kl huynh van nam 912049s

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG Nghiên cứu hệ vi khuẩn Lactic tạp nhiễm dịch tương đâu nành Giảng viên hướng dẫn: TS LÊ CHIẾN PHƯƠNG Sinh viên thực hiện: HUỲNH VÂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 -1- Lời cảm ơn Em chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô trường đại học Tôn Đức Thắng dạy cho em biết kiến thức bản, để em có tự tin bước vào thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Chiến Phương nhận dìu dắt, hướng dẫn cho em biết cách thức nghiên cứu đề tài, biết cách vận dụng kiến thức vào thực tế để làm hành trang bước vào tương lai Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô ban quản lý Viện Sinh Học Nhiệt Đới tạo điều kiện cho em thực đề tài Bên cạnh em xin chân thành cảm ơn anh Lê Văn Dân, chị Thanh Trang chị Như Hiếu giúp đỡ em nhiều trinh thực luận văn Sinh viên thực Huỳnh Vân Nam -2- Mục lục Trạng tựa Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng vi Danh mục sơ đồ, đồ thị vii Danh mục hình ảnh vii Chương 1:Mở đầu 1.1-Đặt vấn đề 1.2- Mục đích 1.3- Ý nghĩa Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1- Giới thiệu đậu nành 2.1.1- Đặc điểm phân loại thực vật 2.1.1.1- Đặc điểm hình thái 2.1.1.2- Sự sinh dưỡng, sinh trưởng 2.1.2- Thành phần dinh dưỡng 2.1.2.1- Thành phần hoá học hạt đậu nành 2.1.2.2- Thành phần acid amin protein 2.1.2.3- Chất sinh tố chất khoáng 2.1.2.4 Chất béo chất cholesteron 2.2- Giá trị đậu nành 2.2.1- Các chất chống ung thư đậu nành 10 2.1.3.1- Phytate 10 2.1.3.2- Phytostyrol 11 2.1.3.3- Saponins 11 2.1.3.4- Lecithin 11 -3- 2.2.2 - Đậu nành khả giảm hiệu ứng nhà kính 12 2.2.3 - Một số sản phẩm đậu nành 12 2.2.4- Ứng dụng đậu nành 18 2.2.4.1- Đậu tương tạo chất cách ly 19 2.2.4.2- Đậu tương tạo phân tử nano 19 2.3- Dịch tương đậu nành 20 2.3.1- Quy trình kỹ thuật thu nhận dịch tương đậu nành 20 2.3.1.1- Phương pháp xay ướt 20 2.3.1.2- Phương pháp xay khô 21 2.3.2- Thành phần dinh dưỡng dịch tương đậu nành 22 2.3.2- Thành phần dinh dưỡng dịch tương đậu nành 22 2.3.3- Hiện trạng dịch tương đậu nành 22 2.2.3.1- Ở nước 22 2.3.3.2- Ở Việt Nam 22 2.4- Vi khuẩn lên men lactic 22 2.4.1- Tổng quan vi khuẩn 22 2.4.1.1- Đặc điểm chung 22 2.4.1.2- Phân loại 23 2.4.1.3- Hình thái 24 2.4.1.4- Đặc điểm sinh lý, sinh hố 24 2.4.2- Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn 25 2.4.3- Vài đại diện vi khuẩn 2.4.3.1- Giống Lactobacillus 2.4.4- Quá trình lên men 26 26 27 2.4.4.1- Lên men đồng hình 27 2.4.4.2- Lên men dị hình 27 2.4.5- Sự sinh tổng hợp 28 2.4.5.1- Acid lactic 28 -4- 2.4.5.2- Bacteriocin 29 2.4.6- Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic 30 2.4.6.1- ứng dụng vi khuẩn lên men lactic thực phẩm 30 2.4.6.1.1- ứng dụng