ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG NỌC THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU BIURE VÀ ĐO pH CỦA NỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp đại học thực phòng Hương liệu hoạt chất sinh học - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng thời gian từ 08/2010 đến 12/2010 hướng dẫn TSKH Hoàng Ngọc Anh Th.S Võ Đỗ Minh Hồng Em xin gởi lịng biết ơn sâu sắc tới TSKH Hoàng Ngọc Anh Th.S Võ Đỗ Minh Hoàng trực tiếp hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Nhờ quan tâm, giúp đỡ, lịng nhiệt tình tận tình hướng dẫn thầy giúp em hồn thành tốt luận văn Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, chị Phạm Nguyễn Đông Yên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian làm đề tài Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng Viện Sinh học Nhiệt đới Xin ghi nhớ công ơn quý thầy cô Khoa Khoa học Ứng dụng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian em học trường Cuối xin cảm ơn bạn làm đề tài Viện giúp đỡ, động viên để thực tốt đề tài có khoảng thời gian đáng nhớ làm việc với Một lần em xin chân thành cảm ơn kính chúc thầy mơn, chúc bạn vui khỏe, thành công công việc sống TP Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 01 năm 2011 SV Trần Thị Ngọc Sương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BÒ CẠP 1.1.1 Phân bố địa lý 1.1.2 Đặc tính sinh học 1.1.3 Một số đặc điểm biến đổi hình thái họ bị cạp 1.1.4 Đời sống thói quen 1.1.5 Sinh sản phát triển 1.1.6 Nọc độc bò cạp 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NỌC BÒ CẠP TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.2.1 Những nghiên cứu ứng dụng nọc bò cạp giới 1.2.1.1 Cấu trúc toxin 1.2.1.2 Ứng dụng từ nọc bò cạp 1.2.2 Những nghiên cứu ứng dụng nọc bò cạp Việt Nam 10 1.2.2.1 Những nghiên cứu nọc bò cạp 10 1.2.2.2 Ứng dụng bò cạp Việt Nam 10 1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 10 1.3.1 Các phương pháp định lượng protein hòa tan 10 1.3.1.1 Định lượng protein theo phương pháp Biure .10 1.3.1.2 Định lượng protein theo phương pháp Lowry 11 1.3.1.3 Định lượng protein theo phương pháp Bradfort 11 1.3.2 Sắc ký lọc gel phân tích thành phần protein .12 1.3.2.1 Giới thiệu sắc ký lọc gel 12 1.3.2.2 Một số loại gel thường sử dụng 12 1.3.2.3 Nguyên lí phương pháp sắc ký lọc gel 15 1.3.2.4 Quá trình dựng cột gel 16 1.3.2.5 Các ứng dụng sắc ký gel .18 1.3.3 Đông khô 18 1.3.4 Xác định khối lượng phân tử protein phương pháp điện di 19 1.3.4.1 Giới thiệu 19 1.3.4.2 Nguyên tắc điện di 19 1.3.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên vận tốc điện di 20 1.3.4.4 Hiện hình gel 22 1.3.4.5 Điện di protein gel SDS polyacrylamid .23 1.3.4.6 Ứng dụng điện di phân tích protein 25 1.3.5 Chứng co giật, chất chống gây co giật 25 1.3.5.1 Giới thiệu 25 1.3.5.2 Chất chống gây co giật 26 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 2.1 NUÔI BÒ CẠP 28 2.2 THU NỌC VÀ BẢO QUẢN NỌC 29 2.2.1 Dụng cụ 29 2.2.2 Phương pháp tiến hành .29 2.3 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG NỌC THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU BIURE VÀ ĐO pH CỦA NỌC 30 2.3.1 Pha thuốc thử Biure 30 2.3.2 Lập đồ thị đường chuẩn .31 2.3.3 Chuẩn bị mẫu 32 2.3.4 Đo pH nọc 32 2.4 SẮC KÍ LỌC GEL PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA NỌC BỊ CẠP 32 2.4.1 Dụng cụ 32 2.4.2 Hóa chất sử dụng 32 2.4.3 Quy trình lọc gel nọc bò cạp 33 2.4.3.1 Rửa cột 33 2.4.3.2 Chuẩn bị đệm để chạy cột 33 2.4.3.3 Chuẩn bị gel để chạy cột .34 2.4.3.4 Tiến hành nhồi cột 34 2.4.3.5 Chuẩn bị mẫu để chạy cột 34 2.4.3.6 Tiến hành chạy mẫu 35 2.4.3.7 Thu đông khô mẫu 35 2.4.4 Thu hồi tái sử dụng gel Sephadex 36 2.5 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC THU ĐƯỢC TRÊN CHUỘT 37 2.6 ĐIỆN DI PROTEIN TRÊN GEL SDS- POLYACRYLAMIDE 37 2.6.1 Dụng cụ 37 2.6.2 Hóa chất sử dụng 38 2.6.3 Phương pháp tiến hành .39 2.6.3.1 Chuẩn bị pha gel 39 2.6.3.2 Đổ gel 40 2.6.3.3 Chạy điện di 41 2.6.3.4 Nhuộm gel 41 2.7 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT GÂY BỞI STRYCHNIN SULFAT CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BÒ CẠP 41 2.7.1 Động vật thử nghiệm 42 2.7.2 Liều thử phân đoạn nọc bò cạp 42 2.7.3 Gây động kinh Strychnin sulfat 42 2.7.4 Chuẩn bị lượng mẫu tiêm 43 2.7.5 Phân tích thống kê 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 3.1 KẾT QUẢ CỦA VIỆC NI BỊ CẠP TRONG THÁNG 46 3.1.1 Lượng dế cần cho bị cạp ăn thời gian ni 46 3.1.2 Thời gian bị cạp thích nghi với điều kiện chế độ nuôi 47 3.1.3 Trọng lượng trung bình bị cạp 47 3.2 THU NỌC 48 3.2.1 Tính chất nọc thu 48 3.2.2 Lượng nọc thu thời gian nuôi 48 3.3 LƯỢNG PROTEIN CÓ TRONG NỌC VÀ pH CỦA NỌC .49 3.3.1 Lượng protein có nọc 49 3.3.2 pH nọc 51 3.4 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỌC GEL TRÊN GEL SEPHADEX G-50 VÀ ĐÔNG KHÔ .51 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC THU ĐƯỢC TRÊN CHUỘT 53 3.6 KẾT QUẢ CHẠY ĐIỆN DI TRÊN GEL SDS- POLYACRYLAMIDE 55 3.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT GÂY BỞI STRYCHNIN SULFAT .57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Bị cạp đen Heterometrus laoticus Hình 1.2: Bò cạp mang lưng Hình 1.3: Cấu trúc toxin ngắn nọc bò cạp Hình 1.4: Cấu trúc toxin dài nọc bò cạp Hình 1.5: Tách phân tử sắc ký lọc gel 15 Hình 1.6: Bộ chạy điện di 20 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học gel polyacrylamide 23 Hình 1.8: Cấu trúc hóa học SDS 24 Hình 2.1: Thau ni bị cạp .28 Hình 2.2: Thu nọc bị cạp phương pháp kích điện 30 Hình 2.3: Hệ thống chạy sắc ký lọc gel tinh protein .33 Hình 2.4: Máy đơng khơ 36 Hình 2.5: Hệ thống chạy điện di .38 Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn protein 50 Hình 3.2: Kết sắc ký nọc bò cạp sau qua lọc gel 51 Hình 3.3: Kết chạy điện di phân đoạn nọc gel SDS- polyacrylamide 55 Hình 3.4: Thời gian chuột khởi phát co giật lơ dùng nọc bị cạp so với lô diazepam lô chứng (giây) 57 Hình 3.5: Thời điểm chuột tử vong lơ dùng nọc bị cạp so với lô chứng (giây) 58 Hình 3.6: Thời gian chuột co giật lơ dùng nọc bị cạp so với lơ diazepam lô chứng (giây) 