Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế tyrosinase và khả năng bảo quản tôm (litopenaeus vannamei) của hạt me (tamarindus indica l )

MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Error! Bookmark not defined LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TĨM TẮT KHỐ LUẬN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tôm thẻ chân trắng 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố đặc điểm sinh thái 10 1.1.3 Thành phần hoá học 11 1.1.4 Giá trị kinh tế tôm thẻ chân trắng 12 1.1.5 Các biến đổi tơm q trình bảo quản 13 1.1.5.1 Sự biến đổi mặt vật lý 13 1.1.5.2 Sự biến đổi mặt hoá học 13 1.1.5.3 Sự biến đổi mặt vi sinh 14 1.1.5.4 Sự biến đổi mặt cảm quan 14 1.2 Tổng quan melanosis 14 1.2.1 Enzyme Tyrosiase 14 1.2.2 Melanosis 15 1.2.2.1 Cơ chế hình thành Melanosis 15 1.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình hình thành Melanosis 17 1.2.3 Các phương pháp ức chế hình thành Melanosis 17 1.3 Tổng quan me 20 1.3.1 Vấn đề tồn mục tiêu nghiên cứu 25 1.3.2 Mô tả thực vật phân bố sinh thái 20 1.3.3 Nghiên cứu thành phần hoá học 21 1.3.4 Nghiên cứu dược học 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Hoá chất 28 2.1.3 Thiết bị 29 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.2.2 Điều chế cao trích 31 2.2.3 Xác định thành phần hoạt tính sinh học 31 2.2.4 Ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng 32 2.2.4.1 Xử lý ngâm tôm 32 2.2.4.2 Đánh giá hình thành điểm biến đen tơm (melanosis) 32 2.2.4.3 Các tiêu đánh giá chất lượng tơm thẻ chân trắng q trình bảo quản 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Điều chế cao trích 34 34 2.3.2 Xác định hoạt tính chống oxy hoá 36 2.3.2.1 Tổng hàm lượng polyphenol 36 2.3.2.2 Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 38 2.3.2.3 Khả khử 39 2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase 41 2.3.4 Ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng 43 2.3.4.1 Xử lý ngâm tôm 43 2.3.4.2 Đánh giá hình thành điểm biến đen tơm (melanosis) 45 2.3.4.4 Xác định thay đổi pH trình bảo quản 47 2.3.4.5 Xác định tiêu vi sinh 48 2.3.4.6 Xác định tổng hàm lượng nitơ bazơ bay - Total Volatile Basic Nitrogen (TVB-N) 48 2.4 Xử lý số liệu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1 Điều chế cao trích 50 3.2 Xác định hoạt tính chống oxy hoá 50 3.2.1 Tổng hàm lượng polyphenol 50 3.2.2 Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 52 3.2.3 Năng lực khử Fe3+ 53 3.3 Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase 55 3.4 Phân tích thành phần hố học 56 3.5 Ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng 60 3.5.1 Đánh giá hình thành điểm biến đen tôm (melanosis) 60 3.5.2 Xác định khả ức chế q trình oxy hóa lipid (sự hình thành peroxide) tơm (TBARS) 64 3.5.3 Xác định thay đổi pH trình bảo quản 66 3.5.4 Xác định tiêu vi sinh 68 3.5.5.Xác định tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi- Total Volatile Basic Nitrogen 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Đề nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 87 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Tôm thẻ chân trắng Hình Hình dạng bên ngồi tơm thẻ chân trắng .10 Hình Quá trình hình thành melanosis .16 Hình Cơ chế ức chế phản ứng hình thành melanosis sulphite 19 Hình Quả me .21 Hình Hạt me .22 Hình Cấu trúc số hợp chất polyphenol flavonoid từ T indica 23 Hình Quá trình nghiên cứu 30 Hình 2 Quy trình điều chế cao methanol 34 Hình 3.Quy trình trích ly cao phân đoạn 35 Hình Quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol 37 Hình Quy trình xác định hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 38 Hình Quy trình khảo sát khả khử Fe3+ 40 Hình Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase 42 Hình Phân tử Kojic acid 43 Hình Quy trình khảo sát chất lượng tôm bảo quản .44 Hình 10 Quy trình khảo sát khả ức chế q trình oxy hóa lipid 47 trúc số hợp chất polyphenol flavonoid từ T indica.Error! Bookmark not defined Hình Sự biến đổi độ xám tôm qua xử lý sau ngày bảo quản 62 Hình Đồ thị Giá trị TBARS tơm thẻ chân trắng sau ngày bảo quản 66 Hình 3 Sự thay đổi giá trị pH tôm xử lý ngày bảo quản 1-3°C .68 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Phân loại tôm thẻ chân trắng theo tên khoa học (Samuel cộng sự, 2016) Bảng Thành phần hố học tơm thẻ chân trắng(Benjakul, S cộng sự, 2007) 11 Bảng Các tiêu vi sinh vật tôm đông lạnh (Theo TCVN 4381: 2009) .14 Bảng Phân loại me theo tên khoa học (Hayati, E I, 2015) 20 Bảng Mã hố tên cao trích từ hạt me .31 Bảng 2 Phương pháp xác định thành phần hoạt tính sinh học cao trích hạt me .31 Bảng Điều kiện xử lý tôm với phụ gia bảo quản 32 Bảng Phương pháp đánh giá hình thành điểm biến đen tôm (melanosis) 32 Bảng Khối lượng thu suất loại cao điều chế từ hạt T.indica 50 Bảng 2.Tổng hàm lượng polyphenol từ mẫu cao trích hạt me 51 Bảng 3 Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH mẫu cao trích hạt me 53 Bảng Độ hấp thu bước sóng 700nm mẫu cao trích hạt me .54 Bảng Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH mẫu cao trích hạt me 55 Bảng Một số hợp chất có mẫu cao trích từ bột hạt me 57 Bảng Kết thay độ giá trị độ xám tôm sau ngày bảo quản 61 Bảng Hình ảnh tơm bảo quản ngày 63 Bảng Giá trị TBARS mẫu tôm ngày bảo quản .64 Bảng 10 pH mẫu tôm xử lý ngày bảo quản 1-3°C .66 Bảng 11 Lượng vi sinh vật mẫu tôm qua xử lý sau ngày bảo 1-3°C 69 Bảng 12 Kết xác định hàm lượng TVB-N 70 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ Dịch nghĩa DDPH 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl EC50 The half maximal effective concentration Nồng độ thể tính hiệu tối đa 50% GAE Lượng tương đương với Gallic acid equivalents acid gallic HPLC-MS IC50 High Performance Liquid Chromatography Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng Mass Spectrometry hiệu cao ghép khối phổ The half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối đa 50% gốc tự L-DOPA L −3,4 dihydroxylphenylalanine - MDA Malondialdehyde - PPO Polyphenol oxidase - TBA Thiobarbituric acid - TBARS Thiobarbituric acid reactive subtance Cơ chất phản ứng với acid thiobarbituric TCA Trichloracetic acid - TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam - TVB-N Total Volatile Basic Nitrogen Tổng hàm lượng nitơ bazơ bay TĨM TẮT KHỐ LUẬN Từ kết sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa tyrosinase 60 loại phụ phẩm Việt Nam (2014-2016) nhóm tác giả P.T.A Đào cộng sự,2017 phát cao chiết methanol từ hạt me có hoạt tính cao (Phan Thị Anh Đào cơng sự, 2017) Từ đó, chúng tơi nhận thấy hạt me có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh có tiềm ứng dụng vào thực tế, q trình nghiên cứu chúng tơi tập trung nghiên cứu sâu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao trích từ hạt me Cao trích điều chế phương pháp ngâm dầm trích ly phân đoạn sử dụng ba loại dung mơi: methanol, ethyl acetate nước Sau thực khảo sát khả khử ion Fe3+ khảo sát khả chống oxy hóa mẫu cao phân đoạn phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol, ức chế gốc tự DPPH, hoạt tính khử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ứng