chế biến sữa 30 2.4.6.1.2- ứng dụng muối chua rau 31 2.4.6.1.3- ứng dụng sản xuất acid lactic 31 2.4.6.2- Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic y hoc 32 2.4.7- Tác hại vi khuẩn Chương :Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.1- Nguồn vật liệu 32 33 33 3.1.1- Nơi nghiên cứu 33 3.1.2- Nguồn nguyên liệu 33 3.1.3- Chủng vi khuẩn 33 3.1.4- Môi trường dùng nghiên cứu 33 3.1.5- Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 35 3.2- Phương pháp nghiên cứu 36 3.2.1- Phân tích thành phần dinh dưỡng dịch tương đậu nành 36 3.2.1.1- Phương pháp xác định nitơ tổng 36 3.2.1.2- Phương pháp xác định nitơ formol 37 3.2.1.3- Phương pháp xác định nitơ ammoniac 38 3.2.1.4- Phương pháp xác định đường tổng 39 3.2.1.5- Phương pháp xác định đường khử 41 3.2.2- Phương pháp nghiên cứu hệ vi khuẩn lacti c42 3.2.2.1- Phương pháp phân lập vi khẩn lên men lactic 42 3.2.2.2- Phương pháp nhuộm gram 42 3.2.2.3- Phương pháp thử catalase 43 3.2.2.4- Phương pháp đếm khuẩn lạc 43 3.2.2.5- Phương pháp định tính acid lactic 44 -5- 3.2.2.6- Phương pháp định lương acid lactic 44 3.2.2.7- Phương pháp kiểm tra khả tổng hợp Bacteriocin 45 Chương 4: Kết thảo luận 47 4.1- Kết phân lập vi khẩn lên men lactic dịch tương đậu nành 47 4.1.1- Kết phân lập vi khuẩn từ dịch tương 47 4.1.2- Kết nhuộm gram 50 4.2- Kết đếm khuẩn lạc 51 4.3- Kết địng tính acid lactic 52 4.4- Kết định lượng acid lactic 52 4.5- Kết xác định bacteriocin 56 4.6- Kết xác định hàm lượng Nito tổng 57 4.7- Kết xác định hàm lượng nito formol 57 4.8- Kết xác định hàm lượng nito amoniac 58 4.9- Kết xác định hàm lượng đường tổng 58 4.10- Kết xác định hàm lượng đường khử 58 Chương 5: Kết luận đề nghị 61 5.1- Kết luận 61 5.2- Đề nghị 61 -6- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.Thành Phần Dinh Dưỡng Bảng Bảng Thành Phần Dinh Dưỡng Soy Protein Isolates Textured Soy Proteins 13 Bảng Thành Phần Dinh Dưỡng Ðậu Hũ 16 Bảng Thành Phần Dinh Dưỡng Sữa Ðậu Nành, Sữa Bò Sữa Mẹ 18 Bảng Bảng đặc điểm hình thái loại 48 Bảng Kết đếm khuẩn lạc 51 Bảng Kết định lượng acid latic 53 Bảng Kết khảo sát lượng acid lactic pH trình lên men lactic 53 Bảng Kết khảo sát khả sinh acid lactic chủng 56 Bảng 10 Kết khảo sát khả sinh acid lactic 57 Bảng 11 Kết xác định hàm lượng Nito tổng 57 Bảng 12 xác định hàm lượng nito formol 57 Bảng 13 Kết xác định hàm lượng nito amoniac 58 Bảng 14 Kết xác định hàm lượng đường tổng 58 Bảng 15 Kết xác định hàm lượng đường khử 58 -7- DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cây, trái, hạt đậu nành Hình Sản phẩm chao 15 Hình Đậu hũ 16 Hình Nước chấm làm từ dậu nành 17 Hình Hình vi thể vi khuẩn Lactic 24 Hình Hình khuẩn lạc vi khuẩn lactic 47 Hình Hình vi thể vi khuẩn lactic 48 Hình Hình vi khuẩn