58 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số loại gel Sephadex thương mại 13 Bảng 1.2: Thời gian cần thiết để làm trương nở gel Sephadex 13 Bảng 1.3: Các loại gel polyacrylamide Bio- gel .14 Bảng 1.4: Một số thuốc thử thông dụng để hình gel 22 Bảng 2.1: Dung dịch protein chuẩn 31 Bảng 2.2: Thể tích dung dịch chuẩn protein làm việc thuốc thử 31 Bảng 2.3: Thành phần gel 40 Bảng 2.4: Liều tính theo hàm lượng phân đoạn nọc thô để khảo sát 42 Bảng 3.1: Kết việc ni bị cạp tháng .46 Bảng 3.2: Lượng nọc thu 49 Bảng 3.3: Kết đo mật độ quang mẫu chuẩn 50 Bảng 3.4: Đo pH nọc bò cạp Heterometrus laoticus 51 Bảng 3.5: Lượng nọc phân đoạn thu tỷ lệ (%) chúng 52 Bảng 3.6: Kết đo UV nồng độ thực tế phân đoạn nọc bò cạp .53 Bảng 3.7: Kết thử độc tính chuột phân đoạn nọc 54 Bảng 3.8: Tác dụng chống co giật gây strychnin sulfat phân đoạn 1, nọc bò cạp 57 Luận văn tốt nghiệp Đại học Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng cỏ, động vật từ tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh cho người có từ lâu đời phổ biến y học phương Đơng Hơn 1000 năm nay, bị cạp sử dụng rộng rãi vị thuốc quý thuốc cổ truyền nhiều nước Trung Quốc, Việt Nam, Triều Tiên….Theo kinh nghiệm dân gian, bị cạp thường dùng ngun (tồn yết), phần đuôi (yết vĩ) để trị động kinh trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị… dạng thuốc bột làm viên uống [18,20] Tuy nhiên, thành phần có tác dụng nọc bị cạp chưa nghiên cứu nhiều Việt Nam Trong vòng 40 năm trở lại đây, nọc bò cạp thu hút quan tâm nhà khoa học để tìm hiểu thành phần, tính chất lý hóa, tác dụng dược lý độc tính chúng Nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố tác dụng ứng dụng nọc bò cạp y dược như: kaliotoxin, chất có tác động ức chế kênh Kali có nọc nhiều lồi bị cạp cho thấy có tác dụng điều trị bệnh thần kinh Ashmer, Pakingson [2]; chlorotoxin từ nọc bị cạp vàng Israel có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư não [2]… Với mục tiêu tìm kiếm nguồn ngun liệu mới, chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên có tác động trị liệu tốt, nên tiến hành đề tài tốt nghiệp này: “Ni khảo sát tính chất nọc bò cạp Heterometrus laoticus” thu mua vùng An Giang Nhiệm vụ đề tài là: khảo sát quy trình ni bị cạp, thu nọc làm nguyên liệu; khảo sát thành phần protein nọc bò cạp phương pháp lọc gel xác định khối lượng phân tử phân đoạn tách phương pháp điện di; sau khảo sát tác động chống co giật gây strychnin sulfat phân đoạn nọc bị cạp Từ đó, làm sở cho nghiên cứu tác dụng khác điều chế thành dạng chế phẩm để việc ứng dụng nọc bò cạp rộng rãi SVTH: Trần Thị Ngọc Sương Luận văn tốt nghiệp Đại học Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Trần Thị Ngọc Sương Luận văn tốt nghiệp Đại học Tổng quan tài liệu 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỊ CẠP: Bị cạp động vật cổ trái đất với 450 triệu năm tiến hố Chúng gồm khoảng 1500 lồi khác nhau, hình thái chúng khơng thay đổi theo thời gian tiến hố [3,4] Bị cạp thuộc lớp Arachnida (lớp Nhện), Scorpionida Bò cạp nguy hiểm