dụng vào bảo quản tôm thẻ chân trắng thông qua việc xác định pH, tiêu vi sinh vật, TBARS, melanosis Kết cho thấy cao trích rau răm sử dụng dung mơi methanol có khả ức chế tốt enzyme tyrosinase, nồng độ 100 (µg/ml) cao trích methanol có khả ức chế 72.206 % đạt giá trị IC50 (µg/ml) 48.1974; khả khử Fe3+ Fe2+ nồng độ (mg/ml) đạt 1.373 Bên cạnh sau áp dụng vào bảo quản khảo sát nồng độ ngâm thời gian ngâm tối ưu 1/100 (g/ml) 15 phút So sánh với mẫu đối chứng nước cất thông qua phương pháp bảo quản lạnh 1-3oC vòng ngày cho thấy mẫu tơm có sử dụng cao hạt me có kết tốt tốt Có thể nói, cao trích từ hạt me nguồn giàu tiềm để ứng dụng vào bảo thực phẩm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tôm thẻ chân trắng 1.1.1 Phân loại khoa học Hình 1 Tơm thẻ chân trắng Tơm thẻ chân trắng có tên khoa học Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) danh pháp đồng vị Penaeus vannamei (Pérez-Linares cộng sự, 2003) Tôm thẻ chân trắng thuộc họ Penaeidae gồm bốn chi: Fenneropenaeus, Litopenaeus, Marsupenaeus Melicertus (Fransen & De Grave 2015) Tôm thẻ chân trắng phân loại khoa học theo bảng 1.1: Bảng 1 Phân loại tôm thẻ chân trắng theo tên khoa học (Samuel cộng sự, 2016) Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Arthropoda Phân ngành (subphylum) Crustacea Lớp (class) Malacostraca Bộ (ordo) Decapoda Phân (subordo) Dendrobranchiata 1.1.2 Họ (familia) Penaeidae Chi (genus) Litopenaeus Loài (species) L vannamei Phân bố đặc điểm sinh thái Phân bố Tôm thẻ chân trắng ( L.vannamei) phân bố chủ yếu bờ biển phía tây Thái Bình Dương Mỹ Latinh, từ vùng biển Peru đến vùng biển Equado- phía Nam Mexico Vùng phân bố tơm thẻ chân trắng có nhiệt độ nước quanh năm cao 20oC lồi tương đối dễ ni giới (Wyban and Sweeney, 1991) Tôm đưa vào Châu Á nuôi thử nghiệm từ 1978 đến 1979, thương mại hóa từ năm 1996 Đài Loan Trung Quốc; sau đến số quốc gia Đơng Nam Á Nam Á( Liao, I C., & Chien, Y H (2011) Hiện nay, tôm thẻ chân trắng di giống nhiều nước giới Thái Lan, Philipine, Indonexia,… Tại Việt Nam, khoảng đầu năm 2008 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn ban hành thị số 228/CT-BNN&PTNT cho phép nuôi tôm chân trắng vùng Đồng sông Cửu Long nhằm đa dạng hoá sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu, giảm áp lực cạnh tranh, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước khu vực giới Tôm thẻ chân trắng phân bố nhiều địa phương khắp tỉnh thành Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang,… đến tỉnh phía Bắc Quảng Ninh, Thái Bình, Nam Định,… Đặc điểm hình thái Hình Hình dạng bên ngồi tơm thẻ chân trắng 10 Tơm có vỏ mỏng, có màu trắng đục, chân bị có màu trắng ngà nên gọi tơm thẻ chân trắng Cơ thể tôm thẻ chân trắng chia thành hai phần: phần đầu ngực phần bụng Phần đầu ngực có 14 đơi phần phụ, đơi mắt kép có cuống mắt, đơi râu: Anten (A1), anten (A2), hai đôi râu giữ chức khứu giác giữ thăng bằng, đôi chân hàm có chức ăn mồi, giữ mồi hỗ trợ hoạt động bơi lội tôm, năm đôi chân ngực hay chân bò giúp cho việc bò mặt đáy Tơm thẻ chân trắng có chủy cong xuống, có 8-9 chuỹ 1-3 chuỷ (Nguyễn Trọng Nho cộng sự, 2006) 1.1.3 Thành phần hoá học Sự khác biệt thành phần hoá học dẫn đến khác biệt giá trị dinh dưỡng, chất lượng cảm quan thời hạn sử dụng tôm Thành phần tôm bị chi phối nhiều yếu tố bao gồm loài, giai đoạn tăng trưởng, thức ăn mùa (Karakoltsidis cộng sự, 1995; Sikorski, Kolakowska, & Pan, 1990) Bảng Thành phần hố học tơm thẻ chân trắng(Benjakul, S cộng sự, 2007) Thành phần Hàm lượng (% khối lượng tôm tươi) Ẩm 77,21 ± 0,18 Protein 