lactic làm mơi trường Nitơ 49 Hình Hình vi khuẩn lactic làm màu metyl đỏ trung tính 49 Hình10 Khả đơng tụ sữa chủng 50 Hình 11 Kết nhuộm gram 50 Hình 12 Kết thử Catalase 51 Hình 13 Kết định tính acid lactic thuốc thử ufermen 52 Hình 14 Khả sinh tổng hợp Bacteriocin chủng lactic phân lập từ dịch tương 56 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ -8- Sơ đồ Quy trình kỹ thuật thu nhận dịch tương đậu nành phương pháp xay ướt 20 Sơ đồ Quy trình kỹ thuật thu nhận dịch tương đậu nành phương pháp xay khô 21 Sơ đồ Quá trình lên men lactic đồng hình 29 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị Mối tương quan thời gian pH môi trường 54 Đồ thị Mối tương quan thời gian lượng acid lactic sinh 54 Đồ thị Mối tương quan pH lượng acid lactic sinh 55 Đồ thị 4: Đồ thị đường chuẩn để xác định hàm lượng đường tổng 58 Đồ thị 5: Đồ thị đường chuẩn để xác định hàm lượng đường khử 59 -9- Chương 1: Mở đầu 1.1-Đặt vấn đề Đậu tương trồng có từ lâu đời người ứng dụng rộng rãi vào thực phẩm đặc biệt khu vực Đông Nam Á nước phương Đông Các sản phẩm len men từ đậu nành có giá trrị dinh dưỡng cao như: chao, nước chấm lên men, tương, tempơ,….chủ yếu sản phẩm lên men từ nấm mốc từ vi khuẩn Hiện đậu nành coi trồng quan trọng để giải vấn đề thiếu protein dinh dưỡng người Đậu nành đứng đầu protein có đầy đủ thành phần acid amin khơng thay Do giá trị dinh dưỡng cao nhiều người ưa chuộng Đặc biệt vai trò đậu nành có liên quan tới tượng biến đổi khí hậu tồn cầu cịn có tác động đến bệnh thời đại Tuy nhiên, nước ta, thị trường sản phẩm từ đậu nành chưa phát triển mạnh lý do: phần lớn sản phẩm truyền thống, nhiều sản phẩm mặn, thường dùng làm gia vị, nước chấm nên dùng với lượng nhỏ phần Đậu nành có sản phẩm có giá trị công nghiệp để tiêu thụ với lượng lớn Đặc biệt phụ phế phẩm tận dụng làm cho giá thành sản phẩm tăng, lãng phí ngun liệu gây nhiễm mơi trường Về vấn đề dịch tương đậu nành điểm nóng Cụ thể, hầu hết sở sản xuất đậu hũ (đậu phụ) phương pháp thủ cơng quy mơ xí nghiệp, dịch tương (là phần dịch lại sau tách sản phẩm đậu hũ) thường bị lên men lactic cách tự nhiên sau ngày lưu trữ, gọi nước chua hay dịch chua Một phần nhỏ dịch (khoảng 10-15%) dùng để làm chua sữa đậu nành để tạo tủa, phần lớn lại bị thải bỏ Tủa phức chất, - 10 -  Làm mơi trường N2 Hình Hình vi khuẩn lactic làm môi trường Nitơ  Làm màu đỏ metyl trung tính Hình Hình vi khuẩn lactic làm màu metyl đỏ trung tính Quan sát đĩa Petri, ta dễ dàng thấy có vùng thạch bị màu đỏ metyl trung tính - 58 -  Khả đơng tụ sữa đậu nành 3% Hình10 Khả đông tụ sữa chủng L1, L2 Kết hai chủng vi khuẩn lactic L1, L2 phân lập từ dịch tương đậu nành có khả sinh acid lactic lam đơng tụ sữa 4.1.2- Kết nhuộm gram Chủng L1 Chủng L2 Hình 11 Kết nhuộm