với người thuộc họ Buthidae Họ gồm 500 lồi khác nhau, số giống Androctonus, Leiurus, Buthus, Buthotus Heterometrus phân bố chủ yếu châu Á, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ Giống Parabuthus phân bố Nam Phi Giống Centruroides phân bố Trung Mỹ, Mexico, giống Tityus phân bố Nam Mỹ, phần lớn nước Brazil, Venezuela, Colombia Argentina [4] 1.1.1 Phân bố địa lý: Bò cạp gặp miền địa lý giới, thường xuất vùng ôn đới nhiệt đới, khoảng 50 độ Nam Bắc bán cầu Đặc biệt có nhiều nước nhiệt đới nóng Châu Phi (Bắc Phi, Nam Phi), Châu Mỹ (Mexico, Brazil, Colombia, Argentina, Venezuela), Châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á, Trung Đông), Châu Úc Chúng sống rừng, sa mạc, hang vài lồi cịn tìm thấy tảng đá núi có độ cao 5000 m.[1] Ở Việt Nam bị cạp phân bố khắp nơi nước từ đồng đến miền núi khu rừng ẩm ướt hải đảo Đã phát có hai họ, là: Buthidae (có ba lồi) Scorpionidae (có năm lồi), họ có lồi chưa xác định tên khoa học Chúng phân bố sau:[15] Họ Buthidae: • Lychas mucronatus Fabricius: phân bố tỉnh miền Trung miền Nam, phát triển mạnh số lượng cá thể Đồng Phú (Bình Phước) • Isometrus basilicus Karch: phân bố tỉnh Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định, Khánh Hồ (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú) • Isometrus sp: phân bố Nghệ An (Vinh) Họ Scorpionidae: • Heterometrus spinifer spinifer: phân bố Bình Phước (Bù Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú) SVTH: Trần Thị Ngọc Sương Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận Bảng 3.2: Lượng nọc thu SLượng Lần Thời gian bò cạp thu thu nọc nọc Slượng bị (con) cạp có nọc (con) SLượng Lượng bị cạp nọc thơ khơng có thu nọc (con) (mg) Lượng nọc thơ trung bình (mg/con) Mới mua 434 327 107 703.5 2.15 Sau tuần 337 242 95 403.0 1.67 Sau tuần 316 261 55 541.5 2.07 Sau tuần 292 230 62 431.2 1.87 Sau tuần 225 191 34 334.2 1.75 Sau tuần 188 160 28 277.9 1.74 Sau 11 tuần 176 130 32 155.9 1.20 Sau 13 tuần 173 91 82 89.4 0.98 Sau 15 tuần 163 114 49 168.7 1.48 Sau tháng ni lấy nọc, chúng tơi có nhận xét sau: ƒ Lượng nọc lần lấy sau giảm so với lần lấy Như vậy, bò cạp sống tự nhiên lượng nọc tiết nhiều so với bị cạp sau ni phịng thí nghiệm Có thể chế độ sống, mơi trường sống ƒ Sau tháng nuôi lấy nọc (lần lấy nọc thứ 7) đốt lấy nọc bị cạp bị tạo sẹo nên khơng cịn nhạy cảm tốt với que kích thích lấy nọc nữa, lượng nọc thu giảm số cho nọc giảm cách đáng kể 3.3 LƯỢNG PROTEIN CÓ TRONG NỌC VÀ pH CỦA NỌC: 3.3.1 Lượng protein có nọc: Sau đem mẫu chuẩn mẫu đo mật độ quang bước sóng 540 nm ta thu kết sau: SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 49 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận Bảng 3.3: Kết đo mật độ quang mẫu chuẩn Ống nghiệm số Nồng độ mg/ml 0,4 0,8 1.2 1,6 Mật độ quang(y) 0.101 0.194 0.286 0.379 0.466 Mẫu 0.305 Từ kết đo bảng ta xây dựng đồ thị đường chuẩn protein có dạng đường thẳng (hình 3.1): y = 0.232x + 0.005 R² = 0.999 0.5 Mật độ quang 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 2.2 Nồng độ mg/ml Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn protein Từ đường chuẩn ta xác định phương trình hồi quy sau: Y = 0.232 X + 0.005 Từ ta tính nồng độ protein mẫu đem đo : X = (Y - 0.005) : 0.232 = 1.293 mg/ml Vậy hàm lượng protein tan nọc bò cạp là: X x x 1.5 = 9.698 mg → Phần trăm protein tan nước 9.698/15 x 100 = 64.65 % Như vậy, phương pháp Biure xác định hàm lượng protein có nọc bị cạp Heterometrus laoticus ni phịng thí nghiệm 64.65 % SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 50 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận 3.3.2 pH nọc: Bảng 3.4 : Độ pH nọc bò cạp Heterometrus laoticus TT pH Đo lần 6.46 Đo lần 6.45 Đo lần 6.45 pH trung bình nọc 6.45 pH nọc đo có giá trị: pH = 6.45 Vậy nọc bị cạp có tính axit yếu 3.4 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỌC GEL TRÊN GEL SEPHADEX G-50 VÀ ĐƠNG KHƠ: Nọc thơ sau thu được, bảo quản -25oC Để phân tách nhóm chất nọc thơ, chúng tơi tiến hành pha 300g nọc ml đệm acetat ammonium, lấy phần protein hòa tan nước tiến hành chạy sắc ký lọc gel, cột chạy ml mẫu Chúng tơi tiến hành chạy chín lần với điều kiện cho kết sau: Hình 3.2: Kết sắc ký nọc bò cạp sau qua lọc gel Sử dụng cột với gel Sephadex G-50 để phân tích nọc bị cạp Heterometrus laoticus cho thấy nọc thô tách làm phân đoạn với khối lượng phân tử khác SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 51 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận Quá trình sắc ký tiến hành chín lần (với lượng nọc thơ dùng 2700 mg) để thu lượng protein cần dùng cho phân tích Sau chạy xong cột, dồn ống nghiệm phân đoạn đem đông khô Nọc sau đông khô có dạng rắn xốp Kết đơng khơ phân đoạn trình bày bảng đây: Bảng 3.5: Lượng nọc phân đoạn thu tỷ lệ (%) chúng Lượng nọc thu Tỉ lệ sau đông khô (mg) phân đoạn (%) 28 x = 252 163.4 8.4 24 - 33 40 x = 360 214.1 11.1 34 - 40 28 x = 252 226.6 11.7 41 - 47 28 x = 252 866.7 44.8 48 - 59 48 x = 432 465.1 24.0 1548 1935.9 100 Phân Thứ tự ống Thể tích (ml) 17 - 23 đoạn Tổng cộng Lượng nọc sau chạy sắc ký đem đông khô thu 1935.9 mg, mà ban đầu lượng nọc khô dùng để chạy cho cột 2700 mg Như vậy, tỷ lệ nọc thu lại 64.5% so với lượng ban đầu Nhận xét: Qua kết sắc ký lọc gel thấy rằng: từ nọc thô thu phân đoạn tách ra, phân đoạn (44.8%) chiếm tỷ lệ cao nhất, phân đoạn (24.0%) thấp phân đoạn (8.4%) Dùng phân đoạn thu sau đông khô tiêm vào chuột để khảo sát độc tính phân đoạn SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 52 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC THU ĐƯỢC TRÊN CHUỘT: Sau q trình đơng khơ, thu mẫu có hai phân đoạn bị ẩm nên cân khơng xác Vì vậy, để xác đảm bảo lượng protein tiêm cho chuột 0.2 mg/ chuột, tiến hành pha 1mg nọc phân đoạn 1, 2, 2mg phân đoạn 4, vào 0.5 ml nước cất, hút 0.2 ml đem đo UV bước sóng 280 nm thu kết sau: Bảng 3.6: Kết đo UV nồng độ thực tế phân đoạn nọc bò cạp Phân đoạn Hàm lượng (mg/ml) Nồng độ thực tế (mg/ml) 0.13230 2.646 0.01394 0.279 0.064829 1.297 0.039738 0.795 0.022643 0.453 Lượng protein tiêm cho chuột 0.3 ml lại phân đoạn (lượng protein