18,8 ± 0,23 Chất béo 1,3 ± 0,09 * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Dựa vào bảng, ta thấy tôm thẻ chân trắng có hàm lượng ẩm cao Ngồi ra, tơm thẻ chân trắng cung cấp thêm acid amin thiết yếu cho thể Trong đó, Glycine, alanine, serine threonine có vị cịn arginine, leucine, valine, methionine, phenylalanine, histidine isoleucine cho vị đắng (Sikorski cộng sự, 1990) Hàm lượng số khống có tôm thẻ chân trắng sau (Benjakul, S cộng sự, 2007): Fe(12.2± 0,42), Cu(4,07±0,16), Mn(0,48±0,00), Ni( 0,36± 0,01), Zn(14,7±0,56), Ca(247±4,99), Mg( 361±8,15) Dựa hàm lượng trên, người ta thấy Magie khoáng chất chiếm ưu Canxi sắt tìm thấy mức cao Canxi cần thiết cho cấu trúc xương, đông máu, co cơ, truyền thần kinh, thẩm thấu cofactor cho trình xử lý enzyme (Lovell, 1989) Các ion kim loại chuyển tiếp, đặc biệt Cu Fe, biết đến chất xúc tác cho q trình oxy hóa (Thanonkaew cộng sự,2006) Cu2+ tìm thấy hemocyanin, sắc tố máu động vật giáp xác (Decker & Tuczek, 11 104 105 106 107 108 109 Phụ lục 6: Đánh giá hình thành melanosis Mẫu M-ME 0,1% M-ME 0,5% M-ME 1% Đối chứng Thời gian(Ngày) 128,088 119,863 103,499 98,513 90,521 123,782 119,523 105,805 96,908 93,183 119,317 118,734 99,328 95,592 86,278 121,85 114,233 104,176 93,437 84,903 121,102 112,836 100,071 91,157 80,972 119,284 109,375 98,674 90,067 81,196 128.9 105.559 98.756 84.205 73.382 119.505 106.178 97.41 88.128 75.374 Phụ lục 7:Xác định khả ức chế q trình oxy hóa lipid(Tbars) Giá trị đo quang mẫu với lần lặp STT Mẫu Thời gian bảo quản (Ngày) Đối chứng M-ME 0.1% M-ME 0.5% M-ME 1% 0,063 0,115 0,087 0,039 0,064 0,065 0,114 0,089 0,045 0,065 0,064 0,114 0,1 0,036 0,068 0,034 0,062 0,037 0,02 0,037 0,035 0,061 0,038 0,019 0,039 0,036 0,059 0,037 0,022 0,038 0,044 0,066 0,042 0,033 0,043 0,046 0,066 0,041 0,032 0,043 0,044 0,065 0,042 0,031 0,039 0,04 0,07 0,054 0,037 0,047 0,042 0,071 0,055 0,039 0,049 0,042 0,071 0,054 0,039 0,05 MDA (μg/mL) 110 Kết đo mật độ quang MDA lặp lại lần Nồng độ (μg/mL) MDA 0,111 0,311 0,512 0,718 0,111 0,343 0,502 0,706 0,105 0,323 0,510 0,711 Đường chuẩn MDA 0.8 y = 0.0995x - 0.084 R² = 0.9978 0.7 0.6 Abs 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ (μg/mL) 111 Phụ lục 8:Xác định thay đổi pH q trình bảo quản tơm Giá trị đo pH với lần lặp STT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Đối chứng M-ME 0.1% M-ME 0.5% ME 1% 6,78 6,79 6,79 6,78 6,79 6,79 6,79 6,79 6,78 6,78 6,78 6,77 6,80 6,81 6,92 6,94 6,80 683 6,93 6,93 6,82 6,84 6,89 6,95 6,98 6,87 7,03 7,10 7,01 6,88 7,04 7,09 7,00 6,89 7,01 7,08 7,21 6,95 7,14 7,18 7,26 6,95 7,15 7,18 7,16 6,95 7,14 7,17 7,31 7,13 7,22 7,31 7,36 7,13 7,20 7,30 7,39 7,13 7,22 7,29 Phụ lục 9: Kiểm nghiệm tiêu vi sinh TVB-N Dưới phiếu kết nghiệm tiêu vi sinh số bazo nitơ bay (TVB-N) ngày bảo quản tôm Được phân tích dựa ngày 0(23/7/2020); ngày 4(27/7/2020) ngày 8(31/7/2020) trình bày phiếu 112 113 114 115 116 117 118 ... trình bảo quản, hoạt tính sinh học khả ngăn chặn biến đổi đốm đen sau ngày bảo quản Mục tiêu nghiên cứu Trong nghiên cứu ? ?Khả ức chế enzyme tyrosinase cao trích hạt me ứng dụng bảo quản tôm thẻ... 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, USA) - L −3,4 dihydroxylphenylalanine (L- DOPA) (Sigma-Aldrich, USA) 28 - Malondialdehyde (MDA) (Eagle Biosciences, USA) 2.1.3 Thiết bị - Bể điều nhiệt (Memmert,... Quốc) - Ethanol 96% 99.5% (Chemsol, Việt Nam) - Methanol 99.5% (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Sodium metabisulfite (SMS) (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (FC) (Merck,