Gram Cả chủng L1 L2 bắt màu tím thuốc nhuộm tím kết tinh, chứng tỏ chủng Gram dương - 59 -  Kết thử catalase Sau nhỏ H2O2 lên lame cấy sinh khối chủng lactic, quan sát thấy khơng xuất bọt khí Cả âm tính thử catalase + - Staphylococcus aureus Vi khuẩn lactic Hình 12 Kết thử Catalase Trên lame có cấy sinh khối vi khuẩn lactic khơng xuất bọt khí nên kết thử catalase âm tính 4.2- Kết đếm khuẩn lạc Các đĩa nồng độ pha lỗng 10-7 có khuẩn lạc mọc riêng lẻ, ta tiến hành đếm kết Bảng Kết đếm khuẩn lạc Số khuẩn Đĩa Đĩa Đĩa lạc trung U(CFU/ml) bình Độ pha lỗng 10-7 90 86 - 60 - 84 86 602 4.3- Kết địng tính acid lactic A: Mẫu thử với nước cất B: Dịch lên men với chủng L1 C: Dịch lên men với chủng L2 D:Mẫu thử với acid lactic tinh khiết (98%) Hình 13 Kết định tính acid lactic thuốc thử Ufermen Ta thấy chủng L1 L2 làm màu thuốc thử Ufermen, ống B( chủng L1) có màu vàng tươi ống C( chủng L2) có nghĩa lượng acid lactic ống B nhiều ống C 4.4- Kết định lượng acid lactic Dich tương đậu nành từ lúc thu sau cho lên men tự nhiên đem định lựơng - 61 - Bảng Kết định lượng acid lactic Lượng acid lactic(g/l) pH V NaOH chuẩn độ Độ Therner Mẫu thu 5.5 55 49.5 Mẫu sau lên men 3.5 9.5 95 85.5 Dịch tương thu về, chắn có nhiều loại vi sinh vật đó, có vi khuẩn gây thối, suốt trình lên men để dịch tương thời gian dài khơng bị thối Đó lượng acid sinh tiêu diệt ức chế mạnh vi khuẩn lạ Theo tài liệu acid lactic đạt 1.2% trở lên ức chế tồn vi sinh vật gậy thối Bảng Kết khảo sát lượng acid lactic pH trình lên men lactic Thới gian lên men Lượng acid V NaOH Độ chuẩn độ Therner 5.5 55 49.5 24 4.5 5.9 59 53.1 48 6.2 62 55.8 72 3.7 7 63 96 3.5 8.3 83 74.7 120 3.2 9.5 95 85.5 144 9.5 95 95 85.5 (giờ) pH - 62 - lactic(g/l) Lượng acid tăng đến ngày thứ năm dừng lại Tại pH giảm xuống đến mức tối thiều, lượng lactic sinh cực đại Nếu tiếp tục để lên men pH lượng acid lactic khơng thay đổi.Và pH q thấp ức chế ngược lại phát triển vi khuẩn lactic Đồ thị Mối tương quan thời gian pH môi trường Đồ thị tương quan thời gian pH môi trương pH 5.5 4.5 3.5 Ngày Đồ thị Mối tương quan thời gian lượng acid lactic sinh Đồ thị tương quan thơi gian lượng acid sinh g/lít 90 80 70 60 50 Ngày 40 - 63 - Quan sát đồ thị, ta thấy lượng acid tăng mạnh sau lên men ngày thứ 3, thứ năm.Đến ngày thứ lượng acid khơng tăng nữa, pH =3.2 Có giả thuyết đặt để giải thích lượng acid khơng tổng hợp nữa:  pH môi trường thấp ức chế ngược lại vi khuẩn lactic  chất môi trường không đủ cho vi khuẩn lactic phát triển Để kiểm tra vấn đề này, dịch tương lên men tự nhiên sau ngày điều chỉnh pH=7 tiếp tục cho lên men tự nhiên Kết vẩn thấy sinh acid lactic Điều chứng minh chất dinh dưỡng môi trường cạn kiệt nên acid lactic khơng cịn tổng hợp Đồ thị Mối tương quan pH lượng acid lactic sinh Mối tương quan pH lượng acid lactic sinh g/lít 5.5 4.5 3.5 40 50 60 70 80 pH 90 Để so sánh khả tổng hợp acid lactic chủng L1, L2, việc tăng sinh thực môi trường N2 lỏng - 64 - Bảng Kết khảo sát khả sinh acid lactic chủng Thời gian (giờ) Lượng acid lactic tạo thành (mg/ml) Chủng L2 Hỗn hợp chủng 0.09 0.12 Chủng L1 0.10 0.23 0.20 0.30 0.27 0.25 0.50 0.32 0.3 0.70 0.41 0.38 0.81 0.5 0.47 0.92 0.54 0.5 1.00 10 0.6 0.55 1.2 Qua bảng khảo sát ta thấy chủng L1 sinh acid nhiều chủng L2 4.5- Kết xác định bacteriocin Hình 14 Khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng lactic phân lập từ dịch tương Cả chủng có khả sinh bacteriocin ức chế phát triển Staphylococcus aureus - 65 - Bảng 10 Kết khảo sát khả sinh acid lactic Chủng L1 L2 3.2 2.8 Đường kính vịng kháng khuẩn (cm) Qua đường kính vịng phân giải, ta thấy chủng L1 sinh bacteriocin tốt chủng L2 4.6- Kết xác định hàm lượng Nitơ tổng Bảng 11 Kết xác định hàm lượng NTS Mẫu Trước lên men Sau lên men VHCl(ml) Nitơ tổng(%) Nito tồng(g/l) 2.35 0.082 0.82 1.95 0.068 0.68 Hàm lượng đạm bị giảm sau trình lên men chứng tỏ vi khuẩn dụng đạm cho trình trao đổi chất 7- Kết xác định hàm lượng nitơ formol Bảng 12 xác định hàm lượng nitơ formol VNaOH 0.1N định phân lần (ml) VNaOH 0.1N định phân lần (ml) VNaOH 0.1N định phân lần (ml) Trước lên men 0.2 0.15 Sau lên men 0.35 0.3 Mẫu Mẫu thử VNaOH 0.1N trung bình Hàm lượng đạm(g/l) 0.2 0.13 0.18 0.3 0.3167 0.373 0.05 - 66 - 4.8- Kết xác định hàm lượng nito amoniac Bảng 13 Kết xác định hàm lượng nitơ amoniac ` VNaOH NNH3 (g/l) 0.2 0.027 0.25 0.035 Trước lên men Sau lên men Hàm lượng NH3 sau lên men có tăng so với trước lên men (0.035g/l so với 0.027 g/l, tăng 29,6%) Tuy nhiên đánh giá cảm quan dịch tương lên men có mùi chua khơng có mùi thối 4.9- Kết xác định hàm lượng đường tổng Bảng 14 Kết xác định hàm lượng đường tổng OD Đường tổng(g/ml) 0.049 0.135 0.023 0.063 Mẫu Trước lên men Sau lên men 10- Kết xác định hàm lượng đường khử Bảng 15 Kết xác định hàm lượng đường khử OD Đường khử(g/ml) 0.468 0.083 0.135 0.024 Mẫu Trước lên men Sau lên men - 67 - Cả đường tổng đường khử giảm sau trình lên men, chứng tỏ vi khuẩn lactic sử dụng để tăng trưởng sinh tổng hợp acid lactic Đồ thị 4: Đồ thị đường chuẩn để xác định hàm lượng đường tổng - 68 - Đồ thị 5: Đồ thị đường chuẩn để xác định hàm lượng đường khử - 69 - Chương Kết luận đề nghị 5.1- Kết luận  Dịch tương đậu nành chắn tốt cho vi khuẩn lactic chứa thành phần dinh dưỡng đáng kể Nformol (0.18g/l), đường khử (0.083g/l)  Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ dịch tương đậu nành lên men tự nhiên chủng trực khuẩn L1 cầu khuẩn L2  Khảo sát thời gian lên men tự nhiên dịch tương đâu nành kéo dài ngày nghiên cứu số đặc điểm