tiêm đảm bảo 0.2 mg/ chuột), thể tích tiờm vo chut l 300àl: ã Phõn on (nng độ thực tế 2.646 mg/ml): hút 76μl, thêm 224μl nước cất • Phân đoạn (nồng độ thực tế 0.279 mg/ml): 300µl cịn lại có hàm lượng 84µg Cân thêm mg nọc thơ hịa tan vào thu hàm lượng 363µg Vậy ta hút 166µl thêm vào 134àl nc ct ã Phõn on (nng thc t 1.297 mg/ml): hỳt 155àl, thờm 145àl nc ct ã Phân đoạn (nồng độ thực tế 0.795 mg/ml): hút 252àl, thờm 48àl nc ct ã Phõn on (nng độ thực tế 0.453 mg/ml): 300µl cịn lại có hàm lượng 136µg Cân thêm mg nọc thơ hịa tan vào thu hàm lượng 363µg Vậy ta hút 166µl thêm vào 134µl nước cất Độc tính phân đoạn tách thử lên chuột nhắt trắng DDY hai giống (có khối lượng 17-21 g) cách tiêm phúc mô, ghi nhận biểu chuột sau: SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 53 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận Bảng 3.7: Kết thử độc tính chuột phân đoạn nọc Phân Các biểu chuột sau tiêm phân đoạn đoạn tách Nhận xét Run, nằm im, gãi mõm, sau bình thường Khơng độc Gãi mõm, run, xù lơng, thở mạnh, sau bình thường Khơng độc Đứng yên, run, xù lông, co người, co giật phục hồi sau 12 Hoạt động mạnh, run, xù lông, gãi mõm, co người, chảy nước bọt, thở mạnh, liệt chi sau, co giật mạnh chết sau 138 phút Độc nhẹ Độc gây chết Run, nằm im, sau bình thường Khơng độc Nước cất Run, nằm im, sau bình thường Khơng độc Kết khảo sát cho thấy có hai phân đoạn hai phân đoạn độc, có phân đoạn phân đoạn độc gây chết, cịn phân đoạn có biểu độc kéo dài sau phục hồi Phân đoạn sau tiêm vào chuột, chuột có số biểu bị độc sau: ban đầu chuột hoạt động mạnh, run, loạn xạ, co giật; sau phút bị xù lông, gãi mõm, bị lạnh kéo dài; sau 17 phút người co lại, chi sau bị yếu, nhảy mạnh; sau 28 phút tiết nhiều nước bọt, đứng yên, giật mạnh; sau chuột giật liên tục, giãy giụa, yếu dần chết sau 18 phút (2 18 phút sau tiêm) Còn phân đoạn có biểu độc như: ban đầu chuột đứng yên, run, xù lông; sau 24 phút người co lại, thở mạnh; sau 48 phút chuột co giật mạnh; sau chuột trở nên khỏe phục hồi sau 12 Cịn phân đoạn khác khơng độc, chuột bị sốc tiêm sau hoạt động bình thường trở lại giống tiêm nước cất, cụ thể: o Phân đoạn 1: Ban đầu chuột bình thường; sau phút có biểu run (bị lạnh); sau 41 phút chuột nằm im, có tượng gãi mõm, sau bình thường o Phân đoạn 2: Ban đầu hoạt động bình thường; sau có tượng gãi mõm, run; sau 24 phút nằm yên run nhiều; sau 30 phút chuột bị xù lơng; sau bình thường SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 54 Luận văn tốt nghiệp Đại học o Kết bàn luận Phân đoạn 5: Ban đầu chuột hoạt động mạnh, sau bị run, nằm n khơng cử động; sau bình thường o Nước cất: Ban đầu hoạt động bình thường, sau run; sau 13 phút nằm yên run; sau bình thường Vậy có phân đoạn phân đoạn độc Kết làm sở để tiến hành xác định toxin nghiên cứu 3.6 KẾT QUẢ CHẠY ĐIỆN DI TRÊN GEL SDS-POLYACRYLAMIDE: Để khảo sát thành phần protein phân đoạn tách tiến hành điện di Quá trình chạy điện di phân đoạn nọc tách gel SDSpolyacrylamide cho kết sau: kDa M1 pđ pđ pđ pđ pđ 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình 3.3: Kết chạy điện di phân đoạn nọc gel SDS- polyacrylamide Trong đó: M - Marker (thang protein chuẩn); pđ 1- phân đoạn 1; pđ 2- phân đoạn 2; pđ 3- phân đoạn 3; pđ 4- phân đoạn 4; pđ 5- phân đoạn Kết điện di cho thấy phân đoạn nọc thu chứa protein sau: • Phân đoạn 1: chứa protein chủ yếu nằm vùng có khối lượng 25-100 kDa, ngồi cịn có protein có khối lượng nằm khoảng 11-17 kDa • Phân đoạn 2: chứa protein nằm vùng có khối lượng phân tử từ 11-30 kDa protein nằm khoảng 40-60 kDa SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 55 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận • Phân đoạn 3: chứa protein có khối lượng phân tử nằm vùng 13–17 kDa 3–11 kDa, phospholipase (13-14 kDa) neurotoxin (3-8 kDa) nọc bò cạp [13,14] Do đó, độc tính phân đoạn có lẽ phospholipase neurotoxin gây • Phân đoạn 4: chứa protein với khối lượng phân tử nằm vùng 3-10 kDa, giống với khối lượng phân tử neurotoxin nọc bò cạp (3–8 kDa) độc tính phân đoạn neurotoxin gây ra, ngồi cịn có protein nằm khoảng 65 kDa • Phân đoạn 5: chứa protein có khối lượng phân tử nhỏ nằm khoảng kDa kDa khơng có độc tố Nhận xét: - Có phân tách protein từ cao đến thấp theo phân đoạn từ 1-5 Phân đoạn chứa nhiều loại peptide nhỏ - Nếu phân đoạn chứa mg protein phân đoạn khơng đạt lượng nồng độ này, thể SDS- PAGE đường chạy có chứa protein - Các loại peptide chưa phân tách hoàn toàn phân đoạn Tài liệu neurotoxin nọc bò cạp cho biết khối lượng phân tử neurotoxin đóng vai trị quan trọng thị dược tính chúng Các neurotoxin tách từ nọc bị cạp có khối lượng phân tử nằm vùng 3-4 kDa thường ức chế hoạt động kênh K+ (Kali) tế bào thần kinh, neurotoxin ức chế hoạt động kênh Na+ (Natri) có khối lượng phân tử nằm vùng 6-8 kDa [6] Như vậy, neurotoxin nọc bị cạp Heterometrus laoticus có tác dụng ức chế hoạt động kênh K+ kênh Na+ Phương pháp điện di cho biết khối lượng phân tử protein phần đánh giá tinh phân đoạn sau tách từ sắc ký lọc gel Do đó, cần kết hợp điện di với phương pháp thử hoạt tính sinh học khác để định hướng tách thành phần ta cần quan tâm Qua ta thấy thấy việc sử dụng sắc ký lọc gel với gel Sephadex G-50 bước đầu việc tách làm chất có hoạt tính sinh học từ nọc bị cạp SVTH: Trần Thị Ngọc Sương 56 Luận văn tốt nghiệp Đại học Kết bàn luận 3.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT GÂY BỞI STRYCHNIN SULFAT: Thử nghiệm chống co giật gây strychnin sulfat phân đoạn 1, nọc bò cạp Sau tiêm strychnin sulfat vào chuột ghi tác dụng thuốc lên chuột bảng sau: Bảng 3.8: Tác dụng chống co giật gây strychnin sulfat phân đoạn 1,2 nọc bò cạp Thời điểm bắt đầu co giật (giây) Thời điểm tử vong (giây) Thời gian co giật (giây) Tỷ lệ tử vong (%) 363,6 ± 22,9 452,4 ± 26,6 63,86 ± 7,6 100% 623,7 ± 58,0** >1800 109,0 ± 17,24** 0%** 194,9 ± 22,1**## 247,4 ± 28,5** 39,75 ± 7,41**## 100% ## Nọc 2, liều 2.109 mg/kg 190,3 ± 13,7**## 271,6 ± 16,7** 65,29 ± 8,37## 100% ## Nọc 3, liều 2.223 mg/kg 154,44 ± 8,49**## 189,3 ± 11,0** 28,00 ± 3,42**## 100 %## Lô Chứng Diazepam mg/kg Nọc 1, liều 1.596 mg/kg ** p