica granatum) in different world regions AIMS Agriculture and Food, 4(1): 41 - 55 [13] Abderrezak, K, & Hayat A.C (2019) Comparison of five solvents in the extraction of phenolic antioxidants from pomegranate (Punica granatum L.) peel The North African Journal of Food and Nutrition Research 03 (05): 140 - 147 [14] Hadjadj, S., Benyahkem M., Lamri K & Ould El H.K.A (2018) Potential assessment of pomegranate (Punica granatum l.) fruit peels as a source of natural antioxidants Pharmacophore, 9(4): 29 - 35 [15] Borochov-Neori, H., Judeinstein, E., Harari, M., Greenberg, A., Shomer, I and Holland, D (2009) Seasonal and cultivar variations in antioxidant and sensory quality of pomegranate (Punica granatum L.) fruit Journal of Food Composition and Analysis 22 (3): 189 - 195 [16] Baharfar, R., R Azimi, & M Mohseni (2015) Antioxidant and antibacterial activity of flavonoid-, polyphenol- and anthocyanin-rich extracts from Thymus kotschyanus boiss & hohen aerial parts J Food Sci Technol, 52(10): 6777 - 6783 [17] Zhenhua, Y., Z Wei, Z Yong, & K Wenyi (2014) α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants Food Science and Human Wellness, 3(4): 136 - 174 [18] Sani, B & Nair, S (2017) Studies on in vitro evaluation of antidiabetic potentials of watermellon and pomegranate peels Bayero Jour of Pure and Applied Sciences, 10(1): 32 - 35 [19] Chukwuma, C.I., Mashele S & Akuru E.A (2020) Evaluation of the in vitro α-amylase inhibitory, antiglycation, and antioxidant properties of Punica granatum L (pomegranate) fruit peel acetone extract and its effect on glucose uptake and oxidative stress in hepatocytes Journal of Food Biochemistry, 44(5):e13175 [20] Kang, B.H.,  K Racicot, S.J Pilkenton, & E Apostolidis (2014) Evaluation of the in vitro antihyperglycemic effect of Cinnamomum cassia derived phenolic phytochemicals, via carbohydrate hydrolyzing enzyme inhibition Plant Foods Hum Nutr, 69(2): 155 - 60 Ngày chấp nhận đăng: 10/11/2021 Phản biện: TS Nguyễn Thị Phương Mai 90 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững ... nghiên cứu trước cho thấy, cao chiết thực vật có tiềm ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase, như: ổi; khổ qua; sa kê [2] Từ đó, nghiên cứu thực nhằm đánh giá khả kháng oxy hóa ức chế enzyme α-amylase. .. Flavonoid tổng cao cao chiết vỏ lựu Methanol (90,54 mg Quercetin/g cao chiết) ; cao chiết vỏ lựu Ethanol (79,97 mg Quercetin/g cao chiết) thấp cao chiết vỏ lựu nước (90,54 mg Quercetin/g cao chiết) (Bảng... Tannin thấp cao chiết vỏ trái lựu nước đạt 76,67 mg Tannic acid/g cao chiết; cao chiết vỏ trái lựu Ethanol đạt 118,89 mg Tannic acid/g cao cao chiết cao lượng Tannin cao chiết vỏ trái lựu Methanol