sinh học chúng, sau ngày lượng acid pH môi trường không thay đổi đáng kể Tuy nhiên điều đủ đảm bảo cho dịch tương đậu nành sau lên men lactic bảo quản lâu mà không bị lên men thối  Khảo sát sinh tổng hợp acid lactic chủng, xác định chủng L2 có khả sinh tổng hợp acid lactic nhiều chủng L2  Khảo sát có diện bacteriocin môi trường N2 dịch tương đậu nành chủng 5.2- Đề nghị  Tận dụng lượng lớn dịch tương bị thải sở sản xuất, nguồn nguyên liệu dồi chưa tận dụng  Từ dịch tương lên men sản xuất acid lactic phương pháp chưng cất Và trước chưng cất cần lọc sơ  Nghiên cứu phương pháp tách chiết bacteriocin cách đơn giản đảm bảo sản xuất giá thành giảm  Đề nghị thử khả kháng khuẩn Salomnella, E.coli, Vibrio, Cloctridium chúng kháng khuẩn tốt tất chủng lam chất bảo quan thưc phẩm  Nghiên cứu thêm hệ vi khuẩn lactic dịch tương, chúng hệ vi khuẩn probiotic tốt cho đường ruột người - 70 - Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt: Lê Xuân Phương Vi Sinh Vật công Nghiệp Nhà Xuất Bản xây dựng Hà Nội, 2001 Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng Vi Sinh Tồng Hợp Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, 1978 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc Công nghệ vi sinh tập Nhà xuất trường đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh, 1996 Nguyễn Lân Dũng Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Bỉnh Phước, Phùng Tiến, Phạm Văn Ty Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, 1978 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học tập Nhà xuất đại học trung học chuyên nghiệp, 1998 Lê Văn Việt Mẫn Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa, tập Nhà xuất đại học quốc gia tp.Hồ Chí Minh Ngạc Văn Giậu Chế biến đậu nành lạc thành thức ăn giàu protein Nhà xuất Nông Nghiệp, 1983 Tài liệu tham khảo Internet http://www.angelfire.com/wizard/kimbrought/textbox.htm http://www.britanninca.com http://www.cee.mtu.edu http://www.coproweb.free.fr/index.htm http://www.khoahocphothong.com.vn http://www.amthuc.com http://www.anchay.net http://www.tufosoy/china/production.com http://www.vinamilk.com.vn - 71 - - 72 - ... tốn 2.4. 5- Sự sinh tổng hợp 2.4.5. 1- Acid lactic C6H12O6 Glucose 2NAD+ 2CH3-CHOH-COOH Acid lactic - 37 - 2NADH2 2CH3-CHOH-COOH Acid pyruvic Glucose ATP Glucose- 6- phosphat ADP Fructose- 6- phosphat... 2.4.3. 1- Giống Lactobacillus 2.4. 4- Quá trình lên men 26 26 27 2.4.4. 1- Lên men đồng hình 27 2.4.4. 2- Lên men dị hình 27 2.4. 5- Sự sinh tổng hợp 28 2.4.5. 1- Acid lactic 28 -4 - 2.4.5. 2- Bacteriocin... 3.2.2. 2- Phương pháp nhuộm gram Thuốc nhuộm - Tím kết tinh - Lugol - Safrnin Cách tiến hành - Làm vết bôi cố định đèn cồn - Nhuộm tím kết tinh phút - Rửa nước khơng giây - Nhuộm lại lugol phút - 51